M. TURSI1, F. GUARDA1
1Dipartimento di Patologia Animale, Facoltà di medicina veterinaria, Università di Torino
2Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta
3ASL 5 Collegno (TO)
OSSERVAZIONI PERSONALI
Scopo del presente lavoro è stato quello di diagnosti- care e controllare la frequenza della Visna-Maedi e del- l’Adenomatosi Polmonare in tre macelli ovini situati in provincia di To r i n o .
Gli animali esaminati provenivano da allevamenti pie- montesi, avevano un’età media di quattro anni ed erano stati regolarmente macellati in quanto non presentavano alcun sintomo di malattia.
Complessivamente dal Dicembre 1998 al Maggio 2002 sono stati esaminati 788 ovini macellati dei quali 115 pre- sentavano lesioni polmonari riferibili alla Maedi, pari al 14,6% e 6 all’Adenomatosi, pari allo 0,8% come eviden- ziato nel relativo grafico (Grafico 1).
I polmoni con lesioni riferibili alle suddette malattie, prelevati al macello, sono stati fotografati e successiva- mente sottoposti a prelievo di campioni di cui una parte è stata fissata in formalina tamponata al 10% per gli esa-
Riassunto
Gli autori riportano i dati raccolti tra il Dicembre 1998 e il Maggio 2002 nel corso di un’indagine condotta in tre macelli ovi- caprini piemontesi, allo scopo di diagnosticare e controllare la frequenza della Visna-Maedi e dell’Adenomatosi Polmonare.
Su un totale di 788 soggetti esaminati, 115 (14,6%) presentavano lesioni polmonari da Maedi e 6 (0,8%) lesioni da A d e n o m a t o s i .
Inoltre su alcuni ovini vivi, provenienti dalle aziende oggetto delle indagini anatomo-patologiche, sono stati eseguiti esami sierologici mediante l’impiego del TEST ELISA. Su un totale di 88 ovini vivi esaminati, 69 (78,4%) erano animali sierologica- mente positivi nei confronti di MVV compresi 12 agnelli di due mesi su 15.
Summary
The autors reported data collected in the period between December 1998 and May 2002 during an investigation on three shoutherhouses of Piedmont, to diagnose and evaluate the frequency of Visna-Maedi and Pulmonary Adenomatosis infections.
On a total of 788 examinated animals, 115 (14,6%) showed pulmonary Maedi lesions and 6 (0,8%) Adenomatosis lesions.
Moreover serologic exams have been performed, on a few alive sheep (n°88) living in the farms object of anatomo-patho- logical survey, by ELISA TEST.
69 (78,4%) animals were seropositive for MVV, included 12 lambs, 2 month old.
GRAFICO 1.
mi istopatologici e immunoistochimici e un’altra parte è stata congelata a -80°C per le indagini di biologia mole- c o l a r e .
Per quanto riguarda la Maedi l’aspetto macroscopico del polmone (Guarda e Mandelli 2002) nella maggior par- te dei casi era quello classico. I polmoni si mostravano cioè aumentati di volume, con consistenza a caucciù, pre- senza nel parenchima di piccoli focolai grigiastri roton- deggianti e dilatazione dell’interstizio (Figg. 1, 2, 3, 4, 5).
Anche i linfonodi polmonari si mostravano aumentati di v o l u m e .
A volte la tipologia dei quadri anatomo-patologici era variabile e strettamente correlata con lo stadio della lesio- ne. Talvolta i polmoni erano normalmente collassati dopo l’apertura della cassa toracica, erano di poco aumentati di peso e non avevano consistenza gommosa, ma presentava- no i caratteristici puntini grigiastri nel parenchima polmo- nare che facevano dunque sorgere il sospetto di infezione da MVV.
FIGURA 1-2-3-4 - Aspetti macroscopici delle alterazioni polmonari da Visna-Maedi. Nelle figg. 2-3-4 sono evidenti le proliferazioni dei follicoli linfoidi.
FIGURA 5 - Sezione di taglio del polmone sulla quale sono evidenti i follicoli linfoidi iperplastici.
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
stagliati, spesso aggregati tra loro in modo da formare grosse zone protrundenti sulla superficie pleurica (Figg.
