43
3. RISULTATI E DISCUSSIONE
In questo lavoro sperimentale si è voluto studiare, attraverso un modello in vitro di fermentazione intestinale, il comportamento di alcune specie batteriche del microbiota in relazione al metabolismo della colina. Per raggiungere tale obiettivo, le popolazioni microbiche contenute in feci umane sono state messe in coltura tipo batch con controllo di pH, in anaerobiosi stretta ed a temperatura control-lata, in presenza di colina o di un digerito di carne, confrontati con l’effetto prebiotico dell’inulina. Alcune colture inoltre sono state allestite in presenza di acqua deuterata. Sono stati valutati il cam-biamento della popolazione microbica, il consumo di colina e la produzione di TMA, oltre a misu-rare l’incorporazione del deuterio da parte dei microorganismi.
I substrati presi in considerazione sono stati suddivisi in due gruppi (Tabella 3.1):
1. C1C8: colina e filetto di carne digerito, in combinazione o meno con l’inulina (200 mL); 2. C9C10: colina con inulina in acqua deuterata (D2O) (25 mL).
Nel primo gruppo, sono stati misurati l’evoluzione ed il metabolismo della popolazione microbica dell’ecosistema colonico in risposta alla colina o alla carne digerita confrontate con quella derivata dalla presenza di inulina, il prebiotico aggiunto come controllo positivo, e del solo brodo di coltura base, il controllo negativo, il cui supplemento al terreno base era eventualmente rappresentato dai composti presenti nell’inoculo fecale. È stato inoltre valutato il profilo fermentativo in risposta a di-verse concentrazioni di colina: 1 mM, 10 mM e 60 mM (quest’ultima concentrazione utilizzata da Cracium & Balskus, 2012).
Nel secondo gruppo, è stata osservata la risposta metabolica del microbiota in presenza di colina in un mezzo basale con-tenente acqua deuterata e ad un volume di fermentazione ri-dotto (scale down – da 200 mL a 25 mL) per verificare la pos-sibilità di condurre un test successivo utilizzando colina mar-cata con isotopo C13 da tracciare con la tecnologia FISH-Raman.
Per il saggio in vitro è stato impiegato il metodo di fermenta-zione in coltura di tipo batch, a pH (6,8–7,8) e temperatura (37°C) controllati (Figura 3.1), in anaerobiosi. Durante l’esperimento sono stati effettuati 4 campionamenti dopo 0, 5, 10 e 24 ore di fermentazione dall’inoculo.
Figura 3.1 Confronto tra il chemostato a 200 mL di volume (a sinistra) e quello a 25 mL (a destra).
44
3.1 Verifica dell’applicabilità del metodo analitico per la quantificazione della
colina, e del metodo strumentale GC-MS per la quantificazione della TMA
L’analisi dell’attività metabolica del microbiota intestinale è stata concentrata su due composti in particolare: il consumo di colina libera e la produzione di trimetilammina. Prima di procedere all’analisi della colina e della TMA nei campioni prelevati durante le fermentazioni in coltura di ti-po batch è stato necessario verificare in laboratorio l’applicabilità di un saggio enzimatico ed di un metodo che utilizzava la gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa, ritrovati in lette-ratura per l’analisi della colina e della TMA rispettivamente.
3.1.1 Metodo di determinazione della colina
Per determinare le concentrazioni di colina libera presente all’inizio e alla fine di ogni fermentazio-ne fecale, e quindi per misurare la quantità di colina consumata durante le 24 ore di fermentaziofermentazio-ne (T0-T24) da parte del microbiota intestinale, è stato deciso di impiegare un saggio enzimatico spet-trofotometrico, a partire dal metodo proposto in letteratura da Woollard & Indyk (2000).
La colina presente nei campioni è stata quantificata sulla base della retta di calibrazione costruita misurando l’assorbanza a 505 nm, sviluppata a seguito della reazione enzimatica di 5 soluzioni a concentrazione nota di colina (0,41, 0,82, 1,24, 1,65 e 2,06 mM rispettivamente), previa sottrazione del bianco. È stato necessario allestire diversi test e attraverso i quali è stato possibile stabilire che il saggio deve essere eseguito rapidamente e con soluzioni preparate di fresco a causa della scarsa sta-bilità della colina in acqua pura. Messe a punto le condizioni operative, è stato deciso dunque di
uti-ID_Campione ID_Vessel Substrato
C1 CH1 Colina (1mM)
C2 CH10 Colina (10mM)
C3 CH60 Colina (60mM)
C4 IN Inulina (1%)
C5 BEEF Filetto di carne (1%)
C6 IN+BEEF Inulina (1%) e filetto di carne (1%)
C7 IN+CH60 Inulina (1%) e colina (60 mM)
C8 H2O Acqua (1%)
C9 D2O Acqua (1%) e D2O (50%)
C10 D2O_IN+CH60 Inulina (1%), colina (60 mM) e D2O (50%)
Tabella 3.1 Substrati e nomenclatura utilizzati per distinguere i campioni ed i chemostati (vessels) in cui è avvenuta ogni fer-mentazione tipo batch. C1C8 rappresentano il primo gruppo di ferfer-mentazione in 200 mL di volume finale, C9 C10 il se-condo se-condotto in 25 mL di volume.
45 lizzare le curve di calibrazione riportate in Figura 3.2 e 3.3 con il più elevato coefficiente di corre-lazione e la migliore distribuzione dei punti rispetto alla retta. Inoltre è stato aggiunto un trattamen-to con il reagente PPS resosi necessario dopo aver verificatrattamen-to la presenza di proteine interferenti in alcuni campioni di prova, prelevati da una fermentazione. Una volta ottenute le equazioni delle rette di regressione forzate all’origine (y=αx), la concentrazione di colina in ogni campione è stata calco-lata con la seguente formula:
dove:
α corrisponde alla pendenza della retta di regressione usata per la calibrazione;
1,23 è il fattore di diluizione determinato dal trattamento con PPS;
FDassay è il fattore di diluizione che il campione subisce prima di venir a contatto con il
rea-gente cromogeno nel pozzetto di reazione;
FDvessel è il fattore di diluizione avvenuta durante la fermentazione per effetto dell’aggiunta
di acido e base al mezzo.
Per quantificare la colina libera consumata in 24 ore di fermentazione, è stata calcolata la differenza tra la concentrazione molare di colina al Tempo 0 e quella al Tempo 24:
(Abs)505nm = 0,157 * [Colina] (mM) R² = 0,9921 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0 0,5 1 1,5 2 2,5 (Ab s)505n m Concentrazione colina (mM)
Figura 3.2 Prima retta di calibrazione del saggio enzimatico di ossidazione della colina ottenuta attraverso la misura dell’assorbanza (Abs) alla lunghezza d’onda di 505nm delle 5 soluzioni standard in triplicato, previa sottrazione del bianco.
46 3.1.2 Metodo di determinazione della TMA
Per determinare le concentrazioni di TMA prodotte durante le fermentazioni in coltura batch è stato messo a punto un metodo analitico, descritto in letteratura, mediante analisi dello spazio di testa con la gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS).
