INTRODUZIONE ALLA PARTE SPERIMENTALE

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INTRODUZIONE  ALLA  

PARTE  SPERIMENTALE  

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Lo  scopo  di  questa  tesi  sperimentale  è  quello  di  individuare  nuovi  ligandi  piridin-­‐3-­‐ carbossiammidici  selettivi  per  il  recettore  cannabinoide  CB2.  

In   seguito   alla   scoperta   del   sistema   endocannabinoide,   la   ricerca   in   questo   ambito   finalizzata   per   eventuali   applicazioni   terapeutiche,   è   divenuta   sempre   più   rilevante.   Sono   stati   attualmente   identificati   e   clonati   due   sottotipi   recettoriali   cannabinoidi,   denominati  rispettivamente  CB1  e  CB2.  

Il   recettore   CB1   è   principalmente   espresso   nei   neuroni   del   sistema   nervoso   centrale133  _{con  densità  più  elevate  nell’ippocampo,  cervelletto  e  nello  striato  (Figura}   20);  queste  aree  controllano  l’apprendimento,  la  memoria,  la  percezione  sensoriale,  la   coordinazione   e   il   movimento,   i   ricordi   e   le   emozioni,   la   funzione   ormonale   e   la   temperatura   corporea.   Evidenze   sperimentali   hanno   dimostrato   la   presenza   del   recettore  CB1  anche  in  tessuti  non-­‐neuronali134  quali  il  tessuto  adiposo,  fegato,  tratto   gastrointestinale,  pancreas,  vescica,  polmone,  cuore,  ecc.  

Da   studi   iniziali   sembrava   che   il   recettore   CB2  fosse   espresso   eclusivamente   nelle   cellule   e   nei   tessuti   del   sistema   immunitario   come     milza,   timo   e   tonsille   (Figura   20).135,  136  Recentemente,   è   stato   evidenziato   che   il   recettore   CB2   potrebbe   svolgere   un   rilevante   ruolo   funzionale   nel   sistema   nervoso   centrale,   mediato   primariamente   dalle  cellule  della  microglia;  vari  studi  infatti  hanno  evidenziato  che  la  stimolazione   del   recettore   CB2  blocca   l'attivazione   delle   cellule   della   microglia,   senza   interferire   significativamente  con  il  normale  funzionamento  dei  neuroni  centrali.    

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Figura 20. Principale localizzazione dei recettori CB1 e CB2.  

Per  questo  motivo  negli  ultimi  anni,  il  recettore  CB2  ha  guadagnato  l’attenzione  come   potenziale  bersaglio  per  i  suoi  effetti  immunomodulanti;  è  emerso  infatti  come  target   terapeutico   per   il   trattamento   di   particolari   condizioni   infiammatorie   e   neurodegenerative     come   morbo   di   Parkinson,   morbo   di   Alzheimer,   morbo   di   Huntington,   sclerosi   multipla,   sclerosi   laterale   amiotrofica   (SLA)   ma   anche   infarto,   aterosclerosi,   stati   infiammatori   gastrointestinali   cronici   e   disturbi   epatici.   Inoltre   è   stato  evidenziato  un  importante  ruolo  del  recettore  CB2  in  tumori  di  diversa  origine;   studi  in  vitro  e  in  modelli  animali  hanno  mostrato  che  l'attivazione  del  recettore  CB2   induce   apoptosi,   inibisce   la   crescita   tumorale   e   inibisce   la   neo-­‐angiogenesi;137   _il   meccanismo   di   tale   azione   potrebbe   includere   un   effetto   citotossico   o   citostatico   (Figura  21).  

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Figura 21. Azione dei cannabinoidi su una cellula eteropatica tumorale.

Vari  gruppi  di  ricerca  che  si  occupano  di  "drug  design  and  discovery"  hanno  mostrato,   per   questo   motivo,   un   interesse   sempre   crescente   verso   lo   sviluppo   di   potenti   e   selettivi  CB2-­‐agonisti  privi  degli  effetti  psicotropici  centrali  mediati  dal  sottotipo  CB1.  

All'interno  di  un  programma  di  ricerca  svolto  nel  laboratorio  dove  ho  condotto  la  mia   tesi,  era  stata  precedentemente  sviluppata  una  serie  di  derivati  1,8-­‐naftiridin-­‐4(1H)-­‐ on-­‐3-­‐carbossammidici aventi  struttura  generale A (Figura 22).138-140

Figura 22. Struttura generale dei derivati 1,8-naftiridin-4(1H)-on-3-carbossammidici.

