4.1 Clonaggio pGEX-VEGF

49

4 Risultati

4.1 Clonaggio pGEX-VEGF

Il frammento di DNA contenente la sequenza del VEGF

umano, contenuta nel vettore pcDNA3 (Figura 18), è stato escisso attraverso l’azione degli enzimi di restrizione EcoRI e XhoI, purificato dal gel d’agarosio e quantificato per poi essere clonato, grazie all’azione della DNA ligasi T4, nel nuovo vettore pGEX-6- P in frame con la GST (Figura 19). Valutando l’intensità delle bande su gel, è stata stimata una concentrazione di 20 ng/µl sia per il vettore pGEX che per l’inserto VEGF, che quindi sono stati mescolati in rapporto di 1:3. Con il prodotto della reazione, pGEX-6-P/VEGF, sono state trasformate cellule DH5α, in modo da verificare che il clonaggio fosse avvenuto correttamente. Tramite analisi elettroforetica del DNA estratto da varie colonie indipendenti è stato possibile selezionare il clone contenente il plasmide pGEX-VEGF. Il DNA estratto è stato digerito con gli enzimi di restrizione EcoRI e XhoI in modo tale da valutare su gel la presenza delle bande corrispondenti al vettore e all’inserto all’altezza attesa. Il vettore pGEX-VEGF intero è costituito da 5575 bp. Dopo la digestione enzimatica sono attesi due frammenti: il frammento del vettore pGEX di 4984bp e il frammento corrispondente all’inserto VEGF di 612 bp. La corsa elettroforetica ha confermato l’avvenuto clonaggio nella colonia 3 in quanto sono presenti le due bande all'altezza desiderata (Figura 20). La colonia numero 3, quindi, è stata utilizzata per ottenere maggiori quantità di plasmide pGEX-VEGF (mediante

“midi-prep”) che alla fine è stato risospeso ad una concentrazione finale di 0,8

µg/µl.

50

Figura 18: Rappresentazione del vettore pcDNA3-VEGF.

Figura 19: Mappa del plasmide pGEX-VEGF

VEGF

51

4.2 Clonaggio pRSET B-VEGF

In parallelo è stato effettuato il clonaggio della sequenza del VEGF

umano anche in un vettore contenente un tag più piccolo. Il plasmide pRSET permette di produrre nei batteri proteine ricombinanti fuse a sei istidine, che permettono la purificazione mediante cromatografia. La sequenza di DNA del VEGF

, contenuta nel vettore pcDNA3 (Figura 18), è stata escissa attraverso l’azione degli enzimi di restrizione BamHI e XhoI, purificata dal gel d’agarosio, quantificata e poi clonata, grazie all’azione della DNA ligasi T4, nel nuovo vettore pRSET B in frame con il tag di istidine (Figura 21). È stata stimata, valutando l’intensità delle bande su gel, una concentrazione di 20 ng/µl per l’inserto VEGF e di 600 ng/µl per il vettore pRSET B. Con il prodotto della reazione pRSET B/VEGF sono state trasformate cellule DH5α in modo da verificare che il clonaggio fosse avvenuto

LD 1 2 3 4 5

4984 bp

612 bp

Figura 20: Elettroforesi su gel d'agarosio. LD: ladder;

1-2-3-4-5: DH5α trasformate con pGEX-VEGF e digerite con XhoI e EcoRI.

52

correttamente. Tramite corsa elettroforetica del DNA estratto da alcune colonie è stato possibile selezionare il clone contenente il plasmide pRSET B-VEGF. Il DNA estratto è stato digerito con gli enzimi di restrizione BamHI e XhoI in modo tale da valutare su gel la presenza delle bande corrispondenti al vettore e all’inserto all’altezza attesa. Il vettore pRSET B-VEGF intero è costituito da 3515 bp, dopo la digestione enzimatica sono attesi due frammenti: il frammento del vettore pRSET B di 2887 bp e il frammento corrispondente all’inserto VEGF di circa 650 bp. La corsa elettroforetica ha confermato l’avvenuto clonaggio in diverse colonie: sono ben visibili su gel una banda più bassa corrispondente all’inserto e una banda più alta corrispondente al vettore (Figura 22). È stata selezionata la colonia numero 8 per ottenere maggiori quantità di plasmide pRSETB-VEGF (mediante “midi-prep”) di cui abbiamo poi stimato, tramite corsa su gel d’agarosio e lettura allo spettrofotometro, una concentrazione di 2,5 µg/µl.