La TMA presente nei campioni, dopo la normalizzazione sulla base della risposta dello Standard In-terno (SI), è stata quantificata sulla base di rette di calibrazione costruite misurando lo spazio di te-sta di campioni a concentrazioni di TMA di 1, 10, 20, 50, 100 e 200 uM. Durante i saggi preliminari è stato notato che la risposta analitica cambiava in funzione della concentrazione di TMA ed, aven-do osservato la presenza di campioni sperimentali con concentrazioni anche molto basse, è stato de-ciso di costruire due rette di taratura: una per concentrazioni inferiori a 20 uM e una per quelli com-presi tra i 20 e i 200 μM. La prima retta è stata costruita utilizzando campioni di TMA a concentra-zione nota pari a 1, 10, 20 e 50 μM (forzando la retta sull’origine) (Figura 3.4), mentre per la se-conda pari a 20, 50, 100 e 200 μM (sopra i 200 μM è stata osservata la saturazione della fibra di ad-sorbimento) (Figura 3.5).
La quantificazione è stata eseguita applicando la seguente equazione: dove:
Ratio è il valore dell’area del picco della TMA normalizzata sull’area dello SI, ovvero il rapporto tra l’area della TMA (RT 2,22) e l’area del 2-ottanolo (RT 17,24) corrispondente (Figura 3.6);
m e q corrispondono rispettivamente ai valori del coefficiente angolare e dell’intercetta dell’equazione della retta di taratura della TMA.
(Abs)505nm = 0,113 * [Colina] (mM) R² = 0,9959 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0 0,5 1 1,5 2 2,5 (Ab s)505n m Concentrazione colina (mM)
Figura 3.3 Seconda retta di calibrazione del saggio enzimatico di ossidazione della colina ottenuta attraverso la misura dell’assorbanza (Abs) alla lunghezza d’onda di 505nm delle 5 soluzioni standard in triplicato, previa sottrazione del bianco.
47 Dall’analisi eseguita con l’ausilio del software XcaliburTM
2.1.0, la concentrazione in umoli/L di TMA è stata convertita in mM e corretta per le diluizioni effettuate:
dove:
Ratio = 0,149 * [TMA]1 (uM) + 6,8 R² = 0,986 0 10 20 30 40 0 50 100 150 200 250 Ra tio
Concentrazione TMA (uM)
Ratio = 0,324 * [TMA]1 (uM) R² = 0,957 0 5 10 15 20 0 10 20 30 40 50 60 Ra tio
Concentrazione TMA (uM)
Figura 3.6 Esempio di cromatogramma ottenuto dall’analisi della TMA via GC-MS. Le tre frecce indicano rispettivamente da sinistra a destra i picchi della TMA, dell’etanolo e dell’2-ottanolo.
Figura 3.5 Retta di taratura ottenuta correlando i rapporti delle aree (ratio) verso la concentrazione di 4 soluzioni standard nell’intervallo 20-200 uM, in triplicato. Coefficiente angolare= 0,149; intercetta= 6,8; R2
= 0,986.
Figura 3.4 Retta di taratura ottenuta correlando i rapporti delle aree (ratio) verso la concentrazione di 4 soluzioni standard nell’intervallo 1-50 uM, in triplicato. Coefficiente angolare = 0,324; R2
48
[TMA]1 è la concentrazione uM calcolata dal software sulla base della la retta di taratura
ap-propriata;
FDvial è il fattore di diluizione che il campione subisce prima di esser aggiunto alla vial per
l’analisi al GC-MS;
FDvessel è il fattore di diluizione avvenuta durante la fermentazione per effetto dell’aggiunta
di acido e base al mezzo;
10-3 è il fattore di conversione da uM a mM.
Per aver un’idea più chiara di quanta TMA è stata prodotta in 24 ore di fermentazione, per ogni batch culture è stata calcolata la differenza tra i due valori di molarità (mM) di TMA presenti al tempo 24 e 0:
3.2 Risposta del microbiota intestinale a tre diverse concentrazioni di colina
Parte di questo lavoro sperimentale è stata la valutazione della risposta del microbiota intestinale al-la presenza delal-la colina a tre diverse concentrazioni: 1 mM, 10 mM e 60 mM (quest’ultima concen-trazione già utilizzata in studi precedenti, come quello di Cracium & Balskus, 2012).
Attraverso la tecnica coltura-indipendente di ibridazione in situ con sonde fluorescenti (FISH) di specifiche sequenze del 16S rRNA, nel corso dei tre esperimenti condotti con tre microbiota intesti-nali differenti (3 diversi donatori di feci), è stato possibile misurare l’evoluzione dei batteri totali e delle seguenti popolazioni batteriche: Bifidobacterium spp., lattobacilli ed enterococchi, gruppo dei Bacteroides (comprende la maggior parte delle Bacteroidaceae e Prevotellaceae, alcune Porphyromonadaceae) e dei Prevotella (comprende la maggior parte dei membri del genere Tannerella e del genere Prevotella della classe dei Bacteroidetes), Feacalibacterium prausnitzii, Clostridium cluster XIVa & XIVb (detto gruppo del Clostridium coccoides e dell’Eubacterium rec-tale), Clostridium cluster I & II (detto gruppo del Clostridium histolyticum), Enterobacteriaceae, e gruppo dei Desulfovibrio (comprende la maggior parte dei Desulfovibrionales, escluso Lawsonia, e molti Desulforomonales). Secondo lo studio di Hoyles e McCartney (2009), la sonda che rivela il gruppo delle Bacteroidaceae e delle Prevotellaceae (BAC303) non è in grado di rilevare molte specie batteriche del genere Prevotella, che sono invece rilevate da un’altra sonda (CFB286), pur con sovrapposizioni come mostra la Figura 3.7. È stato comunque deciso di usare entrambe le sonde fluorescenti per poter avere una migliore visione d’insieme di questi gruppi batterici.
49 Grazie alla disponibilità di queste sonde oligonucleotidiche fluorescenti è stato possibile osservare l’evoluzione della densità batterica di diverse popolazioni batteriche, espressa come Log10(cellule/mL), misurata durante le 24 ore di fermentazione (Figure 3.8-3.10 A). La crescita to-tale (ΔT24-T0) per ciascun gruppo batterico, è stata calcolata sottraendo alla densità cellulare misurata
dopo 24 ore quella misurata al momento dell’inoculo. (Figure 3.8-3.10 B).
La densità batterica totale (da 8,21±0,04 a un massimo di 8,4±0,1 Log10 cell/mL) e le popolazioni
batteriche di Bacteroides (da 6,94±0,03 a un massimo di 7,2±0,4 Log10 cell/mL) e di Prevotella (da
7,10±0,03 a un massimo di 7,32±0,07 Log10 cell/mL), di Clostridium cluster I & II (da 3,95±0,06 a
un massimo di 5,0±2,9 Log10 cell/mL) e il gruppo di Desulfovibrio spp. (da 5,43±0,06 a un
massi-mo di 6,7±0,2 Log10 cell/mL) hanno mostrato una crescita maggiore rispetto al controllo negativo e
direttamente proporzionale alla concentrazione di colina inoculata, mentre la popolazione delle En-terobacteriaceae (da 5,18±0,08 a un massimo di 6,9±0,2 Log10 cell/mL) è stata rilevata una crescita
media superiore a circa 1,5 unitá logaritmiche nelle prime 10 ore di fermentazione, indipendente-mente dalla concentrazione di colina, superiore al controllo negativo. Le popolazioni microbiche di Bifidobacterium spp. (da 7,13±0,05 a 7,4±0,4 Log10 cell/mL) e Feacalibacterium prausnitzii (da
6,92±0,06 a 7,0±0,4 Log10 cell/mL), non sono cresciute in modo significativo dopo 24 ore di
fer-mentazione; mentre nel caso del gruppo di lattobacilli ed enterococchi (da 5,3±0,1 a un minimo di 5,1±0,4 Log10 cell/mL), e del gruppo di Clostridium cluster XIVa & XIVb (da 7,59±0,05 a un
mi-nimo di 6,8±0,3 Log10 cell/mL) è stato osservato un decremento nella densità batterica anche se non
Figura 3.7 Membri dell’ordine Bacteroidales rilevati dalle sonde BAC303 e CFB286, a confronto (immagine adattata da Hoyles & McCartney, 2009).