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expressions remained unaffected.34 Therefore cannabinoids prevent blood vessel formation by inhibition vascular endothelial cell migration and survival. Cannabinoids induce apoptosis of tumor cells and suppress proangiogenic factor and MMP production, further blocking tumor growth and angiogenesis.!

Figure 14 Cannabinoid action and the heterotypic cell biology view of cancer.

Inflammatory cytokines, chemokines and lymphocytes represent critical elements of autocrine and paracrine signaling networks involved in tumor growth and metastasis. Tumor-derived chemokines, such as MCP-1 and RANTES, induce leukocyte cell migration into the tumor from the circulation, thus establishing the population of tumor-associated macrophages (TAMs). TAMs respond to the tumor by secreting various inflammatory cytokines including IL-1!, IL-6, and tumor necrosis factor-(TNF)-" which, in turn, promote proliferation of tumor cells, up-regulation of the VEGF gene, induction of COX-2 and prostaglandin E2 (PGE2). VEGF and PGE2 released from tumor cells can then act on endothelial cells causing angiogenesis. TAM may also favor tumor escape from immune surveillance by producing immunotoxin molecules that induce dendritic cell inactivation. Stromal fibroblast fractions, named carcinoma-associated fibroblasts (CAFs), secrete elevated levels of stromal cell-derived factor 1 (SDF-1, also called CXCL12). This cytokine enhances CXCR4 receptor-mediated tumor progression trough recruitment of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) into the tumor mass,

selettivi CB2-agonisti, privi quindi degli effetti psicotropici centrali mediati dal sottotipo

CB1, ha suscitato un interesse sempre crescente presso i gruppi di ricerca che si

occupano di "drug design and discovery".

Nel laboratorio in cui ho svolto la mia tesi sperimentale di laurea, era stata precedentemente sviluppata una serie di derivati

1,8-naftiridin-4(1H)-on-3-carbossammidici aventi struttura generale A (Figura 15).123-125

N N NH R₂ O R₁ O R₃ A

Figura 15. Struttura generale dei derivati 1,8-naftiridin-4(1H)-on-3-carbossammidici.

Questi composti avevano mostrato in generale una significativa affinità per il sottotipo recettoriale CB2 con, in alcuni casi, valori di Ki dell'ordine del

sub-nanomolare. Tale affinità era accompagnata da un elevato grado di selettività rispetto al recettore CB1.

Uno studio di "molecular modeling" (a partire dalla struttura a raggi X della rodopsina bovina come "template" iniziale) accompagnato da uno studio di "docking" (che ha incluso ligandi cannabinoidi quali: WIN55212-2, anandamide e altri svariati ligandi cannabinoidi scelti in letteratura, tra cui una prima serie dei suddetti derivati

1,8-naftiridin-4(1H)-on-3-carbossammidici123 ed alcuni derivati indolici) aveva inoltre permesso di costruire modelli tridimensionali dei recettori cannabinoidi CB1 e CB2 e di

evidenziare le interazioni ligando-recettore determinanti per l'incremento della CB2

-affinità/selettività (Figure 16, 17 e 18).126 In base a questi modelli, le cavità di "binding" di entrambi i recettori sono risultate caratterizzate dalla presenza di una grande tasca lipofila (TM5 e TM6, Figura 17), corrispondente allo spazio occupato dagli anelli naftilico e indolico di WIN55212-2 (Figura 16) e da una tasca lipofila secondaria (TM3 e TM4, Figura 17), corrispondente alla posizione occupata dall'anello morfolinico (Figura 16). Inoltre, è stata evidenziata, nella cavità di "binding" del recettore CB2,

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R1  =            etilmorfolina,  benzile,  p-­‐fluorobenzile,  n-­‐  butile    

R2  =            cicloesile,  4-­‐metilcicloesile,  cicloeptile,  fenetile,                                         p-­‐fluorofenetile  

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In   generale   questi   composti   avevano   mostrato   una   significativa   affinità   per   il   sottotipo   recettoriale   CB2   accompagnata   da   un   elevato   grado   di   selettività   verso   lo   stesso  recettore.  

