INTRODUZIONE ALLA PARTE SPERIMENTALE

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INTRODUZIONE ALLA PARTE

SPERIMENTALE

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40 La glicoproteina-P (P-gp) rappresenta uno dei principali target sui quali, negli ultimi anni, la ricerca si è focalizzata maggiormente. Questa è un trasportatore di membrana appartenente alla superfamiglia delle proteine ABC. Tali trasportatori,sono ”pompe” con attività ATPasica che necessitano ,quindi , di una fonte di energia rappresentata dall’ATP per poter estrudere gli xenobiotici dalla cellula. Tale proteina è espressa in numerose barriere biologiche (BEE e placenta). Svolge essenzialmente un’azione protettiva poiché, riconoscendo numerose tipologie di substrati (sostanze tossiche e xenobiotici), ne determina l’estrusione dai distretti anatomici. È certamente uno dei principali fattori che limitano l’accumulo dei farmaci a livello del loro sito d’azione rappresentando un enorme ostacolo per il trattamento di tumori e malattie neurodegenerative (Parkinson,Alzheimer,Epilessia). Infatti, oltre al ruolo nella multidrug resistance, i cambiamenti e le anomalie nell’espressione e nella funzione della P-gp sono fattori determinanti nell’eziologia e nella patogenesi di numerose malattie neurodegenerative.

In patologie quali Alzheimer (AD) ed il Parkinson (PD) la P-gp può risultare scarsamente attiva o espressa in modo inadeguato a livello cerebrale. Tale condizione potrebbe aggravare il quadro patologico neurodegenerativo a causa di un aumentato accumulo di aggregati β-amiloidi nel SNC, come nel soggetto affetto da AD, o di tossine ambientali, come nel malato di Parkinson.

Recentemente è stata dimostrata l’esistenza di una correlazione tra una diminuita funzionalità della P-gp e la formazione di placche amiloidi nell’AD. Tale riduzione funzionale favorisce anche l’accumulo di tossine ambientali nel PD.

Ultimamente la funzione e l’espressione della P-gp sono state caratterizzate utilizzando le tecniche di “imaging” che si basano sulla tomografia ad emissione di positroni (PET). Tali tecniche potrebbero essere di grande utilità nello sviluppo di nuovi farmaci.

Inoltre, il monitoraggio non invasivo della P-gp consentirebbe di valutare l’efficacia di nuovi modulatori sulla glicoproteina.

Fino ad oggi la maggior parte dei radiotraccianti utilizzati nella PET sono stati sviluppati per legare fortemente e reversibilmente un determinato target biologico. I radiotraccianti che presentano queste caratteristiche sono definiti radioligandi.

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41 Per essere sfruttato nelle tecniche di “imaging”, un radioligando deve possedere alcune caratteristiche fondamentali :

 Capacità di diffusione attraverso la BEE

 Alta affinità relativa alla densità del target

 Elevata stabilità metabolica a livello cerebrale (non deve dare origine a radiometaboliti)23,24

Tra queste caratteristiche la più importante è, sicuramente, la capacità di diffondere attraverso la BEE.

I radioligandi utilizzati per la PET sono generalmente molecole druglike che riescono ad attraversare la BEE esclusivamente per diffusione passiva. Si può favorire questo processo dotando le molecole di due proprietà particolari :

1. Peso molecolare inferiore a 500 Da

2. Moderata lipofilicità. Il range ottimale di logD è compreso tra valori di 1,5 e 3,0 (il valore ottimale è ~ 2)

Presso il laboratorio in cui è stata svolta questa tesi di laurea erano stati sintetizzati alcuni derivati di tipo A come potenziali inibitori della P-gp23.

X R

A

B

C R1

Di particolare interesse sono risultati 3 derivati che avevano mostrato una buona attività inibitoria della P-gp. Tale attività è stata valutata in cellule di Caco-2 che iperesprimono la P-gp24.

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42 OMe O N 2 N H OMe OMe OMe 1 O N OMe 3

Dalla tabella si rileva che tutti e tre i composti presentano un’attività dell’ordine del μM.

COMPOSTI [

3

H] VINBLASTINE TRANSPORT INIBITION

EC50 ± SEM (μM) LogP

ATP-ase activation

DERIVATO 1 0,085 ± 0,02 5,5 No

DERIVATO 2 0,085 ± 0,05 2,1 Yes

DERIVATO 3 0,08 ± 0,01 6,9 No

In particolare, i composti 1 e 3 manifestano la capacità di inibire l’attivazione della pompa ATPasica mostrando un probabile meccanismo di inibizione di tipo non trasportato. I valori di logP indicano che tali composti non sono dei buoni lead per lo sviluppo di radioligandi utilizzabili in uno studio di imaging25,26,27.

Il composto 2 sembra essere dotato di logP ottimali ma provoca l’attivazione dell’ATPasi comportandosi da inibitore trasportato della pompa.

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43 Tenendo presente i risultati biologici dei derivati precedentemente sintetizzati, in questo lavoro di tesi è stata progettata la sintesi di molecole:

 capaci di interagire con la P-gp a basse concentrazioni.

 dotate di buona biodisponbilità (logP ~2)

 capaci di interagire irreversibilmente con la P-gp25,26,27.