50 significativo, in particolare del gruppo di Clostridium cluster, come quello osservato nel controllo negativo.
Per la maggior parte dei gruppi batterici studiati non sono state evidenziate differenze di crescita si-gnificative in presenza delle diverse quantità di colina. Le curve di crescita hanno mostrano infatti andamenti pressoché coincidenti per il gruppo di Bacteroides e di Prevotella, per Feacalibacterium prausnitzii, per Desulfovibrio spp. e nelle Enterobacteriaceae per tutte le 24 ore di fermentazione, mentre per le altre popolazioni questo avviene solo nelle prime 10 ore.
Figura 3.8 Curve di crescita (A) e ΔT24-T0 (B) misurate per i batteri totali e per i gruppi batterici identificati dalle sonde
Bif164 (Bifidobacterium spp.) e Fpra655 (F. prausnitzii). I valori si riferiscono alle medie delle densità batteriche, espresse co-me Log10 cellule/mL, delle tre ferco-mentazioni avvenute ad opera di altrettanti microbiota intestinali (tre donatori diversi), le barre di errore rappresentano la deviazione standard dalla media.
A B
A B
51
Figura 3.9 Curva di crescita (A) e ΔT24-T0 (B) misurate per i 4 gruppi batterici identificati dalle sonde BAC303, CFB286, Lab158 e Erec482. I valori si riferiscono alle medie delle densità batteriche, espresse come Log10 cellule/mL, rilevate nelle tre fermentazioni avvenute ad opera di altrettanti microbiota intestinali utilizzati per l’inoculo (tre donatori diversi), e le barre di errore rappresentano la deviazione standard dalla media.
A B
A B
A B
52 Successivamente sono state determinate le concentrazioni di colina e TMA nel mezzo di fermenta-zione per verificare le correlafermenta-zione tra consumo di colina e produfermenta-zione di TMA. In presenza di coli-na 1 mM è stato misurato un consumo di 1,2±0,3 mM di colicoli-na con produzione di 1,2±0,4 mM di TMA. In presenza di colina 10 mM è stato misurato un consumo pari a 12,2±6,1 mM di colina e ri-lascio nel mezzo di 13,5±1,7 mM di TMA. Infine, in presenza di colina 60 mM è stato misurato un consumo pari a 38,3±23,3 mM di colina e sono state prodotte 39,2±25,4 mM di TMA. Nel controllo
Figura 3.10 Curva di crescita (A) e ΔT24-T0 (B) misurate per i 4 gruppi batterici identificati dalle sonde EnterbactD, DSV687 e Chis150. I valori si riferiscono alle medie delle densità batteriche, espresse come Log10 cellule/mL, rilevate nelle tre fermentazioni avvenute ad opera di altrettanti microbiota intestinali utilizzati per l’inoculo (tre donatori diversi), e le bar-re di errobar-re rappbar-resentano la deviazione standard dalla media.
A B A B A B A B A B A B A B
53 negativo, non è stata rilevata la presenza di colina e, come ci si aspettava, non è stata evidenziata al-cuna produzione di TMA. La Figura 3.11 mostra come i metabolismi di questi composti siano non solo correlati, ma anche proporzionali alla quantità di colina inoculata a inizio fermentazione, ad eccezione del secondo donatore il cui microbiota, nelle 24 ore di fermentazione, è riuscito a meta-bolizzare solo poco più di 10 mM di colina (con proporzionale produzione di TMA).
Osservando invece le curve delle produzioni medie di TMA durante tutta la fermentazione, mostrate nella Figura 3.12, emerge come in tutti i chemostati la colina sia stata metabolizzata maggiormente tra le 10 e le 24 ore. Questo potrebbe dimostrare che la colina non è utilizzata dai batteri come fonte energetica primaria, e che il suo metabolismo viene quindi attivato dopo che le altre fonti di carbo-nio disponibili sono state utilizzate. Potrebbe altresì trattarsi di un meccanismo di degradazione in-dotto da altri metaboliti, prodotti dal metabolismo primario, oppure causato dallo sviluppo tardivo (o dall’induzione tardiva) dei microrganismi in grado di utilizzare la colina e trasformarla in TMA.
Figura 3.11 Produzione di TMA (a sinistra) e consumo di colina (a destra) da parte di tre differenti microbiota intestinali (tre donatori I, II e III rispettivamente) a confronto. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard dalla media.
Figura 3.12 Produzione media di TMA nel tempo. L’errore è dato dalla deviazione standard di ogni replica biologica,
54 Alla luce di questi risultati si può evincere che la quantità di colina inserita nel mezzo di crescita di partenza non ha inciso sensibilmente sulla composizione e sull’attività metabolica del microbiota intestinale umano, e quindi si può ipotizzare che la degradazione della colina non sia un meccani-smo metabolico a induzione ma probabilmente sono coinvolti enzimi costitutivi dei microrganismi. Tutto ciò rappresenta un’informazione utile anche per l’allestimento di un esperimento successivo, nel quale si vuole impiegare colina marcata con isotopo non radioattivo C13, piuttosto costoso, che può quindi essere disegnato per concentrazioni di metabolita inferiori con conseguente minor inve-stimento economico. Al momento non sono stati riscontrati in letteratura esperimenti che abbiano indagato su questo aspetto, anche per la relativa nuova conoscenza del meccanismo enzimatico co-involto (Craciun & Balskus, 2012). Di particolare interesse inoltre la rilevazione di un microbiota intestinale incapace di trasformare tutta la colina disponibile. Analizzando le popolazioni microbi-che delle batch culture microbi-che hanno fermentato la colina a diverse concentrazioni, è emerso microbi-che tra tutti i gruppi microbici analizzati solo i clostridi del gruppo del Clostridium histolyticum hanno mo-strato una differenza tra i donatori: questi clostridi sono cresciuti in tutte le fermentazioni tranne in quelle inoculate col microbiota intestinale proveniente dal donatore II, dove già dopo 5 ore di fer-mentazione non è stato possibile rilevare alcuna cellula batterica. Ciò suggerisce una correlazione tra il Clostridium cluster I e II e metabolismo della colina. Saranno quindi necessarie ulteriori inda-gini per verificare questa ipotesi. Se la correlazione fra microbiota intestinale e produzione di TMA é stata oggetto di diversi studi, solo nello studio di Cracium & Balskus (2012) e piu recentemente di Romano et al. (2015) sono stati associati gruppi o specie microbiche alla capacitá di metabolizzare la colina. Tra queste, i Bacteroidetes sembrano mancare del gene capace di esprimere il patrimonio enzimatico necessario, ma come in questo studio osservato, Desulfovibrio spp, alcuni clostridi e specie appartenenti alle Enterobacteriacee sono capaci di utilizzare la colina come fonte di carbonio. Tuttavia l’aumento della carica batterica totale farebbe pensare all’implicazione di altri gruppi bat-terici, non analizzati in questo studio.