10, 11). Al taglio l’aspetto era simil lardaceo (Figg. 12, 13, 14). Le trasformazioni neoplastiche a seconda della dimensione potevano alterare la forma e il volume del polmone. Quando l’estensione delle lesioni era molto pronunciata, al centro, si notava un fenomeno necroti- co. Macroscopicamente, in alcuni casi, sono state osser- vate metastasi ai linfonodi mediastinici e in un caso an- che al fegato e al miocardio. All’esame istopatologico le alterazioni erano rappresentate dalla proliferazione in senso neoplastico dell’epitelio alveolare e bronchiolare.
Le cellule epiteliali si strutturavano in arborizzazioni anomale, formazioni di tipo acinoso e papillare o in ce-
FIGURA 6 - Polmone: parenchima completamente punteggiato da folli- coli linfoidi iperplastici. E.E, piccolo ingrandimento.
FIGURE 7-8 - Polmone: polmonite interstiziale e particolare dei follicoli linfoidi iperplastici. E.E, medio ingrandimento.
Figura 7
Figura 8
FIGURA 9 - Polmone: polmonite interstiziale e iperplasia delle cellule muscolari e alveolari. E.E, forte ingrandimento.
GRAFICO 2.
Figura 10
FIGURE 10-11-12-13-14 - Aspetti macroscopici delle alterazioni da ade- nomatosi nel polmone.
Figura 11
Figura 12
Figura 13
Figura 14
ticorpi verso il virus Visna-Maedi, utilizzando un metodo ELISA “capture”, reazione immunoenzimatica basata sul- la capacità di un AcM adsorbito a fase solida di seleziona- re e legare il virus ottenuto da coltura di tessuto inattivato.
PROCEDURA ELISA
La reazione è stata eseguita in piastre microtiter adatte per saggi ELISA (NUNC maxisorp a fondo piatto), con volumi di 50 µl per ogni reagente.
L’adsorbimento dell’anticorpo monoclonale (AcM 1A7), opportunamente diluito in tampone carbonato-bi-
Figura 15
Figura 16
Figura 17
FIGURE 15-16-17 - Polmone: proliferazioni delle cellule bronchiali ed alveolari. E.E, medio ingrandimento.
FIGURA 18 - Linfonodo mediastinico: metastasi da adenomatosi. E.E, forte ingrandimento.
FIGURA 19 - Miocardio: metastasi da adenomatosi. E.E, medio ingran- dimento.
carbonato 0,05 M, pH 9,6, è stato ottenuto mediante incu- bazione per una notte a +4°C.
Le fasi di lavaggio tra ogni incubazione sono state ese- guite con tampone fosfato 0,01 M, pH 7,4 contenente Tween 20 allo 0,05 (PBS-T). Successivamente veniva ag- giunto l’antigene VM inattivato che si legava al monoclo- nale specifico usato per l’adsorbimento.
I sieri sono stati saggiati alla diluizione unica 1/50 effet-
tuata in PBS-T con il 4% di siero equino. Quest’ultimo ha lo scopo di eliminare l’inconveniente di “backgroud” cau- sato dalla tendenza delle immunoglobuline ovine ad aderi- re anche se in minima misura alla frazione costante del- l’AcM 1A7.
Il coniugato, costituito da immunoglobuline di coniglio anti-Ig di pecora coniugate a perossidasi, è stato diluito nello stesso tampone descritto precedentemente. Tutte le
Tabella 1
Animali esaminati con test ELISA
Campione Esiti esami sierologici
sangue n° Età animale (ELISA Trapping)
1 Agnello 2 ms ca. POSITIVO
2 Agnello 2 ms ca. NEGATIVO
3 Agnello 2 ms ca. POSITIVO
4 Agnello 2 ms ca. POSITIVO
5 Agnello 2 ms ca. POSITIVO
6 Agnello 2 ms ca. NEGATIVO
7 Agnello 2 ms ca. POSITIVO
8 Agnello 2 ms ca. POSITIVO
9 Agnello 2 ms ca. POSITIVO
10 Agnello 2 ms ca. NEGATIVO
11 Agnello 2 ms ca. POSITIVO
12 Agnello 2 ms ca. POSITIVO
13 Agnello 2 ms ca. POSITIVO
14 Agnello 2 ms ca. POSITIVO
15 Agnello 2 ms ca. POSITIVO
16 F del 2000 POSITIVO
17 F del 2000 POSITIVO
18 F del 1995 POSITIVO
19 F del 1994 POSITIVO
20 F del 1997 POSITIVO