Figura 21: Mappa del vettore pRSET B-VEGF

53

4.3 Produzione della proteina ricombinante

4.3.1 Espressione batterica e purificazione della proteina di fusione GST-VEGF

Cellule batteriche BL21 sono state trasformate con 10 ng di DNA pGEX-VEGF.

Una singola colonia è stata inoculata in terreno liquido LB, per una precrescita in 10 ml durante la notte. Tale precrescita è stata trasferita in un volume maggiore di terreno LB (100 ml), ed è stata monitorata la crescita delle cellule batteriche in modo tale da indurre la produzione della proteina di fusione GST-VEGF

aggiungendo IPTG (0,5 mM o 1 mM) nel momento in cui le cellule avessero raggiunto la fase esponenziale di crescita (OD= 0,7-0,8). È stata effettuata un’estrazione delle proteine citosoliche e un’estrazione dai corpi inclusi. Gli estratti sono stati purificati per affinità su una resina funzionalizzata con glutatione per legare la proteina di fusione GST-VEGF

, che successivamente è stata staccata mediante trattamento con GSH. Il western blot in figura 23, effettuato con un anticorpo specifico anti-VEGF, ha mostrato che la proteina di fusione è presente in quantità maggiori nell’estratto citosolico rispetto a quello dai

2888 bp

650 bp

Figura 22: Elettroforesi su gel d'agarosio. LD: ladder. DH5 α trasformate con pRSET B-VEGF (colonie 1-2-3-4-5-6-7-8-9-10) e digerite con BamHI e XhoI.

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corpi inclusi, pertanto per gli esperimenti successivi è stata usata sempre la frazione citosolica. Sono stati messi a punto alcuni parametri per ottenere la migliore resa possibile, effettuando in parallelo saggi di induzione con IPTG a 0,5 mM e 1 mM ed eluendo la proteina così ottenuta con GSH 10 mM e 20 mM. Il western blot in figura 24 A ha mostrato una resa migliore, inducendo le cellule batteriche con IPTG 1 mM ed eluendo con GSH 10 mM (Corsia 1-2 Figura 24 A).

Le tre bande visibili corrispondono alla proteina di fusione GST-VEGF

con un peso molecolare di 49 kDa (VEGF 21 kDa, GST 27 kDa), e a porzioni tronche della proteina di fusione derivate da tagli aspecifici in punti sensibili (circa 27 kDa la più bassa e circa 40kDa quella intermedia). Inoltre, esponendo la lastra per tempi più lunghi è stato possibile evidenziare un potenziale dimero del VEGF a circa 80 kDa (Figura 24 A, corsia 1). È stato inoltre verificato che la banda osservata all’altezza di 27 kDa non fosse dovuta ad una reazione aspecifica dell’anticorpo verso la GST, essendo esattamente questo il suo peso molecolare.

Utilizzando come controllo una preparazione di batteri trasformati con il plasmide

pGEX vuoto (che quindi induce espressione solo di GST) è stato possibile

verificare che una banda corrispondente a quella della GST non è riscontrabile

dopo western blot con anticorpo anti-VEGF, pertanto possiamo escludere un

attacco non-specifico dell’anticorpo verso la GST (Figura 25). Dunque la banda a

27 kDa è probabilmente una forma tronca del VEGF. Alla fine di questa prima

analisi qualitativa, è stato preparato un volume maggiore (1L) di crescita di batteri

trasformati con pGEX-VEGF, in modo da averne una quantità sufficiente da poter

utilizzare negli esperimenti successivi di funzionalizzazione delle nanoparticelle e

di microiniezione degli embrioni. Da 1L di crescita e successiva eluizione con

GSH è stata ottenuta una preparazione di proteina purificata che è stata dializzata

contro PBS. Il prodotto finale risulta avere sempre lo stesso pattern di bande ma

più definito (Figura 24 B). Anche in questo caso la proteina di fusione sembra

essere presente come full length (49 kDa), nelle 2 forme tronche di 40 e 27 kDa e

come dimero (circa 80 kDa). Questa miscela proteica nel seguito sarà

genericamente indicata come rVEGF.

55 1 2 3 4

Figura 24: Western Blot con anticorpo anti-VEGF dell’eluato derivante dall’estratto batterico trasformato con pGEX-VEGF. corsia 1: eluato derivante dall'estratto citosolico. Corsia 2: eluato derivante dai corpi inclusi. Corsia 3 - 4: flow- through citosolico e flow-through dell’estratto dai corpi inclusi

Figura 23: (A) Western blot con anticorpo anti-VEGF condotto su lisato proteico di BL21 trasformate con pGEX-VEGF e indotte con IPTG 1 mM (corsie 1-6) e IPTG 0,5 mM (corsie 7-9).