55
Sub Media TMA (mM) 1 2 3
H2O 0,078 **** BEEF 0,139 **** H2O* 0,160 **** IN+BEEF 0,165 **** IN 0,198 **** CH1 1,275 **** CH10 13,491 **** **** IN+CH60* 29,769 **** **** CH60 39,187 **** **** IN+CH60 46,091 ****
Tabella 3.2 Media delle concentrazioni di TMA prodotta dopo 24 ore di fermentazione, risultati significativamente diversi all’analisi della varianza (p-value<0,05), raggruppati secondo il test post-hoc LSD di Fisher (α=0,05). Le medie, espresse come concentrazioni molari (mM). A colonna 1, 2 o 3 uguale appartengono le uguali produzioni medie di TMA misurate in presen-za dei diversi substrati (Sub). *Substrato in terreno basale composto da D2O (50%).
56
3.3 Evoluzione del microbiota intestinale in presenza di colina e di un digerito
di carne
Studi in topi germfree e studi clinici trasversali nell’uomo hanno suggerito un ruolo del microbiota intestinale nella patogenesi dell’aterosclerosi in pazienti che seguono una dieta ricca in fosfatidilco-lina (le cui fonti alimentari principali sono le uova, il fegato, la carne di manzo e di maiale), attra-verso la formazione del metabolita trimetilammina (TMA) e la sua conversione a livello epatico nel metabolita pro-aterogenico trimetilammina-N-ossido (TMAO) (Wang et al., 2011; al-Waiz et al., 1992). In questo lavoro sperimentale si è voluto osservare l’evoluzione ed il metabolismo del mi-crobiota intestinale in risposta alla presenza di colina (60mM) o di carne, cotta e digerita, da soli od in compresenza con inulina, in confronto con la sola inulina, il prebiotico aggiunto come controllo positivo, e del solo brodo di coltura base, il controllo negativo, il cui supplemento era eventualmen-te rappresentato da composti presenti nell’inoculo fecale.
Attraverso la FISH di specifiche sequenze dell’rRNA 16S, nel corso dei tre esperimenti condotti con tre microbiota intestinali differenti (3 diversi donatori di feci), è stata misurata la variazione del-la densità dei batteri totali e di alcune popodel-lazioni batteriche specifiche. La crescita batterica delle popolazioni analizzate è riportata nelle Figure 3.13-3.17 e 3.19 A. La crescita totale (ΔT24-T0)
espe-ressa in Log10(cell/mL) dopo 24 ore dall’inoculo è riportata nelle Figure 3.13-3.17 e 3.19 B. I batteri totali (Figura 3.13) sono cresciuti in modo significativamente differente nelle fermentazio-ni in cui era stata aggiunta inulina (da 8,19±0,03 a 8,8±0,2 Log10 cell/mL), colina a 60 mM (da
8,19±0,03 a 8,4±0,1 Log10 cell/mL) e la combinazione di questi due substrati (da 8,19±0,03 a
8,7±0,2 Log10 cell/mL). L’inulina ha stimolato la crescita della popolazione batterica totale in tutte
le batch culture entro le prime 10 ore di fermentazione; inoltre è stato evidenziato un calo drastico nella densità batterica in tutte le fermentazioni che avevano il digerito di carne. Quest’ultimo è stato
Figura 3.13 Curve di crescita (A) e ΔT24-T0 (B) misurate per i batteri totali. I valori si riferiscono alle medie delle densità
batteriche, espresse come Log10 cellule/mL, rilevate nelle tre fermentazioni avvenute ad opera dei altrettanti microbiota inte-stinali utilizzati per l’inoculo (tre donatori diversi), e le barre di errore rappresentano la deviazione standard dalla media.
57 difatti l’unico substrato che ha mostrato un decremento nella popolazione batterica (da 8,19±0,03 a 7,9±0,3 Log10 cell/mL), anche più sensibile di quello che è stato visto nel controllo negativo (da
8,19±0,03 a 8,2±0,1 Log10 cell/mL), pur non risultando significativamente diverso da quest’ultimo a
causa della elevata deviazione standard, dovuta alle differenze riscontrate nei diversi microbiota in-testinali.
Nel comportamento della popolazione di Bifidobacterium spp. (Figura 3.14), si notano invece pro-fili fermentativi lievemente diversi rispetto a quelli visti per i batteri totali. Sono stati osservati tre profili di crescita diversi. Il primo è quello dell’inulina: questa fibra ha stimolato la crescita in tutte le fermentazioni, soprattutto in quelle in cui è stata aggiunta come unico substrato di fermentazione (da 7,16±0,07 a 7,9±0,4 Log10 cell/mL), mentre quando presente in combinazione con la colina (da
7,16±0,07 a 7,4±0,4 Log10 cell/mL) o con la carne (da 7,16±0,07 a 7,6±0,5 Log10 cell/mL) il tasso
di crescita è stato leggermente inferiore. Il secondo si è osservato nelle fermentazioni con la colina da sola (da 7,16±0,07 a 7,2±0,4 Log10 cell/mL) e nei controlli negativi (da 7,16±0,07 a 7,0±0,4
Log10 cell/mL) nei quali, dopo 24 ore, la popolazione dei bifidobatteri non aveva subito variazioni
significative rispetto al momento dell’inoculo. Il terzo profilo che si nota è quello osservato dalle batch culture contenenti il digerito di carne (da 7,16±0,07 a 6,8±0,5 Log10 cell/mL): dopo una lieve
crescita iniziale, la densità dei batteri è diminuita drasticamente fino alla fine della fermentazione.
È stato notato che l’evoluzione dei batteri appartenenti al gruppo di Bacteroides e Prevotella è pres-soché simile (Figura 3.15). Si è osservato che nelle fermentazioni in cui vi era stata aggiunta la co-lina a 60 mM in combinazione con l’inuco-lina (da 6,92±0,04 a 7,8±0,3 Log10 cell/mL per Bacteroides
e da 7,11±0,04 a 7,99±0,01 Log10 cell/mL per Prevotella) i profili fermentativi erano quasi identici
a quello del controllo positivo (da 6,92±0,04 a 8,0±0,2 Log10 cell/mL per Bacteroides e da
A B
Figura 3.14 Curve di crescita (A) eΔT24-T0 (B) misurate per il gruppo batterico identificato dalla sonda Bif164. I valori si
riferiscono alle medie delle densità batteriche, espresse come Log10 cellule/mL, rilevate nelle tre fermentazioni avvenute ad opera di altrettanti microbiota intestinali utilizzati per l’inoculo (tre donatori diversi), e le barre di errore rappresentano la deviazione standard dalla media.
58 7,11±0,04 a 8,0±0,2 Log10 cell/mL per Prevotella), durante tutte le 24 ore di fermentazione. Nelle
fermentazioni in cui l’inulina era in compresenza con la carne i gruppi Bacteroides e Prevotella so-no cresciuti in modo analogo nelle prime 10 ore di fermentazione (da 6,92±0,04 a 7,0±0,3 Log10
cell/mL per Bacteroides e da 7,11±0,04 a 7,1±0,3 Log10 cell/mL per Prevotella), trascorse le quali
si è osservato un decremento fino a densità comparabili a quelle osservate in presenza di colina 60 mM da sola (da 6,92±0,04 a 7,2±0,4 Log10 cell/mL per Bacteroides e da 7,11±0,04 a 7,32±0,07
Log10 cell/mL per Prevotella). Infine, nei chemostati a cui vi era stata aggiunta la carne da sola sono
state rivelate crescite batteriche (da 6,92±0,04 a 6,8±0,4 Log10 cell/mL per Bacteroides e da
7,11±0,04 a 6,8±0,3 Log10 cell/mL per Prevotella) anche di mezzo logaritmo nelle prime 10 ore di
fermentazione, paragonabile all’effetto della colina 60 mM, successivamente la densità cellulare ha subito un forte calo raggiungendo valori simili a quelli osservati nel controllo negativo (da 6,92±0,04 a 6,7±0,2 Log10 cell/mL per Bacteroides e da 7,11±0,04 a 6,7±0,2 Log10 cell/mL per
Prevotella). Ciò suggerisce come queste popolazioni batteriche subiscano una forte inibizione in presenza del digerito di carne che non sia neutralizzata o compensata dalla presenza di inulina, pur avendo la fibra stimolatone la crescita nelle prime 10 ore. Questo comportamento probabilmente è
Figura 3.15 Curve di crescita (A) e ΔT24-T0 (B) misurate per i 2 gruppi batterici identificati dalle sonde BAC303 e CFB286. I
valori si riferiscono alle medie delle densità batteriche, espresse come Log10 cellule/mL, rilevate nelle tre fermentazioni avve-nute ad opera di altrettanti microbiota intestinali utilizzati per l’inoculo (tre donatori diversi), e le barre di errore rappresen-tano la deviazione standard dalla media.