Saggi   di   binding   utilizzando   il   GTPγS   [35_{S]     e   studi   funzionali   sui   basofili   umani}   avevano  dimostrato  che  questi  derivati  si  comportavano  come  agonisti  nei  confronti   dei  recettori  CB1  e  CB2.141,  142  Inoltre  uno  di  questi  composti,  che  possedeva  un’elevata   affinità   per   il   recettore   CB2   e   un   buon   grado   di   selettività   per   il   recettore   CB1,   ha   mostrato  di  possedere  effetti  antinocicettivi  in  vivo.142  _{Di  maggiore  importanza  è  stata}   l’evidenza   di   attività   antitumorale   del   composto   A1   (figura   23)   in   modelli   sperimentali  di  cancro  al  colon;  il  tumore  è  stato  generato  in  topi  immunodeficienti   mediante   iniezione   sottocutanea   di   cellule   DLD-­‐1,   caratterizzate   da   una   elevata   espressione  del  recettore  CB2.  Come  si  può  osservare  dalla  figura  23,  il  trattamento   peritumorale  con  il  derivato  A1  ha  ridotto  significativamente  la  crescita  del  tumore   del  colon.143  

A1

Figura 23. Struttura del derivato 1,8-naftiridin-4(1H)-on-3-carbossammidico e i suoi effetti sulla crescita del tumore del colon.

N N O O NH N N C H3 O O NH N O N H O O NH R N O R₃ O NH R

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Uno studio di "molecular modeling" (a partire dalla struttura a raggi X della rodopsina bovina come "template" iniziale) accompagnato da uno studio di "docking" (che ha incluso ligandi cannabinoidi quali: WIN55212-­‐2,  anandamide e altri svariati ligandi cannabinoidi riportati in letteratura)123 aveva permesso di costruire modelli tridimensionali dei recettori cannabinoidi CB1 e CB2 e di evidenziare le interazioni ligando-recettore determinanti per l'incremento della CB2- affinità/selettività (Figure 24).144In base a questi modelli, le cavità di "binding" di entrambi i recettori sono risultate caratterizzate dalla presenza di una grande tasca lipofila (TM5 e TM6, Figura 24) e da una tasca lipofila secondaria (TM3 e TM4, Figura 24) dove per il recettore CB2 è stata evidenziata una ulteriore possibile interazione dovuta alla presenza di una serina (S3.31), non presente nel recettore CB1 (Figura 24).

Figura 24. Docking di WIN55212-­‐2 nel recettore CB1 (sinistra) e CB2 (destra).126

Allo   scopo   di   incrementare   la   selettività   e   l’affinità   per   il   recettore   CB2,   successivamente,   sono   state   apportate   modifiche   strutturali   a   livello   del   nucleo   centrale  dei  derivati  a  struttura  generale  A.    

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26 un'area di interazione favorevole nell spazio occupato dal gruppo morfolinico (Figure 16 e 17).

Figura 16. Docking di WIN55212-2 nel recettore CB1 (sinistra) e CB2 (destra).126

Figura 17. Cavità di "binding" del recettore CB1 (sinistra) e CB2 (destra).126

In particolare, per quanto riguarda i derivati 1,8-naftiridin-4(1H)-on-3-carbossammidici, questo studio aveva suggerito che per preservare una buona CB2

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A  tal  fine,  inizialmente,  il  nucleo  1,8-­‐naftiridin-­‐4(1H)-­‐one  è  stato  sostituito  con  quello   1,8-­‐naftiridin-­‐2(1H)-­‐one  sviluppando  perciò  una  serie  di  derivati  1,8-­‐naftiridin-­‐2(1H)-­‐ on-­‐3-­‐carbossammidici  aventi  struttura  generale  B  (Figura  25).    

Figura 25. Struttura generale dei derivati 1,8-naftiridin-2(1H)-on-3-carbossammidici.

Questi   composti   hanno   mostrato   valori   di   affinità   e   selettività   per   il   recettore   CB2   migliori   rispetto   ai   derivati   precedentemente   studiati.   In   particolare,   uno   di   questi   composti   (B1,   Figura   26)   ha   evidenziato   una   attività   antiproliferativa   nei   confronti   delle  cellule  Jurkat  (linfoblasti  T  usati  per  studire  la  leucemia  acuta  dei  linfociti  T)  con   EC50=5.98   μM127  e   in   misura   minore   nei   confronti   della   linea   cellulare   umana   gliobastoma  U87MG.    