Corsie 1-3: eluizione con GSH 10 mM (corsia 1: prima eluizione; corsia 2:seconda eluizione; corsia 3: terza eluizione con Dye. Corsie 4-6: eluizione con GSH 20 mM (corsia 4: prima eluizione; corsia 5:seconda eluizione; corsia 6: terza eluizione con Dye. Corsie 7-9: eluizione con GSH 20 mM (corsia 7: prima eluizione; corsia 8: seconda eluizione; corsia 9: terza eluizione con Dye. (B) Western blot con anticorpo anti-VEGF condotto su lisato proteico di BL21 trasformate con pGEX- VEGF, indotte con IPTG 1 mM; eluizione con GSH 10 mM e successiva dialisi.

56

Figura 25: (A) SDS-PAGE dell'estratto derivante da batteri BL21 trasformati con pGEX (plasmide vuoto), colorato con Coomassie. (B) Western blot con anticorpo anti-VEGF. All’altezza corrispondente alla GST non compare nessuna banda.

4.3.2 Espressione batterica e purificazione della proteina di fusione His-VEGF

Cellule batteriche BL21 sono state trasformate con 10 ng della midi pRSETB- VEGF (2,5µg/µl). Una singola colonia è stata inoculata in terreno liquido LB, con pre-crescita in 10 ml. Tale precrescita è stata trasferita in un volume maggiore di terreno LB (100ml) dove è stata monitorata la crescita delle cellule batteriche in modo tale da indurre la produzione della proteina di fusione His-VEGF

aggiungendo IPTG 0,5 mM o 1mM nel momento in cui le cellule sono in fase esponenziale di crescita (OD= 0,7-0,8). L’estratto proteico totale citosolico e l’estratto proteico totale derivante dai corpi inclusi è stato purificato per affinità con la resina contenente nickel che ha alta affinità per le istidine a cui quindi si legherà la proteina di fusione His-VEGF

che verrà eluita. In questo caso però non son stati raggiunti risultati positivi: dalle colonie selezionate non è stato possibile ottenere la proteina di fusione desiderata His-VEGF

; pertanto si è proseguito utilizzando la proteina di fusione GST-VEGF

per la quale, invece, abbiamo sempre avuto una buona resa.

GST

A B

57

4.3.3 Quantificazione della proteina ricombinante rVEGF

La proteina ricombinante è stata quantificata tramite lettura allo spettrofotometro alla lunghezza d’onda di 280 nm, utilizzando un’opportuna retta di calibrazione ottenuta con concentrazioni note di BSA (Figura 26).

Nell’eluato dializzato proveniente da 1L di crescita batterica è stata riscontrata un’assorbanza corrispondente ad una quantità di proteina ricombinante pari a 940 µg (940 µg/ml). La soluzione madre utilizzata (da cui sono state ottenute tutte le successive diluizioni) ha una concentrazione pari a 1,88 ng/nl.

4.4 Micro-iniezioni in embrioni di zebrafish

La funzionalità della proteina ricombinante prodotta è stata valutata tramite esperimenti in vivo condotti su embrioni di zebrafish. La proteina rVEGF è stata iniettata nello yolk (sacco vitellino) di embrioni zebrafish a 24 hpf. Due giorni dopo le iniezioni è stata osservata un’alterazione del fenotipo in senso angiogenico. L’iniezione del rVEGF ha indotto una modificazione del pattern dei

y = 0,0005x + 0,0063 R² = 0,999

0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5

0 200 400 600 800 1000

Figura 26: Retta di calibrazione con concentrazioni note di BSA

58

vasi della regione delle vene subintestinali (SIV): dal fenotipo di controllo (WT) caratterizzato dalla presenza di SIV dalla tipica forma a canestro si passa a un fenotipo angiogenico in cui dal canestro di vene protrudono degli extra vasi;

nell’intera regione si osserva nel complesso un’angiogenesi irregolare (Figura 27).

Lo sviluppo della regione SIV così come l’induzione dell’angiogenesi da parte del rVEGF iniettato sono stati monitorati su embrioni viventi tramite microscopia in fluorescenza. Gli effetti indotti dal rVEGF iniettato iniziano ad essere ben apprezzabili 48 ore dopo l’iniezione (hpi) ovvero a 72 hpf.