A B
A B
A B
59 derivato dalla presenza di metaboliti secondari che vengono prodotti dai microrganismi nelle fasi tardive della fermentazione. Nel caso delle fermentazioni in presenza di colina sembrerebbe invece di poter suggerire che la diminuzione di densità di queste popolazioni microbiche possa essere do-vuta ad un consumo di nutrienti, ancora disponibili quando la fermentazione era avvenuta in pre-senza anche di inulina. In prepre-senza di carne e quindi nel caso di fermentazione proteolitica sarebbe sembrato logico osservare la crescita di Bacteroides spp. per la loro capacitá di fermentare proteine ed amminoacidi, come anche osservato da Mills et al. (2008). Le nostre osservazioni non soddisfa-no queste aspettative forse a causa della presenza di sostanze inibenti presenti nel substrato o meta-bolicamente derivato da esso da parte di altri batteri.
Comportamenti opposti rispetto a quanto osservato per i gruppi Bacteroides e Prevotella sono stati osservati per lattobacilli ed enterococchi (Figura 3.16). È stato osservato come tutti i substrati, ad eccezione della colina (da 5,16±0,08 a 5,3±0,2 Log10 cell/mL) e del controllo negativo (da
5,16±0,08 a 5,4±0,2 Log10 cell/mL), abbiano stimolato la crescita di questi microrganismi. Le batch
culture con inulina (da 5,16±0,08 a 5,8±0,4 Log10 cell/mL), il digerito di carne (da 5,16±0,08 a
5,7±0,3 Log10 cell/mL) o la combinazione di questi due substrati (da 5,16±0,08 a 6,0±0,6 Log10
Figura 3.16 Curve di crescita (A) e ΔT24-T0 (B) misurate per i 2 gruppi batterici identificati dalle sonde Lab158 e Erec482. I
valori si riferiscono alle medie delle densità batteriche, espresse come Log10 cellule/mL, rilevate nelle tre fermentazioni avve-nute ad opera di altrettanti microbiota intestinali utilizzati per l’inoculo (tre donatori diversi), e le barre di errore rappresen-tano la deviazione standard dalla media.
A B
60 cell/mL) hanno fatto osservare una crescita di questi batteri significativamente più alta rispetto che nelle altre fermentazioni; mentre in quella che conteneva inulina con colina (da 5,16±0,08 a 5,43±0,08 Log10 cell/mL) è stata rilevata una forte crescita solo nelle prime 10 ore con un
successi-vo forte decremento. Sembrerebbe quindi che la colina non possa esser utilizzata da lattobacilli ed enterococchi che quindi si ritrovino in assenza di nutrimento come nel controllo negativo. Osser-vando tuttavia l’andamento della crescita di lattobacilli ed enterococchi in presenza di inulina e co-lina si potrebbe anche pensare ad un leggero effetto inibente della coco-lina stessa, che quindi ritarda e limita la crescita di questi batteri lattici anche in presenza di inulina.
I batteri del Clostridium cluster XIVa e XIVb, Clostridium coccoides e dell’Eubacterium rectale (Figura 3.16), hanno mostrato delle lievi crescite, in presenza dell’inulina da sola (da 7,55±0,04 a 7,7±0,5 Log10 cell/mL) o in combinazione con la colina (da 7,55±0,04 a 7,85±0,09 Log10 cell/mL),
o hanno mostrato degli abbassamenti nella densità cellulare in presenza di carne da sola (da 7,55±0,04 a 6,7±0,7 Log10 cell/mL) o in combinazione con l’inulina (da 7,55±0,04 a 7,1±0,2 Log10
cell/mL) e di colina a 60 mM (da 7,55±0,04 a 6,8±0,3 Log10 cell/mL), durante tutta la
fermentazio-ne. Evidentemente in questo lavoro sperimentale, tali clostridi hanno mostrato di non potersi avva-lere della colina per crescere, né di poter utilizzare i composti residui della digestione della carne, la cui presenza sembrerebbe addirittura limitare la loro capacità di utilizzare l’inulina. Questo compo-sto prebiotico non agisce sulla crescita di quecompo-sto gruppo di clostridi come nel caso dei bifidobatteri o di Bacteroides e Prevotella, come osservato da Salazar et al. (2009).
Sono state analizzate le evoluzioni delle popolazioni batteriche appartenenti ai clostridi F. prausni-tzii e quelli del gruppo del Clostridium histolyticum (Figura 3.17), la cui crescita media non è risul-tata significativa in nessuna delle fermentazioni osservate. I valori medi derivati dai i tre microbiota utilizzati come inoculo sono stati tuttavia caratterizzati da un’elevata deviazione standard indicando una forte variabilità dovuta all’inoculo fecale. Per quanto riguarda il F. prausnitzii, tutte le fermen-tazioni in presenza di inulina in combinazione o meno con la colina è cresciuto in modo simile, in-dipendentemente dal tipo di inoculo fecale, che partivano da una densità cellulare media pari a 6,92±0,07 Log10 cell/mL. Tuttavia in presenza di colina, carne, carne con inulina e nel controllo
ne-gativo, la popolazione di F. prausnitzii derivata da due inoculi fecali è cresciuta e in egual misura, mentre nel caso del terzo inoculo si è osservato, già dopo 5 ore, un calo della popolazione, al limite della rilevabilità. Per quanto riguarda invece il gruppo del Clostridium histolyticum, inoculato ad una densità cellulare media pari a 3,96±0,06 Log10 cell/mL, è stata osservata una lieve crescita in
tutte le fermentazioni condotte a partire da due inoculi fecali, mentre nel caso del terzo si è osserva-to, già dopo 5 ore, un calo della popolazione, che dopo 24 ore era al limite della rilevabilità (Figura
3.18).
61 Le popolazioni batteriche appartenenti al genere dei Desulfovibrio spp. e alla famiglia delle
Entero-Figura 3.17 Curve di crescita (A) e ΔT24-T0 (B) misurate per i 2 gruppi batterici identificati dalle sonde Fpra655 e Chis150. I valori si riferiscono alle medie delle densità batteriche, espresse come Log10 cellule/mL, rilevate nelle tre fermentazioni avve-nute ad opera di altrettanti microbiota intestinali utilizzati per l’inoculo (tre donatori diversi), e le barre di errore rappresen-tano la deviazione standard dalla media.
Figura 3.18 Evoluzione della crescita misurata per il gruppo batterico identificato dalla sonda Chis150 (gruppo del
Clostri-dium hisoliticum). I valori si riferiscono alle densità batteriche, espresse come Log10 cellule/mL, rilevate nelle fermentazioni
avvenute ad opera di tre microbiota intestinali diversi utilizzati per l’inoculo: blu (I), rosso (II) e verde (III).