  B1  

Figura 26. Struttura del derivato 1,8-naftiridin-2(1H)-on-3-carbossammidico con attività antiproliferativa sulle cellule jurkat.           ! ! 28

naftiridinico è stato rimpiazzato da un nucleo monociclico, ovvero è stata sviluppata una

serie di derivati 1,2-diidro-2-oxo-piridin-3-carbossammidici, aventi struttura generale C (Figura 21).128 N N NH O O N O 1 !!!!!! N N NH O N O O 2 Figura 19. L'N-cicloesil-1-(2-morfolino-4-il-etil)-1,8-naftiridin-4(1H)-on-3-carbossammide 1 (precedentmente pubblicato) è stato scelto come "lead" per lo sviluppo dei nuovi derivati. La sovrapposizione tra il composto di riferimento e l'analogo 1,8-naftiridin-2-(1H)-on-3-carbossammidico 2 (parte destra della figura) evidenzia un soddisfacente "overlap" delle caratteristiche strutturali ritenute importanti per la CB2-affinità, cioè il nucleo centrale lipofilo ed i sostituenti cicloesilico e morfolinico.127

N N O NH R₂ O R₁ B

Figura 20. Struttura generale dei derivati 1,8-naftiridin-2(1H)-on-3-carbossammidici.

C N O NH R₂ O R₁

Figura 21. Struttura generale dei derivati 1,2-diidro-2-oxo-piridin-3-carbossammidici.

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  40  

Inoltre  studi  funzionali  sui  basofili  umani  avevano  evidenziato  che  i  composti  di  tipo   B  si  comportavano  come  agonisti  dei  recettori  CB2.  

Infine,   uno   studio   computazionale   ha   dimostrato   che   la   sovrapposizione   delle   due   strutture   A   e   B   presenta   un   soddisfacente   “overlap”   delle   caratteristiche   strutturali   ritenute   importanti   per   l’affinità   nei   confronti   del   recettore   CB2   e   cioè   il   nucleo   centrale   lipofilo,   il   sostituente   carbossiammidico   in   posizione   3   e   il   sostituente   in   posizione  1  (Figura  27).  

                                                           A                                                                                                              B  

Figura 27. La sovrapposizione di un composto a struttura generale A con l'analogo corrispondente a struttuta generale B evidenzia un soddisfacente "overlap" delle caratteristiche strutturali ritenute importanti per la CB2

-affinità, cioè il nucleo centrale lipofilo, il sostituente carbossiammidico in posizione 3 e il sostituente in posizione 1.  

Come   ulteriore   sviluppo   di   questo   lavoro   di   ricerca,   recentemente,   è   stato   ritenuto   interessante   verificare   se   la   presenza   di   entrambi   gli   anelli   aromatici   del   "core"   centrale   fosse   essenziale   per   il   legame   di   questi   composti   al   recettore   CB2.   A   tale   scopo,   il   nucleo   1,8-­‐naftiridin-­‐2-­‐one   dei   derivati   a   struttura   generale   B,   è   stato   sostituito  con  un  nucleo  piridin-­‐2-­‐one;  sono  stati  perciò  sintetizzati  derivati  1,2-­‐diidro-­‐ 2-­‐oxo-­‐piridin-­‐3-­‐carbossammidici,  aventi  struttura  generale  C  (Figura  28).145  

N N O O NH CH₃ N N O N O O NH N N O N O O NH N O NH O R₂ R C H₃ N O O NH H R N O R2 O NH R ! !

28

naftiridinico è stato rimpiazzato da un nucleo monociclico, ovvero è stata sviluppata una

serie di derivati 1,2-diidro-2-oxo-piridin-3-carbossammidici, aventi struttura generale C

(Figura 21).

(precedentmente pubblicato) è stato scelto come "lead" per lo sviluppo dei nuovi derivati. La sovrapposizione tra il composto di riferimento e l'analogo 1,8-naftiridin-2-(1H)-on-3-carbossammidico 2 (parte destra della figura) evidenzia un soddisfacente "overlap" delle caratteristiche strutturali ritenute importanti per la CB2-affinità, cioè il nucleo centrale lipofilo ed i sostituenti cicloesilico e morfolinico.127

N

N

O

NH

R

O

R

B

Figura 20. Struttura generale dei derivati 1,8-naftiridin-2(1H)-on-3-carbossammidici.

