INTRODUZIONE ALLA PARTE
SPERIMENTALE
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imprevedibile, nonostante gli enormi progressi fatti sia nella diagnosi che nelle chemio- e radioterapia. Nell’ultimo decennio, numerose evidenze sperimentali hanno permesso di identificare il recettore tirosin-kinasico (RTK) e il sistema di trasduzione del segnale che segue la sua attivazione come due fattori chiave coinvolti sia nell’iniziazione che nel mantenimento del tumore.
In particolare la via PI3K/Akt è coinvolta nella regolazione di numerose funzioni cellulari quali la progressione del ciclo cellulare, ma anche la migrazione, l’invasione tumorale e l’angiogenesi. L’attivazione di tale via garantisce la sopravvivenza e la trasformazione in cellule maligne non solo nel glioblastoma multiforme ma anche in numerosi altri tipi di tumori (prostata, melanoma).38-40
L’inibizione dell’attività di Akt stimola invece l’apoptosi in differenti tipi cellulari. L’enorme potenziale terapeutico della via Akt è sottolineato anche dal fatto che questo enzima risulta costitutivamente attivato nel 70% dei gliomi 41,42 e contribuisce sia alla progressione della patologia che all’insorgenza della farmaco-resistenza.
Akt, per essere attivata necessita di una doppia fosforilazione su due residui aminoacidici treonina 308 (Thr308) e serina 473 (Ser 473). La chinasi responsabile della prima fosforilazione a livello di Thr308 è la PDK1. Mentre la Ser473 sembra essere fosforilata da una seconda chinasi, la PDK2.
A seguito della sua attivazione, Akt fosforila numerosi substrati implicati nei processi cellulari (come crescita, proliferazione e sopravvivenza cellulare).
L’iperattivazione di questa via sembra essere attribuibile o ad una carente espressione di PTEN, un oncosoppressore che limita la fosforilazione di Akt, o ad una perdita della sua funzionalità43 con conseguenti effetti sulla proliferazione e apoptosi cellulare, nonché sulla migrazione ed invasione tumorale.44
Negli ultimi anni la ricerca di molecole capaci di interagire con bersagli farmacologici presenti in questo complesso sistema di trasduzione del segnale ha portato allo sviluppo di inibitori che hanno come target le chinasi PI3K, PDK1 e Akt.
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Figura 28: Schema di regolazione della via PTEN/PI3K/Akt/ e bersagli farmacologici.
Tra i numerosi inibitori di PDK1 descritti in letteratura alcuni sono caratterizzati dalla presenza nella loro struttura molecolare di una porzione indolonica.
In particolare nel 2006 ricercatori della Bayer Schering Pharma AG progettarono il derivato BX-517 che in vitro ha mostrato buone proprietà inibitorie nei confronti di PDK1 (IC50 = 0.52 µM). Questo derivato presenta anche un’attività inibitoria nei confronti di Akt.
Figura 29: Struttura di BX-517.
L’elevata potenza enzimatica di questo composto è però accompagnata da un basso profilo farmacocinetico e da una bassa solubilità.
RTK PI3K PIP2 PIP3 PTEN PDK1/2 AKT HIF-1α VEGF mTOR P70S6 p21 Angiogenesi Progressione cellulare FKHR p27 MDM2 IKK p53 Sopravvivenza cellulare NFKB MMP2 Migrazione invasione Wortmannin BX-517 A-443654 N H O N H NH O N H2 BX-517
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presenta un’elevata affinità per il sito di legame dell’ATP presente su Akt.
Figura 30: Struttura di A-443654.
E’ un inibitore reversibile competitivo dell’ATP, che induce una riduzione della fosforilazione di Akt con un meccanismo dose-dipendente.
La comprensione della complessità biologica delle neoplasie ha spinto molti ricercatori a sviluppare nuovi farmaci capaci di interagire simultaneamente con più bersagli considerati rilevanti per la genesi e progressione della patologia tumorale. L’applicazione di questo criterio nella progettazione di nuove molecole capaci di agire a più livelli sulla via di Akt potrebbe permettere una maggiore efficacia inibitoria sulle chinasi coinvolte nel processo patologico, con conseguente miglioramento dell’attività terapeutica.