*ND = <1,6 Log10 cellule/mL. IN (inulina), CH60 (colina), BEEF (digerito di carne) e H2O (controllo negativo) rappresenta-no i substrati in presenza dei quali le fermentazioni sorappresenta-no state condotte.
A B
62 bacteriaceae (Figura 3.19) hanno subito durante le 24 ore di fermentazione una forte crescita, ma in egual misura per tutti i substrati a confronto che sono quindi risultati avere un influenza statistica-mente non significativa.
Desulfovibrio spp., era presente ad una densità cellulare media iniziale pari a 5,38±0,08 Log10
cell/mL, ed è cresciuto di circa 1-1,4 unità logaritmiche in presenza di tutti i substrati, ed in misura inferiore nel controllo negativo. Mentre la famiglia delle Enterobacteriaceae, inoculata ad una den-sità cellulare media pari a 5,10±0,09 Log10 cell/mL, è risultata crescere abbondantemente nelle
pri-me 10 ore di ferpri-mentazione, in presenza di tutti i substrati ma in misura inferiore nel controllo nega-tivo.
L’analisi della varianza ha messo in evidenza che solo nel caso dei batteri totali e delle popolazioni batteriche di Bifidobacterium spp., del gruppo Bacteroides e Prevotella, dei lattobacilli, degli ente-rococchi e di Clostridium cluster XIVa & XIVb, l’evoluzione della crescita è risultata significativa (p-value<0,5). I test statistici post-hoc di Bonferroni o quello LSD di Fisher hanno consentito di at-tribuire le medie a gruppi statisticamente differenti (Tabella 3.4). In relazione al ΔT24-T0 di crescita,
A B
Figura 3.19 Curve di crescita (A) e ΔT24-T0 (B) misurate per i 2 gruppi batterici identificati dalle sonde DSV687 e Enter-bactD. I valori si riferiscono alle medie delle densità batteriche, espresse come Log10 cellule/mL, rilevate nelle tre fermenta-zioni avvenute ad opera di altrettanti microbiota intestinali utilizzati per l’inoculo (tre donatori diversi), e le barre di errore rappresentano la deviazione standard dalla media.
63 le medie calcolate per i batteri totali oltre che per le popolazioni di Bifidobacterium spp., Bacteroi-des e Clostridium cluster XIVa & XIVb, sono risultate significativamente diverse all’ANOVA (p-value<0,5) e i valori medi sono stati attribuiti a gruppi statisticamente secondo i test post-hoc
(Ta-bella 3.3).
Da quanto osservato finora, si può concludere che anche nelle condizioni di fermentazione imposte in questo studio, l’inulina che determinato l’incremento significativo di alcune popolazioni batteri-che rispetto a quanto osservato in presenza degli altri substrati, la colina (60 mM) o il digerito di carne. In particolare, è stata confermata l’azione prebiotica di tale composto, poiché ha stimolato la crescita di quei microrganismi deputati al mantenimento della salute umana (Tuohy et al., 2014a; Lin et al., 2014): il genere Bifidobacterium spp., la maggior parte delle Bacteroidaceae e delle Pre-votellaceae, il gruppo del Clostridium coccoides e dell’Eubacterium rectale, i lattobacilli e gli ente-rococchi. Tuttavia, questo effetto non è stato notato in presenza di inulina con il digerito di carne, che hanno presentato dei profili di crescita spesso intermedi: l’effetto sulla crescita non è stato pa-ragonabile né a quello degli altri chemostati contenenti inulina, né a quello determinato dalla carne digerita o dal solo terreno base. Ciò potrebbe essere spiegato dalla presenza di qualche elemento i-nibitore presente nel digerito di carne oppure dalla presenza nel terreno di più fonti proteiche, deri-vate dalla carne, che stimolando la crescita di altre popolazioni batteriche hanno a loro volta contra-stato la crescita di quei microrganismi con proprietà benefiche per la salute intestinale. In ogni mo-do, anche se contrastato dalla presenza dei composti della carne non idrolizzabili dagli enzimi dige-stivi, l’inulina sembra apportare un vantaggio risultante in un incremento di alcune popolazioni bat-teriche, rispetto a quanto determinato dalla sola presenza del derivato dalla carne. In presenza di quest’ultimo, i microrganismi sono cresciuti sempre in misura paragonabile al controllo negativo o hanno addirittura fatto osservare un decremento maggiore. Alla luce di ciò, in futuro sarebbe inte-ressante studiare i meccanismi ed i metaboliti che coinvolgono le fermentazioni microbiche di tipo proteolitico.
L’analisi delle componenti principali, effettuata tramite il software PAST®
, ha evidenziato che la crescita di Bifidobacterium spp., del gruppo delle Bacteroidaceae e delle Prevotellaceae, ma anche del gruppo del Clostridium cluster XIVa e XIVb, sono direttamente correlati fra di loro. Ciò può in-dicare che queste popolazioni microbiche siano influenzate dagli stessi fattori di crescita, e quindi la modulazione di uno di questi fattori possa condizionare la crescita simultanea di tutti questi gruppi batterici, che, come è atteso, collaborano per mantenere una popolazione microbica intestinale bi-lanciata e una maggiore protezione dell’ospite contro i patogeni.
In aggiunta, l’analisi chimica ha messo in evidenza che sia nell’inoculo fecale sia nella carne non era presente la colina e non è stata evidenziata alcuna produzione di TMA. La presenza dell’inulina,
64 dove era stata aggiunta la colina 60mM, ha determinato un consumo medio pari a 39,6±50,6 mM di colina e sono state prodotte 46,1±32,8 mM di TMA, rispetto al consumo medio pari a 38,3±23,3 mM di colina e alla produzione media pari a 39,2±25,4 mM di TMA verificatesi nelle fermentazioni contenenti colina 60 mM da sola. La Figura 3.20 conferma ancora come i metabolismi di questi composti siano correlati fra loro. Tuttavia la presenza di inulina ha stimolato maggiormente il meta-bolismo della colina nel microbiota dell’inoculo fecale I (produzione di TMA pari a 76,0±5,7 mM) e, in minor misura, nel II (produzione di TMA pari a 51,2±3,8 mM); mentre nel III la degradazione della colina, e conseguente produzione di TMA (pari a 11,0±0,8 mM), è stata sensibilmente inibita. Si è evidenziato un probabile errore analitico, nella determinazione della colina, nelle fermentazioni in presenza di inulina. Basandosi la quantificazione della colina su una reazione enzimatica, si po-trebbe ipotizzare che l’analisi enzimatica sia stata influenzata dalla presenza di inulina stessa, o da un prodotto metabolico batterico correlato a questo composto. Si è comunque osservata una variabi-lità nella produzione di TMA associata all’inoculo fecale e quindi al microbiota intestinale. Questo perché è stato osservato un differente comportamento del microbiota intestinale specifico per ogni donatore, che spiega l’ampio errore emerso da queste misure che ha determinato anche una bassa significatività al test dell’ANOVA. Mettendo a confronto le popolazioni microbiche, dei diversi i-noculi fecali in presenza di colina con o senza inulina, è emerso che in presenza del prebiotico, solo dall’inoculo fecale III, si è osservato un sensibile aumento nella specie F. prausnitzii ed un signifi-cativo decremento nella famiglia delle Enterobacteriaceae e nel gruppo del Clostridium histolyti-cum; l’inoculo fecale II, da cui è stato osservato un leggero incremento di produzione di TMA in presenza di inulina, la popolazione microbica del Clostridium histolyticum, non era più rilevabile a fine fermentazione.