Successivamente gli embrioni sono stati fissati ed è quindi stato possibile

apprezzare in maniera ottimale il fenotipo angiogenico tramite colorazione diretta

contro la fosfatasi alcalina, in quanto essa è espressa nei vasi ai quali la

colorazione conferisce un colore blu/viola dopo l’esposizione al substrato

cromogeno. Al contrario il vitello sottostante resta di colore bianco creando un

buon contrasto (Figura 28). I risultati sperimentali hanno dimostrato che la

proteina ricombinante prodotta è capace di indurre il fenotipo angiogenico,

confermando che il VEGF ricombinante mantiene la sua attività biologica; inoltre

le microiniezioni con quantità diverse di rVEGF hanno dimostrato un effetto dose-

dipendente ben apprezzabile nell’istogramma in figura 29 dove è evidente una

correlazione tra la quantità di rVEGF iniettata e la percentuale di embrioni che

manifestano un fenotipo pro-angiogenico. A scopo di controllo gli embrioni sono

stati micro iniettati con un campione ottenuto, osservando la stessa procedura

sperimentale di produzione del rVEGF, da cellule BL21 trasformate col vettore

vuoto (pGEX). La percentuale di fenotipo angiogenico ottenuta in tale controllo è

stata assunta come valore fisiologico basale.

59

SIV

60

F F G

H

I

Figura 27: Immagini in vivo in fluorescenza dei vasi sanguigni nella zona delle SIV di zebrafish (roy-/-;nacre-/-;Tg(kdrl:egfp)s483) 72 hpf. (A) Embrione di zebrafish 72 hpf: la zona delle SIV è indicata da un quadrato rosso (4X). (B) Embrione di controllo iniettato con PBS: il canestro della regione delle SIV presenta un pattern di piccoli vasi regolare e ben definito (10X). (C-I) Embrioni iniettati con rVEGF: extra-vasi neoangiogenici di dimensioni diverse protrudono dalla regione delle SIV modificando la tipica forma a canestro (C-H), l’angiogenesi irregolare del SIV è caratterizzata da ramificazioni in eccesso (H-I). Gli embrioni in (A-C, H) sono orientati con la regione anteriore a destra ed il dorso verso alto mentre in (D-G, I) l’orientazione è quella opposta. Le frecce indicano alcuni extra vasi.

61

A

62

Figura 28: Embrioni di zebrafish 72 hpf fissati e colorati per la fosfatasi alcalina. (A-C) Embrioni di controllo iniettati con PBS, la forma a canestro della regione delle SIV è ben definita con 7-8 ramificazioni. (D-H) embrioni iniettati con rVEGF: la regione SIV mostra un fenotipo alterato con angiogenesi irregolare e con extra-vasi che protudono nello yolk.(A-C) Gli embrioni sono orientati con la regione anteriore a sinistra ed il dorso verso alto. (D-H) Gli embrioni sono orientati con la regione anteriore a destra ed il dorso verso alto. Le frecce indicano alcuni extra vasi.

63

Figura 29: Correlazione dose-effetto: nanogrammi di rVEGF iniettato e comparsa del fenotipo pro- angiogenico. Ø: campione proveniente da batteri trasformati con vettore vuoto (pGEX)

4.5 Nanoparticelle magnetiche

4.5.1 Caratterizzazione delle nanoparticelle magnetiche (MNP)

La caratterizzazione morfologica e magnetica delle nanoparticelle consente di conoscere parametri come forma, dimensione, carica, magnetizzazione e altre informazioni importanti per le diverse applicazioni. Le caratteristiche delle MNP utilizzate in questo lavoro sono descritte nella seguente tabella:

Tabella 26: Caratteristiche tecniche nanoparticelle

Nome prodotto nanomag®-D -spio Indice di

polispersione

< 0,2

Codice 79-02-501 Densità 1,4 g/ccm

Superficie funzionalizzata

Polimero organico con gruppi liberi COOH

Concentrazione di Ferro

2,4 mg/ml

Dimensione 50 nm Magnetizzazione 24 emu/g particles (H =1000 Oe) Concentrazione 5mg/ml Magnetizzazione di

saturazione

>34emu/g particles

(H > 10.000 Oe)

64

I dati forniti dal produttore confermano che le MNP hanno eccellenti proprietà magnetiche e dimensione uniforme (indice di polidispersione <0,2) intorno ai 50 nm. Le caratteristiche morfologiche sono state ottenute acquisendo immagini ad alta risoluzione tramite TEM (microscopia elettronica in trasmissione) (Figura 30). L’analisi in microscopia elettronica ha rivelato che le nanoparticelle presentano una struttura cubica con dimensione tipica leggermente superiore ai 50 nm.