21 F del 2000 POSITIVO
22 F del 1996 POSITIVO
23 F del 2000 POSITIVO
24 F del 1997 POSITIVO
25 F del 1995 POSITIVO
26 F del 1998 NEGATIVO
27 F del 1997 POSITIVO
28 F del 1998 POSITIVO
29 F del 1994 POSITIVO
30 F del 1997 POSITIVO
31 F del 1998 POSITIVO
32 F del 1998 POSITIVO
33 F del 1997 NEGATIVO
34 F del 2000 POSITIVO
35 F del 1998 NEGATIVO
36 F del 1994 POSITIVO
37 F del 1994 POSITIVO
38 F del 1995 NEGATIVO
39 F del 1994 POSITIVO
40 F del 1998 POSITIVO
41 F del 1995 POSITIVO
42 F del 1994 POSITIVO
43 F del 1997 NEGATIVO
44 F del 1997 POSITIVO
Campione Esiti esami sierologici
sangue n° Età animale (ELISA Trapping)
45 F del 2000 POSITIVO
46 F del 1998 POSITIVO
47 F del 1998 NEGATIVO
48 F del 1995 POSITIVO
49 F del 2000 NEGATIVO
50 F del 1996 POSITIVO
51 F del 1997 POSITIVO
52 F del 2000 POSITIVO
53 F del 1995 POSITIVO
54 F del 1997 POSITIVO
55 F del 1998 POSITIVO
56 F del 1997 POSITIVO
57 F del 1994 POSITIVO
58 F del 1998 NEGATIVO
59 F del 1996 POSITIVO
60 F del 1994 NEGATIVO
61 F del 1995 POSITIVO
62 F del 1998 POSITIVO
63 F del 1997 POSITIVO
64 F del 2000 NEGATIVO
65 F del 2000 POSITIVO
66 F del 2000 POSITIVO
67 F del 1997 POSITIVO
68 F del 1998 NEGATIVO
69 F del 1996 POSITIVO
70 F del 2000 POSITIVO
71 F del 2000 POSITIVO
72 F del 2000 NEGATIVO
73 F del 2000 POSITIVO
74 F del 1998 POSITIVO
75 F del 1998 POSITIVO
76 F del 1997 NEGATIVO
77 F del 1996 POSITIVO
78 F del 1997 NEGATIVO
79 F del 1997 POSITIVO
80 F del 2000 NEGATIVO
81 F del 1996 POSITIVO
82 F del 1997 POSITIVO
83 F del 1998 POSITIVO
84 F del 2000 POSITIVO
85 F del 1998 NEGATIVO
86 F del 1995 POSITIVO
87 M del 2000 POSITIVO
88 M del 2001 POSITIVO
F: femmina - M: maschio.
fasi di incubazione erano protratte per 1h in termostato a 37°C in lenta rotazione continua su supporto inclinato.
La soluzione substrato consisteva in acido ortofenilen- diammina (OPD) e perossido d’idrogeno.
La densità ottica (D.O.) del prodotto colorato, svilup- pato dalla reazione enzimatica, è stata valutata dopo c.a.
20 minuti, ad occhio nudo e strumentalmente (λ=492nm), ed interpretata in riferimento al risultato fornito dai sieri di referenza positivo e negativo, inseriti in ogni piastra.
I risultati sierologici ottenuti hanno permesso di rilevare un livello di sieropositività pari al 78,4% (Grafico 3).
CONSIDERAZIONI E CONCLUSIONI
Dalla prima segnalazione di Caporale e coll. (1982) del- la Visna-Maedi in Italia, nel nostro paese si sono succedute diverse segnalazioni riguardo la presenza della malattia ne- gli allevamenti. Nel 1983 Guarda e coll. hanno segnalato il primo caso di Visna in una pecora presentandone le altera- zioni nervose.
Nel 1984 Guarda et al. in una ricerca presso il macello di Torino hanno dimostrato la presenza della Maedi nel 3,7% e l’Adenomatosi nell’8,7% dei casi.
In Piemonte altre ricerche al macello sono state eseguite da Gula (1985) e Saglia (1986) che hanno riscontrato le- sioni da Maedi nel 4,9% e da Adenomatosi nel 6,8% degli animali esaminati.
Tolari e coll. (1991) in una indagine effettuata nel Nord Italia hanno posto in relazione gli aspetti anatomo-istopa- tologici della Maedi con l’isolamento del virus.
Nel 1992 interessante è stata la segnalazione di Cravero e Nervi sulla contemporanea presenza di Maedi e Adeno- matosi in una pecora. Inoltre Braca et al. (1992) hanno in- fettato sperimentalmente degli ovini tramite l’inoculazione di particelle virali, del virus MV per via intratracheale, confermando così la correlazione tra presenza del virus e lesioni polmonari.