Figura 3.20 Produzione di TMA (a sinistra) e consumo di colina (a destra) dei tre esperimenti (tre inoculi fecali diversi: I, II e III) a confronto. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard dalla media calcolata dalle tre misure strumentali eseguite sullo stesso campione.
65
Figura 3.21 Analisi delle componenti principali dei valori dei delta di crescita di ogni gruppo batterico analizzato, delle produ-zioni di TMA e dei consumi di colina. Il grafico mostra la distribuzione dei campioni secondo le componenti 1 e 2, con variabilità totale pari a 58,3%. I valori con colore uguale provengono dallo stesso inoculo fecale: blu (I), rosso (II) e verde (III). I numeri si riferiscono ai substrati, come indicato in Tabella 3.1. In Figura B, il bi-plot riporta la proiezione degli assi delle variabili analizza-te. L’analisi è stata eseguita tramite il software PAST®.
Anche alla luce di questi risultati analizzati si può supporre il coinvolgimento di clostridi del cluster I e II, in maggior misura, e di batteri appartenenti alla famiglia delle Enterobacteriaceae nella de-gradazione della colina con conseguente produzione di TMA. Questi sono risultati che andrebbero dunque a valorizzare l’ipotesi di Craciun & Balskus (2012), nel cui studio sperimentale era stato trovato il cluster genico (cut), responsabile dell’espressione degli enzimi coinvolti nella degradazio-ne della colina, anche all’interno dei genomi di questi microrganismi. Questa ipotesi è comunque da confermare attraverso ulteriori studi.
Infine, per capire meglio quanto incida il donatore nell’analisi dell’effetto della colina sulla compo-sizione e sull’attività metabolica del microbiota in ogni esperimento, è stata realizzata l’analisi delle componenti principali (PCA) sulla base delle crescite di ogni gruppo batterico (ΔT24-T0), della
pro-duzione di TMA (T24-T0) e del consumo di colina (T0-T24), tramite l’elaborazione col software PAST® (Figure 3.21 e 3.22).
A
66 Le componenti principali 1 e 2 (Figura 3.21) spiegano la maggior variabilità (58,3%), e mostrano chiaramente una sostanziale separazione tra i campioni donatore ottenuti con inoculo fecale I da quelli provenienti da II e III. Inoltre, nel grafico si nota una simile distribuzione dei substrati. Os-servando le proiezioni degli assi delle variabili analizzate, è stata evidenziata una ripartizione delle crescite batteriche singolare, che vede andamenti simili per quei gruppi batterici appartenenti allo stesso phylum: Firmicutes e Bacteroidetes nel terzo quadrante, mentre Proteobacteria e Actinobac-teria nel secondo e primo quadrante, rispettivamente.
L’analisi delle componenti principali (Figura 3.22), con PC1 e PC3 che spiegano il 58,3% della va-riabilità, mostra invece come gli assi della produzione della TMA e del consumo della colina siano quasi coincidenti, conseguenza del fatto che il consumo di tale nutriente sia correlato alla produzio-ne dell’ammina. Inoltre, si può notare che gli assi corrispondenti alle crescite delle popolazioni bat-teriche appartenenti ai generi Clostridium cluster I & II e Desulfovibrio, e alla famiglia delle Ente-robacteriaceae, seguano proiezioni simili fra di loro e in direzione analoga a quella del consumo della colina, avvalorando le ipotesi fatte in precedenza dalle osservazioni descritte nello studio di Craciun e Balskus (2012).
Quello che emerge da questi risultati è solo un dato indicativo di quali popolazioni potrebbero esse-re coinvolte in tale metabolismo, poiché tuttavia non è stata trovata una forte coresse-relazione tra le cesse-re- cre-scite di questi gruppi batterici e il consumo di colina, con conseguente produzione di TMA. Ciò
po-Figura 3.22 Analisi delle componenti principali dei valori dei delta di crescita di ogni gruppo batterico analizzato, delle produ-zioni di TMA e dei consumi di colina. Il grafico mostra la distribuzione dei campioni secondo le componenti 1 e 3, con variabilità totale pari a 54,1%. I valori con colore uguale provengono dallo stesso donatore inoculo fecale: blu (I), rosso (II) e verde (III). I numeri si riferiscono ai substrati, come indicato in Tabella 3.1. Il bi-plot indicano la proiezione degli assi delle variabili analizzate. Sono evidenziate con il cerchio gli assi corrispondenti alla produzione di TMA e al consumo di colina. L’analisi è stata eseguita tramite il software PAST®.
67 trebbe essere determinato dal fatto che i gruppi analizzati rappresentano comunque taxa microbici, per cui sarebbe più opportuno effettuare un’analisi a sottogruppi di popolazioni inferiori; scopo, tra l’altro, che si propone con la tecnologia molecolare FISH-Raman negli esami successivi a questo lavoro sperimentale.
Sub Media ΔEUB/II/III**
Log batteri/mL di campione 1 2 3 4
BEEF -0,287 **** H2O -0,066 **** **** IN+BEEF -0,004 **** **** **** CH1 0,056 **** **** **** CH10 0,183 **** **** **** H2O* 0,247 **** **** **** CH60 0,291 **** **** **** IN+CH60 0,560 **** **** **** IN 0,623 **** **** IN+CH60* 1,023 ****
Sub Media ΔErec482**
Log batteri/mL di campione 1 2
H2O -1,027 **** BEEF -0,894 **** CH60 -0,786 **** **** H2O* -0,468 **** **** CH1 -0,397 **** **** IN+BEEF -0,357 **** **** CH10 -0,341 **** **** IN 0,205 **** **** IN+CH60 0,337 **** **** IN+CH60* 0,583 ****
Sub Media ΔBif164**
Log batteri/mL di campione 1 2 3 4
BEEF -0,424 **** CH1 -0,100 **** **** CH60 -0,014 **** **** **** H2O 0,048 **** **** **** **** CH10 0,194 **** **** **** **** H2O* 0,195 **** **** **** **** IN+CH60 0,220 **** **** **** **** IN+BEEF 0,423 **** **** **** IN 0,726 **** **** IN+CH60* 0,797 ****
Sub Media ΔBAC303**
Log batteri/mL di campione 1 2
H2O -0,154 **** BEEF -0,103 **** IN+BEEF 0,126 **** **** H2O* 0,154 **** **** CH10 0,167 **** **** CH60 0,209 **** **** CH1 0,280 **** **** IN+CH60 0,853 **** **** IN 1,101 **** **** IN+CH60* 1,355 ****
Tabelle 3.3 Tabelle con i raggruppamenti dei substrati i cui delta di crescita batterici (T24-T0) sono risultati statisticamente significativi (p-value<0,05), tramite analisi statistica delle varianze con test statistici post-hoc (α=0,05): test di Bonferroni (per ΔEUB/II/III, ΔBif164 e ΔErec482) e test LSD di Fisher (per ΔBAC303). Le medie, espresse come Log10 batteri/mL di cam-pione, sono state calcolate dal software Statistica®.
*Fermentazioni che contenevano il 50% di D2O nel mezzo basale.
