71
2-SCOPI DELLO STUDIO
Gli scopi della presente tesi sono stati quelli di confermare la diagnosi in bambini con sospetta Sindrome da insensibilità all’ormone della crescita e di stabilire se mutazioni genetiche a livello dell’asse GH – IGF-I possano essere considerate come la causa della patologia in esame.
Nello specifico è stata effettuata un’attenta valutazione clinica ed endocrinologica per ricavare informazioni utili ad indirizzare la successiva scelta dei geni da analizzare.
La diagnosi eziologica è fondamentale per la successiva gestione clinica del paziente e per la scelta del trattamento (rhGH o rhIGF-I).
Scopi secondari sono stati quelli di:
dimostrare che bambini affetti da bassa statura idiopatica possono, in realtà, avere un’alterazione genetica che causa resistenza all’ormone della crescita
sottolineare la necessità di ulteriori approfondimenti diagnostici e di studi molecolari dei geni che regolano l’asse GH – IGF-I in bambini con bassa statura idiopatica e deficit primitivo di IGF-I.
72
3-PAZIENTI E PROTOCOLLO DI STUDIO
3.1 Pazienti
In questo studio sono stati valutati 6 pazienti (5 maschi e una femmina) di età compresa tra 7,5 e 14 anni, che si sono rivolti alla Clinica Pediatrica di Pisa, Centro Regionale di riferimento di Endocrinologia Pediatrica, per bassa statura, da Luglio 2012 a Gennaio 2013. Dei soggetti presi in esame uno, di origine russa, è stato adottato all’età di 4 anni.
I soggetti da includere nello studio sono stati selezionati sulla base dei seguenti criteri:
- Bassa statura (altezza < -2 DS) e curva di crescita costantemente al di sotto del 3° percentile
- Picco di GH > 10 ng/ml in almeno due diversi test di stimolo per questo ormone
- Valori di IGF-I sierico < -2 DS
Sono stati esclusi dallo studio pazienti che presentavano condizioni patologiche tali da interferire con la normale crescita staturale, nonostante l’appropriata secrezione di GH (patologie tiroidee, celiachia, stati di denutrizione, malattie croniche epatiche e renali, particolari sindromi cromosomiche).
73
3.2 Protocollo di studio
3.2.1 Valutazione clinica
Tutti i pazienti sono stati sottoposti ad un’attenta valutazione clinico-auxologica. Nello specifico è stata raccolta l’anamnesi fisiologica e patologica prossima e remota del bambino e dei familiari, con particolare attenzione al periodo perinatale, alla crescita staturale e allo sviluppo puberale. Inoltre è stata ricostruita la curva di crescita, con calcolo della velocità di crescita e del target genetico.
I pazienti sono stati sottoposti a radiografia del polso e della mano non dominanti per valutare l’età ossea.
3.2.2 Valutazione endocrinologica
Di ogni soggetto è stato dosato il GH basale ed è stata valutata la secrezione dell’ormone in seguito alla somministrazione di due diversi stimoli farmacologici. Inoltre è stato eseguito il dosaggio dell’IGF-I basale. 5 bambini sono stati sottoposti al test di generazione dell’IGF-I. All’inizio del test e 12 ore dopo l’ultima iniezione di rhGH sono stati eseguiti i dosaggi di IGF-I e IGFBP-3 in 3 pazienti, mentre è stato eseguito solo il dosaggio di IGF-I negli altri 2 pazienti sottoposti al test.
74 3.2.3 Valutazione genetico-molecolare
Su tutti i pazienti è stata eseguita l’analisi molecolare del gene GHR. Inoltre, di 4 soggetti, è stato sequenziato anche il gene IGF1.
Consenso informato
Il consenso informato è stato ottenuto dai genitori di ciascun paziente prima di ogni esame e all’inizio di questo studio.
75
4-METODI
4.1 Valutazione clinica
La statura dei pazienti è stata misurata con uno statimetro montato a muro ed espressa sia come valore reale misurato in cm, sia come DS rispetto alla media per età, sesso e razza. Sono state raccolte anche le precedenti misurazioni della statura, ad intervalli di tempo di circa 6 mesi, in modo da ricostruire la curva di crescita completa sulle tavole dei percentili di Tanner [108].
La velocità di crescita, espressa in cm/anno, è stata calcolata utilizzando la seguente formula:
h2 (cm) - h1 (cm) intervallo di tempo (mesi)/12
Inoltre è stata espressa anche come DS per l’età cronologica e il sesso, in accordo con i valori di Tanner et al. [108].
Lo sviluppo puberale è stato valutato secondo il metodo di Tanner e Whitehouse [108].
Il target genetico (TH) è stato stabilito in base alla statura dei genitori e al sesso del paziente, utilizzando le seguenti formule:
TH (maschi) = (altezza del padre + altezza della madre) + 13 cm 2
76
TH (femmine) = (altezza del padre + altezza della madre) – 13 cm 2
L’età ossea (EO) è stata valutata secondo il metodo di Greulich e Pyle [109].
4.2 Valutazione endocrinologica
I prelievi di sangue per la misurazione dei parametri biochimici e ormonali sono stati effettuati in condizioni di digiuno tra le ore 8:00 e le ore 11:00 del mattino.
In tutti i pazienti sono state dosate le concentrazioni ematiche dei seguenti ormoni:
GH
IGF-I
In 3 pazienti, inoltre, è stata dosata anche la concentrazione ematica di IGFBP-3.