Su questa base, nella mia tesi di laurea sono stati presi in considerazione Akt e PDK1 come bersagli per lo sviluppo di nuovi e più efficaci agenti chemioterapici o come tali o in associazione a chemio- e radioterapie già esistenti.
Prendendo come modelli di riferimento la struttura del composto BX-517, che possiede un nucleo indolonico, e quella del composto A-443654, che presenta una sequenza di nuclei etero-aromatici, sono stati sintetizzati nuovi derivati indolonici (1a-1c, 2a) in cui il sostituente in posizione 3 dell’indolone è costituito da un anello eteroaromatico (tiofene 1a e 2a, imidazolo 1b, metil-imidazolo 1c) e in posizione 5 sono presenti differenti gruppi arilalchilamminici variamente funzionalizzati in modo da incrementare l’affinità per Akt ma anche la solubilità e quindi la biodisponibilità.
N N N H O NH2 N H A-443654
30 5 3 A R N H O R1
Figura 31: Formula generale dei composti indolonici sintetizzati.
In particolare i derivati sintetizzati in questa tesi presentano in posizione 5 il raggruppamento dimetossi-diidroisochinolin-acetamidico e il raggruppamento 3,4-dimetossi-benzilamino-acetamidico e in posizione 3 rispettivamente il tiofene (1a, 2a), l’imidazolo (1b) e il metil-imidazolo (1c). N H O N N N H NH2 A-443654 N H O N H NH O N H2 BX-517
31 2a H3CO H3CO NH NH O N H O H S 1a N H3CO H3CO O NH N H O H S 1c N H3CO H3CO NH O N H O H N N CH3 1b N H3CO H3CO NH O N H O H N H N
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SCHEMA 1
Reagenti e condizioni: I: H2 , Pd/C, EtOH; II: ClCOCH2Cl2, Acetone, DMF; III: K2CO3,
DMF, CH3CN, riflusso; IV: l’opportuna aldeide, EtOH, piperidina, riflusso.
3 4 5 I II III IV N H O2N O N H O N H2 N H O NH O Cl S 1a R= 1b R= N N H 1c R= N N C H3 N H3CO H3CO NH O N H O R N H3CO H3CO NH O N H O
33 nello Schema 1.
Il 5-nitro-2-oxindolo commerciale è stato ridotto nel corrispondente 5-ammino-2-oxindolo tramite idrogenazione catalitica in presenza di Pd/C. L’ammina 3 è stata fatta reagire con il 2-cloroacetilcloruro in acetone, per dare la corrispondente acetammide 4, che è stata sottoposta a reazione di alchilazione con la tetraidroisochinolina in presenza di K2CO3 fornendo l’intermedio 5. La successiva reazione di condensazione dell’intermedio 5
rispettivamente con 2-tiofencarbossialdeide, imidazolo-2-carbossialdeide e l’1-metil-2-imidazolo-carbossialdeide in ETOH assoluto e in presenza di una quantità catalitica di piperidina ha condotto ai prodotti finali corrispondenti 1a, 1b, 1c.
SCHEMA 2
O Cl NH N H O 6 2a I 4 II H3CO H3CO NH NH O N H O NH H3CO H3CO NH O N H O SReagenti e condizioni: I: K2CO3, DMF, 3,4-dimetossi-benzilammina, CH3CN, riflusso; II: 2-tiofencarbossialdeide, EtOH, piperidina, riflusso.
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Il composto finale 2a è stato ottenuto seguendo la procedura sintetica illustrata nello Schema 2.
L’acetammide 4 ottenuta seguendo la procedura sintetica riportata nello Schema 1, è stata sottoposta a reazione di alchilazione con la 3,4-dimetossi-benzilammina in presenza di K2CO3 fornendo l’intermedio 6.
La successiva reazione di condensazione dell’intermedio 6 con la 2-tiofencarbossialdeide in EtOH assoluto ed in presenza di una quantità catalitica di piperidina ha condotto al prodotto finale 2a.
I composti sintetizzati saranno sottoposti a saggi farmacologici per valutare il loro effetto inibitorio sulla proliferazione cellulare, apoptosi e fosforilazione di Akt da soli o in combinazione con radioterapia e temozolomide in linee cellulari di glioblastoma umano.