C

N

O

NH

R

O

R

Figura 21. Struttura generale dei derivati 1,2-diidro-2-oxo-piridin-3-carbossammidici.

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  41    

Figura 28. Struttura generale dei derivati 1,2-diidro-2-oxo-piridin-3-carbossammidici.  

Lo   "scaffold"   monociclico   permette   la   corretta   orientazione   del   sostituente   carbossammidico  non  aromatico  in  posizione  3  e  del  sostituente  lipofilo  in  posizione   1  per  l’interazione  con  il  recettore  CB2.    La  figura  29  mostra,  per  i  due  tipi  di  composti   B  e  C,  la  corrispondenza  spaziale  dei  gruppi  ritenuti  importanti  per  l’affinità  verso  il   recettore  CB2.  

Figura 29. Corrispondenza dei gruppi farmacoforici dei derivati 1,8-naftiridin-2(1H)-onici (sinistra) e piridin- 2(1H)-onici (destra).128

I derivati monociclici hanno mostrato valori di binding piuttosto variabili, sia per quanto riguarda il recettore CB1 (valori di Ki da > 10000 nM fino a 43 nM) che per quanto riguarda il recettore CB2 (valori di Ki  da  7900  nM  fino  a  7.8  nM)  con  valori  di  selettività  in  alcuni   casi  significativi.         ! ! 28

naftiridinico è stato rimpiazzato da un nucleo monociclico, ovvero è stata sviluppata una

serie di derivati 1,2-diidro-2-oxo-piridin-3-carbossammidici, aventi struttura generale C (Figura 21).128 N N NH O O N O 1 !!!!!! N N NH O N O O 2 Figura 19. L'N-cicloesil-1-(2-morfolino-4-il-etil)-1,8-naftiridin-4(1H)-on-3-carbossammide 1 (precedentmente pubblicato) è stato scelto come "lead" per lo sviluppo dei nuovi derivati. La sovrapposizione tra il composto di riferimento e l'analogo 1,8-naftiridin-2-(1H)-on-3-carbossammidico 2 (parte destra della figura) evidenzia un soddisfacente "overlap" delle caratteristiche strutturali ritenute importanti per la CB2-affinità, cioè il nucleo centrale lipofilo ed i sostituenti cicloesilico e morfolinico.127

N N O NH R₂ O R₁ B

Figura 20. Struttura generale dei derivati 1,8-naftiridin-2(1H)-on-3-carbossammidici.

C N O NH R₂ O R₁

Figura 21. Struttura generale dei derivati 1,2-diidro-2-oxo-piridin-3-carbossammidici.

"#!$!! %&'()*+,*('-./!0%-1'(%/!!2,(3*+*0%-1'(%/!"203&'(%! ! "4!$!! 5'5(*%6'(%/!72)%&'(5'5(*%6'(%/!5'5(*%8&'(%! "#!$!! %&'()*+,*('-./!0%-1'(%/!!2,(3*+*0%-1'(%/!"203&'(%! ! "4!$!! 5'5(*%6'(%/! 72)%&'(5'5(*%6'(%/! 5'5(*%8&'(%/! ! ,%-%&'(%/!!2,(3*+*,%-%&'(%! ! ! 29 Sulla base dei modelli recettoriali sopra descritti, lo "scaffold" monociclico avrebbe dovuto permettere la corretta orientazione del sostituente carbossammidico non aromatico in posizione 3, in grado di interagire con il residuo non conservato F5.46(197) e del sostituente lipofilo in posizione 1, recante l'accettore di legami a idrogeno, in grado di interagire con il residuo S3.31(112). La sovrapposizione farmacoforica mostrata in Figura 22 (derivati 1,8-naftiridin-2(1H)-onici e derivati

piridin-2(1H)-onici) conferma l'orientazione dei due sostituenti nel modo ipotizzato.128

Figura 22. Sovrapposizione farmacoforica dei derivati 1,8-naftiridin-2(1H)-onici (sinistra) e piridin-2(1H)-onici (destra).128

I derivati monociclici hanno mostrato dei dati di binding piuttosto variabili, sia per quanto riguarda il recettore CB1 (valori di Ki da > 10000 nM fino a 43 nM) che per

quanto riguarda il recettore CB2 (valori di Ki da 7900 nM fino a 7.8 nM). L'affinità e la

selettività di questi composti per il recettore CB2 sono risultate comunque significative,

sebbene inferiori rispetto a quelle dei derivati precedentemente studiati. Il nuovo "scaffold" piridin-2-onico ha conferito però migliori caratteristiche di solubilità a questo tipo di composti, dimostrandosi sicuramente utile per la progettazione e lo sviluppo di CB2-ligandi caratterizzati da una incrementata biodisponibilità.