Il dosaggio del GH è stato effettuato con metodica immunometrica con anticorpi policlonali.
Il GH è stato misurato in condizioni basali e durante almeno due diversi test di stimolo tra i seguenti:
o Test con Insulina rapida (HUMALOG®R fl 100UI/ml – Eli Lilly Italia), somministrata e.v. alla dose di 0,1 U/Kg. Il dosaggio del GH
77
è stato effettuato ai tempi -20, 0 (basale), +20, +40, +60, +80 e +100 minuti, con contemporaneo dosaggio della glicemia.
o Test con Arginina (Arginina Cloridrato 30% S.A.L.F. Spa laboratorio farmacologico), somministrata e.v. in circa 30 minuti alla dose di 0,5 g/Kg. Il dosaggio del GH è stato effettuato ai tempi -30, 0 (basale), +20, +40, +60, +80 e +100 minuti.
o Test con Dopamina (Sinemet® 100 mg + 25 mg cp - MSD), somministrata per os alla dose di 290 mg/m². Il dosaggio del GH è stato effettuato ai tempi -20, 0 (basale), +20, +40, +60, +80, +100 e +120 minuti.
Prima di ogni test è stato effettuato il dosaggio dell’IGF-I sierico con metodo IMMULITE, cioè con una metodica immunometrica in chemioluminescenza a due siti in fase solida. Il pretrattamento del campione è stato ottenuto tramite diluizione interna.
5 soggetti sono stati sottoposti al test di generazione dell’IGF-I, secondo il seguente protocollo: una iniezione sottocute di rhGH (GENOTROPIN Miniquick – Pfizer Italia) alla dose di 0,033 mg/Kg/die, ripetuta per quattro giorni consecutivi alla stessa ora. Prima dell’inizio del test è stato effettuato il dosaggio di IGF-I basale, il quale è poi stato ripetuto il quinto giorno del suddetto test, a 12 ore di distanza dall’ultima iniezione.
78
In 3 soggetti, durante questo test, è stato eseguito anche il dosaggio di IGFBP-3, contemporaneamente al dosaggio di IGF-I (in prima e quinta giornata).
Il dosaggio di IGFBP-3 è stato eseguito con metodica IRMA con anticorpi policlonali.
4.3 Valutazione genetico-molecolare
L’analisi molecolare dei geni GHR e IGF1 è stata eseguita presso il laboratorio di Genetica Medica dell’Ospedale S.Chiara di Pisa.
Il DNA è stato ottenuto da 350µl di sangue intero periferico conservato in EDTA mediante estrazione e purificazione automatica con Biorobot EZ1(QIAGEN), utilizzando il kit commerciale EZ1 DNA blood.
Il DNA così isolato è stato eluito in 100µl di soluzione salina ed è stato sottoposto a reazione di PCR. Per ottimizzare la resa di questa reazione sono stati precedentemente stabiliti due parametri:
- concentrazione di Magnesio, che condiziona l’attività della polimerasi, l’ibridizzazione dei primer e la denaturazione del DNA stampo
79
- temperatura di annealing alla quale si verifica l’appaiamento dei primer alle sequenze complementari del DNA stampo, che dipende dal contenuto in G+C e dalla lunghezza dei primer stessi.
Le temperature di annealing e le concentrazioni di Magnesio che hanno garantito una resa ottimale della reazione per gli esoni di ogni gene sono riportate nelle Tabelle 1 e 2.
Tabella 1. Temperatura di annealing e concentrazione di Magnesio per gli esoni del gene GHR
Esoni 2 3 4 5 6 7 8 9 10-1 10-2 10-3 Temperatura di annealing (°) 52 55 52 52 52 52 55 52 52 52 52 Concentrazione di Magnesio (mM) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
80
Tabella 2. Temperatura di annealing e concentrazione di Magnesio per gli esoni del gene IGF1
Esoni 1 2 3 4 5
Temperatura di annealing (°) 52 52 59 52 52
Concentrazione di Magnesio (mM) 2 2 2 2 2
Le reazioni di PCR sono state condotte utilizzando un termociclatore PTC-100 Peltier Thermal Cycler (BIO-RAD) e seguendo il protocollo della ditta produttrice.
Terminata la reazione, 10µl di prodotto di PCR sono stati sottoposti a elettroforesi su gel di agarosio al 2% per valutare la lunghezza dei frammenti amplificati e verificare così la correttezza della reazione di PCR. I prodotti di amplificazione sono stati purificati utilizzando il kit QIAquick PCR Purification (QIAGEN), seguendo le istruzioni fornite dalla casa produttrice.
La reazione di sequenza è stata condotta utilizzando il Big Dye Terminator v 3.1 Applied Cycle Sequencing kit, contenente tutti gli elementi necessari per la reazione di polimerizzazione, eccetto i primer e il DNA. Per ogni amplificato sono state eseguite due reazioni di sequenza, una con il primer
81
forward e l’altra con il primer reverse. Inoltre i prodotti della reazione di sequenza sono stati purificati utilizzando il Sephadex G50.
L’analisi della sequenza nucleotidica è stata, poi, effettuata con il sequenziatore automatico ABI Prism 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystem), un sistema di elettroforesi capillare automatizzato basato sulla fluorescenza. Per il funzionamento è stato indispensabile utilizzare tre programmi: Data Collection, per la gestione dello strumento, Sequency Analysis Software, per l’elaborazione dei dati e SeqScape Software, per effettuare l’analisi di mutazioni.
