INTRODUZIONE PARTE SPERIMENTALE

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INTRODUZIONE

PARTE

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30 Le Ammine Traccia (TA), come β-feniletilamina (β-PEA), tiramina, tironamina (T0AM), 3-iodotironamina (T1AM), octopamina, triptamina e sinefrina, sono presenti a concentrazioni subnanomolari nel plasma ed in vari tessuti, sia periferici che centrali, dei mammiferi; ma le loro funzioni fisiologiche rimangono ad oggi ancora non ben definite1.

Figura 12.

La recente scoperta di una famiglia di recettori accoppiati a proteina G (GPCR) simili alla rodopsina, definiti come recettori accoppiati ad ammine traccia (TAARs), ha offerto l'opportunità di esplorare i ruoli delle ammine traccia e dei loro recettori sia da un punto di vista fisiologico che patologico7.

La famiglia degli hTAARs (TAARs dell’uomo) è composta da 6 geni e 3 pseudogeni, è localizzata su un singolo cromosoma e presenta una elevata omologia strutturale con i recettori delle ammine biogene. E’ stata inoltre evidenziata la presenza di una sequenza peptidica TAAR-specifica (fingerprint motif) costituita da sette domini transmembranali che risulta essere assente in altri GPCRs. Si ritiene che la famiglia dei TAAR rappresenti probabilmente l’evoluzione, attraverso il susseguirsi di una serie di duplicazioni geniche, di un gene “ancestrale” comune che mostra una stretta somiglianza con il gene umano codificante per il recettore 5-HT4 della serotonina8. Il sistema segnale dei TAAR appare coinvolgere il sistema proteina G/adenilato ciclasi. Questo ha permesso di evidenziare che tali recettori potrebbero essere attivati non solo dalle ammine traccia, ma anche da derivati anfetaminici, metaboliti delle monoamine, e dalle tironamine.

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31 Le ammine biogene classiche come ad esempio le catecolamine dopamina, noradrenalina e adrenalina, così come la serotonina e l’istamina sembrano essere poco affini per i recettori TAAR rispetto alle TAs, mostrando valori di EC50 anche alcuni ordini di grandezza superiori rispetto a quelli mostrati dalle TA.

Il recettore TAAR più studiato è il sottotipo TAAR1. Questo recettore è associato ad una proteina Gs e risulta essere attivato non solo dalle comuni TAs, ma anche da alcuni derivati amfetaminici, da metaboliti delle ammine biogene, da tironamine endogene quali la tironamina (T0AM) e la 3-iodotironamina (T1AM) e da alcuni farmaci sia adrenergici che serotoninergici.

Tuttavia, la mancanza di ligandi selettivi nei confronti di questo recettore non ha permesso di esplorare le funzioni biologiche attribuibili al TAAR1. Solo a partire dal 2010 alcuni studiosi hanno identificato i primi ligandi TAAR1 selettivi ad attività agonista come il derivato RO5166017 che è risultato essere molto più potente della β-PEA (Figura 13).

Figura 13. Struttura degli agonisti selettivi di TAAR1 RO5166017, β-PEA, 3-iodotironamina

Il TAAR1 è espresso in diverse regioni del cervello, comprese le zone contenenti i nuclei monoaminergici e le regioni limbiche. Grazie alle evidenze raccolte, è stato visto che il TAAR1 è coinvolto nella modulazione del sistema sia dopaminergico che serotoninergico e ciò rende questo recettore un nuovo bersaglio promettente per la scoperta di farmaci che permettano di gestire disturbi monoaminergici come la schizofrenia, depressione, sindrome da deficit di attenzione e iperattività (ADHD) e il morbo di Parkinson13.

Recentemente è stato pubblicato uno studio in silico per valutare i residui amminoacidici implicati nel binding hTAAR1/agonisti. In questo lavoro è stato identificato il sito di legame del hTAAR1 paragonandolo con il modello del recettore

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32 omologo β2-adrenergico e del recettore 5HT1A. Successivamente, è stato condotto uno studio di docking utilizzando gli agonisti noti RO5166017, β-PEA e T1AM.

Dai risultati ottenuti da questo studio di docking è stato possibile evidenziare che i tre agonisti esaminati condividono le seguenti interazioni:

a) un legame ad idrogeno tra il raggruppamento amminico e la catena laterale dell’amminoacido Asp103;

b) interazioni π-π tra il sistema aromatico (per quanto riguarda T1AM il fenile è quello dell’inner ring a cui è legata la catena etilamminica per T1AM) e gli amminoacidi Trp264, Phe267 e Phe268.

Dall’analisi dei risultati prodotti da questo studio è inoltre emerso che il derivato RO5166017 mostra un ulteriore legame ad idrogeno con Thr100 attraverso il sistema oxazolico, mentre T1AM è coinvolto nella formazione di 2 H-bonds con l’Asn286 e la Asp28715.

Figura 14. RO5166017 (rosa) e T1AM (bianco) nel sito di interazione con hTAAR1.

Con lo scopo di individuare nuovi ligandi ad attività agonista e/o antagonista per il recettore TAAR1, in questa tesi sono stati sviluppati alcuni nuovi analoghi sintetici delle due tironamine endogene (T0AM e T1AM) e loro possibili metaboliti. La disponibilità di nuove molecole in grado di interagire con i TAAR1, sia agonisti che

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33 antagonisti, dovrebbe fornire nuovi strumenti utili sia per lo studio della biodistribuzione che delle proprietà farmacologiche di tale recettore.