Studi di "molecular modeling" riguardanti i derivati monociclici a struttra C, hanno rivelato la possibilità di inserire sostituenti in posizione 5 del nucleo piridin-2(1H)-onico. Infatti, come mostrato in Figura 23, proprio in questa zona del sito di binding del recettore CB2, è presente una regione "libera" in grado di accomodare sostituenti più o

meno ingombranti.

R1  =            etilmorfolina,  benzile,  p-­‐fluorobenzile,  n-­‐butile    

  42  

In   seguito,   introducendo   sostituenti   di   varia   natura   in   posizione   5   del   nucleo   piridinico   e   ottenendo   quindi   i   derivati   aventi   struttura   generale   D   (Figura   30),   è   stato   possibile   ottenere   maggiori   informazioni   circa   le   relazioni   struttura-­‐attività   di   questo  tipo  di  composti.    

Figura 30. Struttura generale dei derivati 1,2-diidro-2-oxo-piridin-3-carbossammidici sostituiti in posizione 5.

Nella  Tabella  1  sono  riportati  i  risultati  di  binding  del  composto  di  riferimento  C1  e   dei  composti  D  più  significativi;  dai  risultati  ottenuti  è  evidente  che  la  presenza  del   sostituente  in  posizione  5  determina  in  generale  un  aumento  di  affinità  e  in  qualche   caso  di  selettività  verso  il  recettore  CB2.    

              ! ! 31 Pertanto, è stata progettata e sintetizzata una serie di derivati monociclici sostituiti in posizione 5 con gruppi più o meno ingombranti e dotati di diverse caratteristiche di lipofilicità (Strutture di tipo D, Figura 25).

D N O NH O R₁ R₃ R2

Figura 25. Struttura generale dei derivati 1,2-diidro-2-oxo-piridin-3-carbossammidici sostituiti in posizione 5.

Nei saggi di binding, i derivati di tipo D hanno mostrato dei buoni valori di affinità per il recettore CB2, in particolare nei casi in cui in posizione 5 era presente un

p-metossifenile (Ki = 1.03 nM), un fenile (Ki = 1.22 nM) o un p-fluorofenile (Ki = 2.85

nM). Tali derivati hanno mostrato inoltre degli apprezzabili livelli di CB2-selettività.

RAZI ONALE E SI NTESI CHI M I CA

Sulla base dei risultati precedentemente ottenuti, in particolare per quanto riguarda i derivati aventi struttura di tipo D, è stato ritenuto interessante intraprendere un progetto volto allo sviluppo di una serie di ligandi per i recettori cannabinoidi che presentassero una struttura nuova, ma comunque correlata a quella dei derivati monociclici 5-sostituiti. Tutto ciò, allo scopo di aumentare la diversità chimica delle molecole affini ai recettori cannabinoidi sintetizzate nel nostro laboratorio ed eventualmente di migliorare ancora i livelli di affinità e di CB2-selettività. Il lavoro di questa tesi sperimentale di

laurea è stato dedicato proprio al suddetto progetto.

La "scaffold" di base preso in considerazione è stato quello bifenilico, opportunamente sostituito con appropriati raggruppamenti, in modo tale da "ricalcare" la struttura chimica dei derivati monociclici 5-sostituiti. Sono stati pertanto progettati i nuovi derivati aventi struttura generale E (Figura 26).