4.5.2 Funzionalizzazione delle nanoparticelle magnetiche

Le nanoparticelle magnetiche sono state funzionalizzate con la proteina di fusione rVEGF prodotta in laboratorio, attraverso una reazione covalente tra i gruppi COOH che sporgono dalla superficie delle MNP e i gruppi amminici della

Figura 30: Immagini al TEM di nanoparticelle magnetiche Fe3O4.

65

proteina ricombinante (legame peptidico) (Figura 31). La presenza della GST (di dimensioni paragonabili al VEGF) ha il vantaggio di garantire che una buona parte delle molecole proteiche (teoricamente il 50%) leghino la nanoparticella dal lato della GST che svolgerebbe dunque il ruolo di linker tra il VEGF e le MNP, garantendo elevata flessibilità del VEGF ancorato al complesso, mantenendo inalterata la sua struttura e consentendone la dimerizzazione o l’accesso al suo recettore in modo tale da preservare la bio-funzionalità del fattore di crescita. La quantità di rVEGF legata alla superficie delle MNP è stata calcolata per differenza, sottraendo la quantità di proteina presente nel sopranatante dalla quantità introdotta nella miscela di reazione. La concentrazione è stata calcolata tramite la retta di taratura (Figura 26) ottenuta con concentrazioni note di albumina. La reazione covalente tra la proteina e le MNP è stata allestita in un volume finale di 500 µl mettendo in soluzione 282 µg di rVEGF (940 µg/ml) con 1 mg di MNP (2 mg/ml). È stata misurata l’assorbanza del sopranatante dopo la reazione per calcolare per differenza la quantità di proteina che si è legata alle MNP: l'assorbanza misurata è stata trovata corrispondere ad una concentrazione di rVEGF pari a 176 µg/ml. In 500 µl di campione, quindi, sono presenti nel sopranatante circa 88 µg di proteina. 194µg di rVEGF hanno dunque reagito con le MNP, la cui concentrazione finale è stata stimata pari a circa 1,8 mg/ml. Il campione così prodotto (in seguito indicato come MNP-VEFG) è risultato essere caratterizzato da una quantità di 215 ng di rVEGF per µg di MNP.

Le nanoparticelle magnetiche sono state funzionalizzate anche con la poli-L-

lisina, seguendo il medesimo protocollo (di seguito indicate come MNP-PLL).

66

Figura 31: Schema della funzionalizzazione delle nanoparticelle magnetiche

Le particelle così prodotte sono state dunque caratterizzate in termini di potenziale Z (Figura 32) e DLS (Figura 33).

Figura 32: Potenziale Z delle nano formulazioni

67

Tabella 27: tabella riassuntiva dei dati sperimentali (n=3)

Z potenzial (mV) Diameter (nm)

MNP -27,56±1,85 61,10±1,87

MNP-rVEGF -34,97±2,21 128,57±0,35

MNP-PLL 14,68±0,90 299,17±19,53

I dati sperimentali rivelano, in accordo a quanto atteso, che le MNP posseggono

una carica superficiale netta negativa (dovuta alla presenza dei gruppi COOH

esposti in superfici) e un dimensione intorno ai 60 nm. La distribuzione dei

diametri è rappresentata da una gaussiana piuttosto stretta che rivela un buon

range dimensionale del prodotto e l’assenza di aggregati mentre la carica di

superficie rivela l’ottima stabilità del prodotto. In seguito alla funzionalizzazione

con la proteina ricombinante assistiamo ad un netto incremento del diametro (da

60 a circa 130 nm) che conferma univocabilmente la presenza della proteina. In

accordo al punto isolettrico della proteina ricombinante, assistiamo inoltre ad un

cambiamento del potenziale di superficie (da -27 a -35 mV) che di nuovo

documenta l’avvenuta funzionalizzazione e l’ottima stabilità del colloide.

68

Altrettanto efficiente si è rivelata la funzionalizzazione con PLL, giacchè assistiamo ad un drastico aumento del diametro (da 60 a 300 nm) ma la totale assenza di aggregati, come documentato dalla gaussiana incredibilmente stretta, anche se confrontata al campione MNP. Infine si registra un netto cambio della carica di superficie (da -27 a +15 mV), come chiaramente atteso data la natura fortemente cationica del polipeptide in questione.

