Come atteso, l'attivazione di questi geni avviene secondo la stessa successione temporale con la quale i corri- spettivi tipi cellulari sono generati

Riassunto

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Riassunto ii

Nel corso dello sviluppo embrionale la formazione di tessuti neurali avvie- ne a partire da progenitori multipotenti e richiede una regolazione integrata della loro proliferazione, dell'uscita dal ciclo cellulare e dell'attivazione di fattori necessari al dierenziamento.

La retina di Xenopus laevis è un sistema ideale per lo studio di questi processi, poiché è costituita da cinque tipi di neuroni (fotorecettori, cellule gangliari, orizzontali, amacrine e bipolari) e un tipo di cellula gliale (glia di Müller), facilmente riconoscibili per morfologia e localizzazione negli strati retinici.

I diversi tipi cellulari retinici sono generati in una sequenza temporale ben denita ed evolutivamente conservata. Il destino cellulare viene stabilito dall'attivazione di geni specici, tra i quali geni homeobox come Xotx5b (fo- torecettori), Xotx2 e Xvsx1 (bipolari). Come atteso, l'attivazione di questi geni avviene secondo la stessa successione temporale con la quale i corri- spettivi tipi cellulari sono generati. E' stato recentemente dimostrato che l'attivazione di questi geni homeobox è regolata a livello traduzionale, ov- vero gli mRNA sono espressi in tutti i progenitori precoci ma le proteine corrispondenti sono tradotte solo nelle cellule destinate a dierenziare in bipolari o fotorecettori (Decembrini et al., 2006). Questo controllo traduzio- nale è esercitato da fattori tuttora ignoti in grado di riconoscere segnali in cis nel 3'UTR degli mRNA. E' inoltre ancora sconosciuto se meccanismi di regolazione traduzionale simili agiscono anche a livello di altri geni chiave per la retinogenesi.

Da quanto noto in letteratura i principali fattori in grado di regolare la traduzione legando il 3'UTR possono essere microRNA (miRNA) e proteine che legano l'RNA (RBP). Nel mio lavoro di tesi ho studiato alcune RBP candidate per analizzarne il ruolo nella retinogenesi e per vericare se potes- sero regolare la traduzione dei geni chiave per la specicazione del destino cellulare.

In primo luogo, ho determinato il pattern di espressione di RBP candidate sia nell'embrione intero (ibridazioni in situ whole-mount) sia con risoluzione cellulare nella retina a diversi stadi di sviluppo (ibridazioni in situ su sezio- ne). Scopo di questa analisi è stato identicare RBP espresse in progenitori cellulari retinici non ancora usciti dal ciclo cellulare, e quindi soggetti a re-

Riassunto iii

golazione traduzionale di geni chiave del destino dierenziativo. Da questa analisi sono emerse due proteine più interessanti, Xlin-28A e Nrp-1, che ho ulteriormente caratterizzato con esperimenti di tipo funzionale.

Per vericare se queste proteine sono coinvolte nel dierenziamento, ho con- dotto saggi di guadagno di funzione. Ho innanzitutto generato i costrutti plasmidici per l'espressione di queste proteine, e ho lipofettato i costrutti nelle vescicole ottiche a stadio embrionale 17 (st.17). Successivamente ho caratterizzato i diversi tipi cellulari generati nelle retine lipofettate in em- brioni a st. 42 (stadio di retina matura), utilizzando criteri morfologici o marcatori dei tipi cellulari retinici. Da questi esperimenti è emerso che Xlin- 28A e Nrp-1 alterano in modo diverso le proporzioni dei neuroni retinici. La sovraespressione di Xlin-28A causa un aumento della proporzione di cellule amacrine a discapito dei tipi cellulari più tardivi. La sovraespressione di Nrp-1 invece causa la diminuzione della proporzione di fotorecettori e l'au- mento della proporzione di cellule gliali.

Per capire se queste alterazioni fossero dovute ad eetti delle proteine stu- diate sulla proliferazione cellulare, ho condotto esperimenti di birthdating sugli embrioni lipofettati, tramite iniezione di Bromodeossiuridina (BrdU) a diversi stadi della retinogenesi. Questi esperimenti mostrano che Xlin-28A non ha eetti sulla proliferazione cellulare, ma causa la generazione di cellule amacrine tardive, producendo un fenotipo eterocronico. Nrp-1 invece induce il dierenziamento precoce di tutti i neuroni retinici.

I risultati ottenuti suggeriscono che queste due RBPs hanno ruoli dif- ferenti nell'istogenesi retinica. Nrp-1 probabilmente non è coinvolto nella regolazione della traduzione dei geni chiave per la specicazione dei diversi neuroni retinici. Xlin-28A invece altera il timing della retinogenesi e po- trebbe agire sui geni responsabili del destino cellulare. Ulteriori esperimenti saranno necessari per capire quali sono gli mRNA regolati da questa proteina e caratterizzarne più dettagliatamente la funzione nel controllo dell'istogenesi retinica.