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  43   Tabella 1.                   Ki(nM)     R1   R2   CB1   CB2   SI   C1   p-­‐fluorobenzile   H   43   7.8   5.5   D1   p-­‐fluorobenzile   fenile   35   1.2   29   D2   p-­‐fluorobenzile   p-­‐metossifenile   63   1.0   63   D3   p-­‐fluorobenzile   Br   8.8   2.2   4   D4   etilmorfolina   Br   243   65   3.7   D5   n-­‐Bu   Br   23   5.1   4.5   D6   p-­‐fluorobenzile   p-­‐fluorofenile   24   2.8   8.6   D7   etilmorfolina   p-­‐fluorofenile   2734   63   43.4   D8   p-­‐fluorobenzile   Trans-­‐fenilvinile   24   7.9   3.0   D9   p-­‐fluorobenzile   etilacrilato   24.8   13.7   1.8   N R₁ O N H O R₂

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Di   particolare   importanza   con   saggi   di   binding   che   utilizzano   GTPγS   [35_{S],   è   stato}   dimostrato   che   i   composti   D1   e   D2   analoghi   del   derivato   C1   precedentemente   studiato   e   caratterizzati   in   posizione   5   del   nucleo   piridinico,   dalla   presenza   di   un   fenile  (D1)  o  di  un  p-­‐metossifenile  (D2),  possiedono  rispettivamente  attività  agonista   inversa  e  antagonista  neutrale  (Figura  31).  

  D1                                                                                                                          C1                                                                                                                                                D2    

   CB2  agonista  inverso                                                        CB2  agonista                                                                            CB2  antagonista  neutrale      

Figura 31.  

Lo  scopo  della  mia  tesi  è  stato  quello  di  investigare  l’effetto  di  un  metile  in  posizione  6   nei   composti   D   ai   fini   della   affinità,   selettività   ed   attività   sui   recettori   CB2.   In   particolare  durante  la  mia  tesi  sperimentale  ho  sintetizzato  i  composti  E1,  E2  ed  E3   (Figura  32)  caratterizzati  da  un  metile  in  posizione  6  e  in  posizione  5  da  un  bromo  o   da   un   fenile   che   nei   derivati   D   erano   risultati   significativi   per   l’affinità   verso   il   recettore  CB2.  

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I  sostituenti  in  posizione  1  (etilmorfolina  e  p-­‐fluorobenzile)  sono  stati  scelti  sulla  base   dei  risultati  ottenuti  con  i  derivati  precedentemente  studiati  di  formula  generale  A,  B,   C  e  D.  

I  composti  di  tipo   E   sono  stati  da  me  sintetizzati  secondo  le  vie  sintetiche  riportate   negli  Schemi  1  -­‐  4.  

L’acido   2-­‐idrossi-­‐6-­‐metilpiridin-­‐3-­‐carbossilico   commerciale   è   stato   convertito,   come   riportato  nello  Schema  1,  per  riscaldamento  a  80  °C  con  metanolo  e  acido  solforico,   per  24  h,  nel  corrispondente  metil-­‐estere  1;  in  alternativa  il  prodotto  è  stato  ottenuto   anche   dalla   stessa   reazione   condotta   in   microonde   a   90   °C   per   60   minuti   (potenza   200W,  pressione  100  psi,  senza  agitazione).  

Il  trattamento  dell’estere  1  con  cicloeptilammina  e  riscaldamento  a  150  °C  per  48  h   ha  fornito  l’ammide  2.  L’ammide    2  trattata  con  Bromo  a  temperatura  ambiente  sotto   agitazione   per   una   notte,   ha   portato   al   corrispondente   composto   3   bromurato   in   posizione  5,  con  resa  dell’83  %  (Schema  1).  

Come   mostrato   nello   Schema   2,   il   trattamento   del   derivato   3   in   DMF   anidro   con   Cs2CO3  sotto  agitazione  per  1  h  a  temperatura  ambiente    e  successivamente  con    4-­‐(2-­‐ cloroetil)-­‐morfolina  cloridrato  a  50°  C  per  48  h,  ha  portato  ad  un  grezzo  di  reazione   che  per  purificazione  mediante  cromatografia  su  colonna  di  gel  di  silice,  usando  come   miscela   eluente   esano/acetato   di   etile   7:3,   ha   fornito   il   derivato   desiderato   E1   insieme  al  composto  4   sostituito  in  posizione  2.  La  struttura  dei  composti  E1  e  4  è   stata  determinata  sulla  base  dei  dati  degli  spettri  1_{H-­‐NMR  nei  quali  il  multipletto  del  –} CH2  legato  all’azoto  viene  a  cadere  a  campi  più  alti  (ppm  più  bassi)  nel  composto  E1   rispetto  al  segnale  del  multipletto  del  –CH2  legato  all’ossigeno  nel  composto  4  (Figure   33,  34).  