4.6 Micro-iniezioni delle MNP-rVEGF in embrioni di zebrafish

La bio-funzionalità del rVEGF legato alle MNP è stata saggiata anche in questo caso tramite esperimenti in vivo su embrioni di zebrafish (24 hpf) microiniettati nello yolk con concentrazioni diverse della soluzione MNP-rVEGF. Dopo le iniezioni abbiamo controllato la vitalità degli embrioni e valutato l’eventuale modifica del fenotipo angiogenico rispetto ai controlli iniettati con solo MNP. Gli embrioni a 72 hpf, iniettati con MNP-rVEGF, hanno una vitalità equivalente a quella dei controlli e non presentano malformazioni o aberrazioni nel normale sviluppo, pertanto possiamo escludere un’eventuale tossicità delle MNP; gli embrioni inoltre presentano una modificazione del profilo angiogenico della regione delle vene sub-intestinali con fenotipo equivalente agli embrioni iniettati con la proteina di fusione rVEGF non legata alle MNP: è ben evidente uno sviluppo irregolare con extra-vasi che protudono dalla regione SIV (Figura.34).

La bio-funzionalità della proteina scelta come reporter da legare alle MNP è

dunque conservata. Anche in questo caso i risultati sperimentali relativi alle

microiniezioni con dosi diverse di MNP-rVEGF indicano una correlazione dose-

effetto (Figura 35). Gli embrioni di controllo iniettati con MNP rivelano un debole

effetto angiogenico indotto dalle sole MNP, anche in questo caso dose-dipendente

(Figura 36).

69

MNP-rVEGF

Figura 34: Effetti delle MNP-rVEGF. (A-B) Embrioni zebrafish iniettati con la proteina di fusione rVEGF:

alterazione del fenotipo angiogenico della regione delle SIV 48 hpi. (C-D) Embrioni di zebrafish iniettati con MNP-rVEGF: fenotipo angiogenico della regione delle SIV alterato e paragonabile agli embrioni iniettati con la proteina di fusione non legata alle MNP. (A-C) Immagini acquisite in vivo tramite microscopio a fluorescenza. (B-D) Immagini acquisite tramite stereo-microscopio di embrioni colorati per la fosfatasi alcalina. Gli embrioni sono orientati con la regione anteriore a destra ed il dorso verso alto

rVEGF

70

Figura 35: Correlazione dose-effetto: comparsa fenotipo pro-angiogenico in relazione alla quantità iniettata di MNP-rVEGF. Le ascisse riportano la quantità di rVEGF e MNP rispettivamente presenti nelle MNP-rVEGF iniettate

Figura 36: Correlazione dose-effetto: comparsa fenotipo pro-angiogenico in relazione alla quantità iniettata di MNP

71

4.7 Microiniezioni di VEGF commerciale

A scopo di controllo positivo, embrioni di zebrafish a 24 hpf sono stati microiniettati nello yolk con quantità differenti di VEGF

commerciale (ISOkine

). Gli embrioni a 48 hpi manifestano una alta percentuale di comparsa del fenotipo pro-angiogenico esattamente paragonabile al fenotipo osservato negli embrioni iniettati con rVEGF e con MNP-rVEGF (Figura 37). Ancora una volta, anche se più moderata, riscontriamo una correlazione dose-effetto (Figura 38).

Figura 37: Embrioni di zebrafish 72 hpf fissati e colorati per la fosfatasi alcalina. (A-C) Embrioni iniettati con VEGF commerciale in cui è evidente il fenotipo pro-angiogenico. (D) embrione di controllo

72

Figura 38: Correlazione dose-effetto: comparsa fenotipo pro-angiogenico in relazione alla quantità di VEGF165 commerciale iniettata

4.8 Analisi statistica delle curve dose-risposta

Il modello scelto per la correlazione dei dati sperimentale è un modello con andamento esponenziale che soddisfi le condizioni al contorno identificate sperimentalmente:

lim𝑓(𝑥) = 90%

𝑥 → ∞ lim𝑓(𝑥) = 18%

𝑥 → 0

Il modello risulta dunque essere:

f(x) = 90-exp(a*x+4,276666)

L’analisi successiva condotta in ambiente Matlab (Matlab workspace R2014a,

versione inglese) ha consentito la valutazione del coefficiente a, al 95% di

confidenza. Indicando con x il vettore “quantità” e y il vettore “concentrazione

fenotipo”. I risultati sono stati quelli nel seguito riportati.