Come descritto in letteratura28 le principali modifiche strutturali apportate allo scaffold molecolare di T1AM si riferiscono a: 1) sostituzioni dell’ammina primaria con raggruppamenti N-alchilamminici o N,N- dialchilamminici, 2) variazioni strutturali a carico del linker che unisce i due anelli aromatici (A e B) e 3) sostituzioni a livello dei due gruppi arilici.

Figura 15. Modifiche strutturali apportate alla molecola di T1AM

L’esame dei rapporti struttura attività (SAR) dei nuovi analoghi tironaminici, descritti in letteratura ha evidenziato che:

1. la presenza di un gruppo amminico primario sulla catena etilamminica è essenziale al fine dell’attività biologica mediata dal recettore TAAR1;

2. la sostituzione dell’atomo di iodio in posizione 3 di T1AM con un bioisostero alchilico non influenza l’attività farmacologica (EC50 14 e 33 nM rispettivamente); 3. l’allungamento del linker tra i due anelli aromatici, A e B, è generalmente deleterio

per l’attività;

4. il sostituente OH in posizione 4’ non sembra essere essenziale per l’attività sul recettore;

5. l’allungamento della catena etilamminica in posizione 1 provoca una riduzione

dell’attività.

Sulla base di questi risultati, per meglio comprendere i meccanismi e le porzioni strutturali necessari per avere un’azione agonista nell’interazioni con il recettore hTAAR1, nel laboratorio presso il quale ho svolto questa tesi di laurea sono state progettate nuove molecole usando lo scaffold molecolare di T1AM.

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Figura 16.

In particolare nello svolgimento della mia tesi di laurea è stata effettuata la sintesi del composto 1 che differisce da T1AM per le seguenti caratteristiche:

1) sostituzione del ponte etereo con un metilene

2) inserimento di un atomo di ossigeno tra la catena alchilamminica in posizione 1 e il sistema aromatico B.

3) in posizione 4’ il raggruppamento fenolico è stato sostituito con un gruppo aminico 4) l’atomo di iodio in posizione 3 è stato sostituito con un gruppo metilico.

CH₃ O H2N NH2 1 O I O H NH2 T1AM A B ₁ 4'

Tenuto in considerazione che come è noto dalla letteratura le tironamine endogene sono esposte al catabolismo ad opera di aminoossidasi (MAO e SSAO) che in ultima analisi portano alla formazione dei loro derivati tiroacetici, nello svolgimento della presente tesi sono stati sintetizzati anche gli acetilossi- derivati 2a,b e 3a,b

O O2N COOH R R O H2N COOH 2a: R=H 2b: R=Me 3a: R=H 3b: R=Me Figura 17.

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35 SCHEMA 1 B(OH)₂ CH₃ OCH₃

+

Br O₂N CH₃ OCH₃ O₂N CH₃ OH O₂N CH₃ O O₂N CN CH₃ O N H₂ NH₂ 5 6 a b c d 1 4 . HCl Reagenti e condizioni:

a: p-nitrobenzilbromuro, K2CO3, PdCl2, H2O, Acetone, t.a., 72h. b: BBr3, 0°C, CH2Cl2 anidro, 1-2h;

c: BrCH2CN, DMF, Cs2CO3, t.a., 30 min. d: AlCl3, LiAlH4, THF, 12h, riflusso.

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36 Il composto 1 è stato sintetizzato seguendo la procedura descritta nello SCHEMA 1. Per reazione di Cross-Coupling tra l’acido 4-metossi-2-metilfenilboronico e il p-nitrobenzil bromuro commerciali, in presenza di K2CO3 e PdCl2, come catalizzatore, si è ottenuto il composto 4. La successiva reazione di deprotezione in presenza di BBr3 a 0°C ha condotto al corrispondente idrossiderivato 5, che è stato sottoposto a reazione di alchilazione con bromoacetonitrile per dare il cianoderivato 6. Il composto è stato successivamente ridotto con LiAlH4 in THF a fornire il prodotto finale 1.

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37 SCHEMA 2 B(OH)2 R OCH3

+

Br O2N R OCH₃ O₂N R OH O2N R O O2N COOEt R O O₂N COOH 8a,b 9a,b a b c d e a: R=CH₃ b: R=H 7a,b 2a,b R O N H₂ COOH 3a,b Reagenti e condizioni:

a: p-nitrobenzilbromuro, K2CO3, PdCl2, H2O, Acetone, t.a., 72h. b: BBr3, CHCl2 anidro, 0°C, 1.5 h;

c: BrCH2COOEt, Cs2CO3, DMF, t.a., 30 min. d: NaOH 10%, MeOH, 1h, reflusso.

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38 I derivati 2a,b e 3a,b sono stati ottenuti seguendo lo SCHEMA2. Per reazione di Cross-Coupling tra il p-nitrobenzil bromuro commerciale e l’appropriato acido 4-metossifenilboronico, in presenza di K2CO3 e PdCl2 come catalizzatore, sono stati ottenuti i composti 7a,b. La successiva reazione di demetilazione in presenza di BBr3 a 0°C ha condotto ai corrispondenti idrossiderivati 8a,b, che sono stati sottoposti a reazione di alchilazione con il bromoacetato di etile per dare i rispettivi derivati esterei 9a,b. I composti sono stati successivamente idrolizzati con NaOH 10% in MeOH a fornire i prodotti finali 2a,b.

Infine, per riduzione del gruppo nitro di 2a,b con H2N-NH2 idrata in MeOH sono stati ottenuti i composti desiderati 3a,b.

I composti sintetizzati verranno valutati per la loro attività agonista e/o antagonista nei confronti del recettore hTAAR1 in cellule HEK293 transfettate. Il saggio consiste nella determinazione di cAMP prodotto a seguito del trattamento con i composti presi in esame (BRET-signaling)13.