  46     E1     Figura 33. 1H-NMR di E1: (CDCl3) δ (ppm): 9.61 (bd, 1H, NH), 8.58, (s, 1H, H4), 4.37-4.01 (m, 3H, CH2/NCH), 3.80-3.55 (m, 4H, morfolina), 2.75-2.41 (m, 4H, CH2/morfolina), 2.18 (s, 3H, CH3), 2.01-1.18 (m, 12H, cicloeptile).       ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Reagenti e Condizioni:

(i): DMF, Cs2CO3, 4-(2-cloroetil)-morfolina cloridrato, 50°C, 48 h.

Reagenti e Condizioni:

(i): DMF, Cs₂CO₃, 4-(2-cloroetil)-morfolina cloridrato, 50°C, 48h. SCHEMA 2 N H C H3 O Br O NH N Br C H₃ O O NH N O N Br C H₃ O O NH N O + 3 E1 4 i

  47     4   Figura 34. 1H-NMR di 4:  (CDCl3) δ (ppm): 8.54, (s, 1H, H4), 8.00 (bd, 1H, NH), 4.61-4.48 (m, 2H, CH2), 4.28-4.09 (m, 1H, NCH), 3.81-2.69 (m, 4H, morfolina), 2.84-2.75 (m, 2H, CH2), 2.65-2.43 (m, 7H, CH3/morfolina), 2.15-1.18 (m, 12H, cicloeptile).  

Il  composto  E2  p-­‐fluorobenzilsostituito  è  stato  ottenuto  come  riportato  nello  Schema   3,  secondo  una  via  di  sintesi  analoga  a  quella  utilizzata  per  ottenere  il  composto  E1;   anche   in   questo   caso   dal   grezzo   di   reazione   purificato   mediante   cromatografia   su  

! ! ! ! ! ! ! ! ! ! Reagenti e Condizioni:

(i): DMF, Cs2CO3, 4-(2-cloroetil)-morfolina cloridrato, 50°C, 48 h. Reagenti e Condizioni:

(i): DMF, Cs₂CO₃, 4-(2-cloroetil)-morfolina cloridrato, 50°C, 48h. SCHEMA 2 N H C H₃ O Br O NH N Br C H3 O O NH N O N Br C H₃ O O NH N O + 3 E1 4 i

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colonna  di  gel  di  silice,  usando  come  miscela  eluente  esano/acetato  di  etile  7:3,  è  stato   isolato  il  derivato  5  sostituito  in  posizione  2.  

Per  ottenere  i  derivati  5-­‐fenilsostituiti,  il  derivato  3,  come  riportato  nello  Schema  4,  è   stato  sottoposto  ad  una  reazione  di  cross-­‐coupling;  la  reazione  è  stata  condotta  sotto   azoto   impiegando   acido   fenilboronico   secondo   le   condizioni   di   Suzuki,   usando   trifenilfosfina  come  catalizzatore  ed  una  soluzione  acquosa  di  Na2CO3  2M  come  base;   il  Tetrakis  D-­‐trifenilfosfinopalladio  (0)  è  stato  preparato  in  situ  usando  trifenilfosfina   e  palladio  acetato.  La  miscela  è  stata  fatta  reagire  in  microonde  (CEM)  a  110  °C  per  60   minuti  (potenza  200  W,  pressione  100  psi,  solvente  n-­‐butanolo,  sotto  agitazione)  per   ottenere  il  derivato  5-­‐fenilsostituito  6.      

Infine,   il   derivato   6   in   DMF   anidro,   trattato   con   Cs2CO3   sotto   agitazione   per   1h   a   temperatura  ambiente  e  poi  con  4-­‐fluorobenzilcloruro,  a  50  °C  per  48  h,  ha  fornito  un   grezzo  di  reazione  dal  quale,  per  purificazione  mediante  cromatografia  su  colonna  di   gel   di   silice   usando   come   miscela   eluente   esano/acetato   di   etile   7:3,   sono   stati   ottenuti   il   derivato   N-­‐sostituito   desiderato   E3   e   il   corrispondente   derivato   7   sostituito  in  posizione  2.