73

VEGF commerciale

x (VEFG) [0 0,25 1,16 5,80 11,00 23,00]

y [17 68 70 75 80 94]

a -4,468 (-9,718; 0,7825) (with 95% confidence bounds)

Goodness of fit SSE 728,4

R-square 0,7902

RMSE 12,07

Figura 39 Interpolazione dei dati relativi all’iniezione del VEGF commerciale (ascisse quantità VEGF iniettata, ordinate percentuale fenotipo)

Tabella 29

rVEGF

x (rVEGF) [0 0,25 1,04 5,52 11,28 48,80 56,40 204,00]

y [17 35 57 60 76 83 90 90]

a -0,23 (-0,4252; -0,03487) (with 95% confidence bounds) Bontà

dell’interpolazione

SSE 949,1

R-square 0,809

RMSE 11,64

74

MNP-rVEGF

x (rVEGF) [0 1,05 5,25 10,50 21,00]

y [17 53 62 77 94]

a -0,2328 (-0,448; -0,01752) (with 95% confidence bounds)

Bontà dell’interpolazione SSE 489,2

R-square 0,8538

RMSE 11,6

Figura 40: Interpolazione dei dati relativi all’iniezione del rVEGF (ascisse: quantità rVEGF iniettata, ordinate: percentuale fenotipo)

Figura 41: Interpolazione dei dati relativi all’iniezione del MNP-rVEGF (ascisse: quantità rVEGF iniettata, ordinate: percentuale fenotipo)

75

MNP-rVEGF

x (MNP) [0 5,40 27,00 54,00 108,00]

y [17 53 62 77 94]

a -0,04527 (-0,08713; -0,003404) (with 95%

confidence bounds) Bontà

dell’interpolazione

SSE 489,2

R-square 0,8538

RMSE 11,6

Tabella 32

MNP

x (MNP) [0 1,05 5,25 10,50 21,00]

y [17 53 62 77 94]

a -0,004663 (-0,006447; -0,002879) (with

95% confidence bounds)

Goodness of fit SSE 84,41

R-square 0,8743

RMSE 4,109

Figura 42: Interpolazione dei dati relativi all’iniezione del MNP-rVEGF (ascisse: quantità MNP iniettata, ordinate: percentuale fenotipo)

76

Le curve così ottenute sono state dunque utilizzate per calcolare, al 95% di confidenza, l’ED

, ovvero la dose che induce il 50% del fenotipo osservato. I risultati sono riportati in tabella 33 e visualizzati nella figura 45. Dall’analisi statistica si evince chiaramente che c’è piena sovrapposizione tra i dati relativi alle curve rVEGF e MNP-rVEGF, con ED

pari a 2,5 ng di VEGF in entrambi i campioni. I dati relativi a MNP-rVEGF e MNP risultano invece statisticamente molto diversi tra di loro, di un ordine di grandezza, con ED

pari a 12 ng e 126 ng di MNP, rispettivamente. Le MNP di per sé dunque forniscono un piccolo background, probabilmente dovuto alla reattività dei gruppi COOH esposti sulla superficie delle particelle non funzionalizzate. I dati sperimentali rivelano inoltre che, rispetto al prodotto commerciale, il VEGF ricombinante richiede una dose circa 20 volte superiore per l’ottenimento di un fenotipo percentuale equivalente (tabella 33).

Figura 43: Interpolazione dei dati relativi all’iniezione di MNP (ascisse: quantità MNP iniettata, ordinate: percentuale fenotipo)

77

Tabella 33: ED

(dose effettiva per l’induzione del 50% del fenotipo) nei diversi gruppi sperimentali.

Campione ED

VEGF (ng) MNP (ng)

VEGF 0,13 [0,06-0,75]*

rVEGF 2, 55 [1,38-16,85]*

MNP-rVEGF 2,52 [1,31-33,55]* 12,98 [6,74-172,67]*

MNP 126,05 [91,17-204,16]*

*Le parentesi quadre riportano l’intervallo relativo al 95% di confidenza.

Figura 44: Rappresentazione grafica dei dati di tabella 31 n

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Figura 45: Confronto curve ottenute per i diversi gruppi sperimentali (ascisse normalizzate rispetto ai ng di VEGF)

4.9 Micro-iniezioni intraoculari

La messa a punto del sistema MNP-rVEGF usato come reporter, ha permesso di testare tale sistema anche come strumento per la somministrazione di farmaci oculari in grado di localizzarsi in maniera sito-specifica.