Guarda et al. (2000) hanno portato un ulteriore contri- buto sulla frequenza e sulla diagnosi della Maedi nel Nord Italia. Su 537 polmoni esaminati 70 presentavano lesioni riferibili a Maedi (13%).
Molto recentemente Salvatori et al. (2002) su 203 alleva- menti di ovini hanno osservato una positività per Maedi pari al 71,4%.
Sempre nel Nord Italia sono numerosi i lavori sull’iden-
noi osservata, cioè dello 0,8%, notevolmente inferiore a quella riscontrata tempo addietro in Piemonte, si può sup- porre che fattori ambientali, il numero non elevato di ani- mali esaminati e il fattore uomo abbiano giocato un ruolo importante. Noi siamo convinti che soprattutto l’Adeno- matosi sia sottostimata.
Sempre di recente, studi biomolecolari hanno permesso di fare la diagnosi in vita dell’Adenomatosi (Cubeddu et al. 2002). Inoltre sulle pecore sono state messe in evidenza particelle provirali nel latte da Pittau et al. (1999), altret- tanto Cubeddu et al. (2001) hanno trovato il virus dell’A- denomatosi nel sangue e nel latte di mufloni con la malat- tia. Infine Sanna et al. (2001), sempre in Sardegna, hanno isolato il virus associato all’Adenomatosi.
Se consideriamo i risultati delle ricerche da noi compiu- te, si può ipotizzare che nel nostro paese si sia sempre sot- tovalutata l’importanza tanto della Visna-Maedi quanto dell’Adenomatosi Polmonare degli ovini sia a livello istitu- zionale sia da parte dei medici veterinari che operano negli allevamenti.
D’altra parte a livello internazionale tali malattie sono state inserite nella lista B dell’OIE e in Italia sono state considerate nel D.P.R. 30-12-92 n° 556 che ha recepito la Direttiva 91/68 CEE.
Sarebbe pertanto opportuno proporre un piano nazio- nale e regionale di screening sierologici degli allevamenti abbinati ad un analogo screening al macello per monitora- re le due malattie.
Vale la pena di sottolineare come i risultati sierologici ottenuti abbiano permesso di identificare la positività di 12 animali di due mesi su un totale di 15 agnelli esaminati.
Questo dato riveste una grande importanza in quanto di- mostra come nel periodo perinatale gli agnelli siano già in- fetti, verosimilmente da trasmissione materna.
La reazione sierologica utilizzata per l’esame di anticor- pi del virus Visna-Maedi è stata l’ELISA. Nei confronti di questa metodica esistono segnalazioni che riportano una maggiore sensibilità ed una migliore capacità di evidenzia- re anticorpi precoci rispetto ad altri metodi sierologici classici come ad es. AGID o FdC. (Vitu et al. 1982).
Infatti la capacità dell’ELISA di evidenziare il siero di animali infetti prima che si manifestino i sintomi clinici della malattia è indubbiamente una caratteristica rilevante nel caso si vogliano affrontare programmi di eradicazione.
Altrettanto le indagini immunoistochimiche e di biolo- gia molecolare sulla terza palpebra, anch’essa organo bersaglio della Maedi-Visna, possono apportare un con- tributo alla diagnosi preclinica dell’infezione (Capucchio et al. 2003).
La presenza del retrovirus della Visna-Maedi, dedotta dal- l’evidenziazione di anticorpi verso l’antigene specifico, è già stata segnalata in Italia negli anni scorsi. Indagini epidemio- logiche eseguite su parti del territorio nazionale indicano una diffusione notevole della malattia (Foglini et al. 1981, Contini et al. 1982, Caporale et al. 1983, Tolari et al. 1984).
Anche i risultati emersi dal nostro studio, seppur ese- guito su un numero ridotto di campioni ma comunque av- valorati da esami anatomo-isto-patologici, suggeriscono che sarebbe importante considerare questa malattia in un adeguato programma di prevenzione
Ringraziamenti
Si ringraziano vivamente per l’aiuto prestato i Dottori: C.
Altilia, L. Bunino, D. Fracchia, L. Giacone e C. Rey dell’A- SL 5 (Collegno-TO).
I n o l t re un grazie va anche ai responsabili dei macelli e agli allevatori interessati da questo studio.
Parole chiave
Ovini, lentivirus, patologia, sierologia.
Key words
Sheep, lentivirus, pathology, serology.
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