In particolare sono stati sintetizzati i composti :

NH N H N N R R = H 4a cLogP = 1.79 R = CH₃ 4b cLogP = 1.65

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44 OMe N H Ar

5 a-c

a b c Ar N N H N N CH₃ N N cLogP 2.91 2.55 2.94

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SCHEMA 1

Il composto 9 è stato ottenuto sottoponendo ad amminazione riduttiva l’anilina 6 e la 2-nitro-benzaldeide 7. Successivamente, la miscela E/Z di immina 8 ottenuta è stata ridotta utilizzando una soluzione acquosa di NaBH4 in ambiente alcolico per MeOH.

Il gruppo nitro del composto 9 è stato successivamente ridotto ad ammino-gruppo attraverso una idrogenazione catalitica in presenza di Pd/C 10% in ambiente alcolico per EtOHass. È stato cosi ottenuto il composto 10.

Il composto 10 è stato sottoposto ad un’ulteriore amminazione riduttiva con due aldeidi commerciali differenti :

1. la 2-imidazol-carbossialdeide 11a

2. la 1-metil-2-imidazol-carbossialdeide 11b

Sono state ottenute le miscele E/Z costituite dalle immine 12a e 12b.

Entrambe le immine sono state ridotte, in ambiente alcolico per MeOH, utilizzando una soluzione acquosa di NaBH4.

Quest’ultima reazione ha permesso di ottenere i grezzi dei composti desiderati 4a e

4b.

L’isolamento del composto 4a è stato effettuato tramite purificazione per cromatografia.

Il composto 4b è stato isolato attraverso una purificazione per cristallizzazione Et2O/AcOEt.

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SCHEMA 1

NH₂

+

NO₂ N CHO NO₂ I 6 7 8 NH N N N R IV NH N H N N R V NO₂ NH

+

N N OHC R II 9 10 NH₂ NH III R = H 11a R = CH₃11b 12 a-b E/Z E/Z R = H 4a R = CH3 4b

Reagenti e condizioni I : EtOH, riflusso, 24h;

II : NaBH4, MeOH/H2O, t.a., 3h;

III : H2, Pd/C, EtOHass., t.a., 12h

IV : EtOH, riflusso, 24h;

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SCHEMA 2

Il composto 14 è stato ottenuto secondo lo SCHEMA 3. Il composto 13 è stato ottenuto secondo lo SCHEMA 4.

Il composto 13 è stato solubilizzato in DMSO. A questa soluzione ne è stata, poi, aggiunta un’altra di KOH/DMSO. La miscela ottenuta è stata lasciata in agitazione per 15 min. . Trascorso tale periodo, è stata aggiunta la 2-(clorometil)pirimidina 14. Il tutto è stato lasciato in agitazione a t.a. per 12h. Successivamente, è stato ottenuto il grezzo del composto finale 5c, il quale è stato isolato attraverso una purificazione per cromatografia.

Il composto 13 è stato sottoposto ad una reazione di amminazione riduttiva con le aldeidi imidazolica 11a e metil-imidazolica 11b.

Così sono state ottenute le rispettive miscele E/Z 15a e 15b.

Quest’ultime sono state sottoposte ad una riduzione per idrogenazione catalitica grazie alla quale è stato possibile ottenere i rispettivi composti finali 5a e 5b.

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SCHEMA 2

NH₂ OMe 13 N OMe N N R 5c N H OMe N N N H OMe N N R 15a,b E/Z R = H 5a R = CH3 5b N N CHO R R = H 11a R = CH3 11b I II III N N Cl 14

Reagenti e condizioni I : EtOH, riflusso, 24h;

II : NaBH4, MeOH/H2O, t.a., 3h;

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SCHEMA 3

La 2-cloro-acetamidina cloridrato 19 è stata sottoposta a reflusso in un bagno di ghisa con l’1,1,3,3-tetrametossipropano 20 e CH3CN. Abbiamo così ottenuto il

composto voluto,ovvero,la 2-(clorometil)pirimidina 14.

NHHCl NH₂ Cl

+

MeO OMe OMe OMe N N Cl I 19 20 14

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SCHEMA 4

I composti 15a,b e 5a,b,c sono stati sintetizzati secondo lo SCHEMA 2.

Il composto 17 è stato ottenuto facendo reagire il 3-metossi-benzilcloruro 13 con PPh3 in presenza di CH3CN.

Il metossibenzil(cloro)trifenilfosforano ottenuto 17 è stato successivamente sottoposto ad una reazione di Wittig con la 2-nitro-benzaldeide 7.

Ciò ha consentito la formazione della miscela E/Z stilbene 18.

In seguito, il nitro-gruppo del composto 18 è stato ridotto ad ammino-gruppo attraverso una reazione di riduzione catalitica utilizzando H2 e Pd/C.

Il composto 13 ottenuto è stato utilizzato per condurre le successive reazioni mostrate nello SCHEMA 2.

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SCHEMA 4

OMe NH₂ OMe NO₂ 18 13 II III OMe Cl

+

PPh₃ PPh3 + Cl -OMe

+

CHO NO₂ I 7 16 17 E/Z

Reagenti e condizioni I : CH3CN, reflusso, 12h;

II : CH3CN, DBU, reflusso, 12h;