Le microiniezioni sono state condotte nell’occhio, a lato del cristallino, di embrioni zebrafish a 48 hpf e 72 hpf che presentano un volume oculare di circa 15 nl. Per ognuno dei due stadi sono stati analizzati tre gruppi sperimentali di 15 embrioni ciascuno, nei quali è stato iniettato in un volume fisso di 4nl:

– MNP- rVEGF (1,4 ng rVEGF / 7,2 ng MNP) – rVEGF (1,4 ng)

– MNP (7,2 ng)

Un quarto gruppo sperimentale è stato effettuato con embrioni zebrafish 48 hpf

79 microiniettati con 7,2 ng di MNP-PLL.

Gli embrioni sono stati osservati in vivo in fluorescenza e poi fissati dopo 24 h dall’iniezione. La visualizzazione in vivo dei vasi sanguigni oculari è risultata essere artificiosa, permettendo di osservare solo i vasi ialoidei dell’occhio e non quelli di interesse della coroide che circonda l'RPE. Inoltre, anche volendo valutare possibili effetti sui vasi ialoidei, non sono facilmente apprezzabili eventuali alterazioni dei vasi sanguigni, in quanto il pattern di espressione è estremamente variabile (Figura 46). Sono, pertanto, in corso studi per cercare di valutare l'effetto pro-angiogenico del VEGF sui vasi della coroide, non più in vivo, ma su sezione tramite specifiche istologie.

Figura 46: Vasi ialoidei di embrioni zebrafish non trattati a 48 hpf. (A-D) Il pattern di espressione è estremamente variabile. Ingrandimento 10X. Gli embrioni sono orientati con la regione anteriore a destra ed il dorso verso alto.

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4.10 Localizzazione intraoculare delle nanoparticelle

La colorazione Prussian Blue, effettuata su sezioni di embrioni fissati, permette di

osservare la distribuzione e la localizzazione delle nanoparticelle, che appaiono

colorate di blu, nell’occhio di zebrafish. L’osservazione al microscopio dei vari

vetrini mostra una tendenza a localizzare in specifici compartimenti oculari sia

delle nanoparticelle funzionalizzate MNP-rVEGF sia delle MNP-PLL sia delle

MNP nude. Per ogni gruppo sono stati iniettati 15 embrioni. L’iniezione di MNP

nell’occhio di zebrafish a 48 hpf e 72 hpf mostra una localizzazione specifica

nell’RPE rispettivamente nel 50% e del 58% dei casi, mentre nei restanti si

osservano agglomerati di nanoparticelle negli strati retinici. L’iniezione di MNP-

rVEGF nell’occhio di zebrafish a 48 hpf e a 72 hpf, mostra una localizzazione

specifica nell’RPE rispettivamente del 42% e del 60% dei casi, mentre nei restanti

embrioni si osserva una localizzazione posteriore all’RPE in corrispondenza del

mesenchima perioculare (Figure 47-48). L’iniezione di MNP-PLL mostra

anch’essa una localizzazione specifica ed esclusiva nell’RPE nel 75% dei casi

(Figura 49). Quindi, nei vari casi, le nanoparticelle iniettate intraocularmente,

sono in grado di migrare attraverso le strutture oculari e raggiungere la camera

posteriore, localizzandosi nello strato dell’RPE e della coroide.

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Figura 47: Sezioni di zebrafish con colorazione Prussian Blue. Embrioni iniettati nell'occhio con MNP (A-B, D-E). Embrioni di controllo (C-F). Le nanoparticelle, indicate dalle frecce, sono colorate di blu. A e B mostrano localizzazione delle MNP nell’RPE, rispettivamente a 48 e 72 hpf. B e E mostrano un caso in cui le MNP precipitano e condensano nel vitreo o nelle strutture retiniche, rispettivamente a 48 e 72 hpf.

Figura 48: Sezioni di zebrafish con colorazione Prussian Blue. Embrioni iniettati nell’occhio con MNP-rVEGF (A-B-D-E). Embrioni di controllo (C-F). Le nanoparticelle, indicate dalle frecce, sono colorate di blu. Le MNP- VEGF localizzano in alcuni casi nell’RPE (A-D), in altri casi posteriormente all’RPE nel mesenchima perioculare

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Figura 49: Sezioni di zebrafish 48hpf con colorazione Prussian Blue. (A) Embrioni iniettati nell’occhio con MNP-PLL localizzate nell’RPE. (B) Embrioni di controllo.