68
Sub Media EUB/II/III**
Log batteri/mL di campione 1 2 3
BEEF 8,079 **** H2O 8,138 **** CH1 8,165 **** H2O* 8,190 **** CH60 8,198 **** CH10 8,271 **** IN+BEEF 8,288 **** **** IN+CH60 8,523 **** **** IN 8,559 **** IN+CH60* 8,618 ****
Sub Media Erec482**
Log batteri/mL di campione 1 2 3
H2O 6,863 **** BEEF 7,014 **** CH60 7,094 **** CH10 7,252 **** **** IN+BEEF 7,269 **** **** **** CH1 7,293 **** **** **** H2O* 7,317 **** **** **** IN+CH60* 7,688 **** **** IN+CH60 7,696 **** **** IN 7,777 **** Sub Media CFB286**
Log batteri/mL di campione 1 2 3
H2O 6,874 **** H2O* 7,033 **** **** BEEF 7,189 **** **** CH10 7,202 **** **** CH1 7,205 **** **** CH60 7,288 **** **** **** IN+BEEF 7,443 **** **** IN+CH60* 7,459 **** **** IN+CH60 7,707 **** IN 7,725 ****
Sub Media Lab158**
Log batteri/mL di campione 1 2 3
H2O 5,178 **** CH1 5,209 **** **** CH60 5,337 **** **** **** CH10 5,447 **** **** **** BEEF 5,466 **** **** **** IN+CH60* 5,470 **** **** **** IN+CH60 5,532 **** **** **** H2O* 5,540 **** **** **** IN+BEEF 5,671 **** **** IN 5,728 ****
Sub Media BAC303**
Log batteri/mL di campione 1 2 3 4 5
H2O 6,872 **** H2O* 7,056 **** **** BEEF 7,176 **** **** **** CH10 7,176 **** **** **** CH60 7,179 **** **** **** CH1 7,220 **** **** **** **** IN+BEEF 7,454 **** **** **** **** IN+CH60* 7,573 **** **** **** IN+CH60 7,621 **** **** IN 7,722 ****
Sub Media Bif164**
Log batteri/mL di campione 1 2
H2O 7,107 **** CH1 7,162 **** **** BEEF 7,165 **** **** CH60 7,242 **** **** CH10 7,257 **** **** H2O* 7,329 **** **** IN+BEEF 7,457 **** **** IN+CH60 7,482 **** **** IN 7,623 **** **** IN+CH60* 7,669 ****
Tabelle 3.4 Tabelle con i raggruppamenti dei substrati i cui andamenti di crescita batterici sono risultati statisticamente si-gnificativi (p-value<0,05), tramite analisi statistica delle varianze con test statistico post-hoc di Bonferroni (α=0,05). Le medie, espresse come Log10 batteri/mL di campione, sono state calcolate dal software Statistica®.
*Fermentazioni che contenevano il 50% di D2O nel mezzo basale.
69
3.4 Metabolismo della colina e fermentazione in vitro con due volumi diversi di
fermentazione
Nell’ultima parte di questo lavoro sperimentale si è voluto confrontare la risposta metabolica del microbiota in presenza di colina in un mezzo basale contenente acqua deuterata (D2O) e ad un
vo-lume di fermentazione ridotto (scale down – da 200 mL a 25 mL) per verificare la possibilità di di-scriminare le specie microbiche più attive mediante FISH-Raman ed in seguito, condurre un espe-rimento con colina marcata con isotopo C13 da tracciare con la tecnologia FISH-Raman per indivi-duare i microrganismi capaci di utilizzare lo scheletro carbonioso della colina come fonte di carbo-nio.
Nel corso dei tre esperimenti condotti con tre microbiota intestinali differenti (3 diversi donatori di feci), è stato possibile misurare la variazione della densità dei batteri totali e delle stesse popolazioni batteriche precedentemente discusse. La crescita ΔT24-T0 dei diversi gruppi batterici analizzati
me-diante FISH dopo 24 ore di fermentazione (ΔT24-T0) è riportata in Figura 3.23. Questa figura mostra
come, nonostante una discrepanza numerica fra le fermentazioni condotte in 25 mL di volume e quelle avvenute utilizzando 200 mL di volume di coltura totale, il profilo microbico sia similare.
Figura 3.23 ΔT24-T0 misurate per i batteri totali e i 9 gruppi batterici identificati dalle sonde Bif164, DSV687, BAC303,
CFB286, Lab158, Fpra655, EnterbactD, Chis150 e Erec482. I valori si riferiscono alle medie delle densità batteriche, espresse come Log10 cellule/mL, rilevate nelle tre fermentazioni avvenute ad opera di altrettanti microbiota intestinali utilizzati per l’inoculo (tre donatori diversi). *Popolazioni le cui crescite sono risultate significative al test dell’ANOVA (p-value<0,05).
70 I batteri totali e le popolazioni batteriche identificate, appartenenti ai gruppi Bacteroides e Prevotel-la, ai clostridi, F. prausnitzii, al gruppo di Clostridium coccoides ed Eubacterium rectale, e al grup-po del Clostridium histolyticum hanno mostrato evoluzioni simili nei due differenti volumi di fer-mentazione, con una crescita leggermente superiore nelle batch culture da 25 mL. I bifidobatteri e le Enterobacteriaceae hanno avuto una crescita maggiore più evidente sempre nelle batch culture da 25 mL. Al contrario, i Desulfovibrio spp. hanno mostrato, come i lattobacilli e gli enterococchi, cre-scite inferiori nei chemostati da 25 mL.
F. prausnitzii, noto per la sua elevata sensibilità anche a piccole concentrazioni di ossigeno (Duncan et al., 2002), nelle fermentazioni di maggior volume in presenza di inulina e colina ha esibito una crescita significativamente più importante rispetto al controllo negativo, mentre nei chemostati con volumi inferiori questa differenza non è risultata significativa.
Successivamente sono state determinate le concentrazioni di colina e TMA nel mezzo di fermenta-zione per verificare la correlafermenta-zione tra consumo di colina e produfermenta-zione di TMA anche in volumi di fermentazione inferiori (Figura 3.24). Come atteso, in presenza del solo terreno base, l’inoculo fe-cale non ha apportato colina, né ha fatto rilevare la produzione di TMA, mentre la risposta metabo-lica del microbiota nei chemostati contenenti inulina e colina a 60 mM è confrontabile. La variabili-tà tra ogni donatore vista nei fermentatori a 200 mL si è verificata anche in quelli a 25 mL; la varia-zione riscontrata invece nelle misure dei consumi di colina è indice della sensibilità del saggio en-zimatico utilizzato per la determinazione delle concentrazioni di tale composto.
L’evoluzione delle popolazioni microbiche caratterizzanti i tre diversi microbiota intestinali in ri-sposta alla presenza di colina e inulina (Figura 3.25) ha messo in evidenza una diversità del micro-biota fecale III, nel cui caso si è osservato una densità batterica decisamente inferiore nella famiglia
Figura 3.24 Produzione di TMA (a sinistra) e consumo di colina (a destra) in presenza di tre microbiota fecali (tre donatori diversi: I, II e III) a confronto. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard delle tre misurazioni effettuate per lo stesso campione.
71 delle Enterobacteriaceae e nel gruppo del Clostridium histolyticum, il microbiota ha evidenziato una limitata capacità a produrre TMA, indipendentemente dal volume di fermentazione; il microbiota II ha prodotto un cospicuo quantitativo di TMA, anche se inferiore alla produzione misurata nel caso del microbiota I. Il metabolismo del microbiota II è in relazione con le stesse variazioni microbiche evidenziate per il microbiota III nel gruppo del Clostridium histolyticum.
Tutti questi risultati hanno rivelato la riproducibilità delle fermentazioni condotte su scala volume-trica inferiore, con il conseguente vantaggio economico nel caso si debbano studiare substrati molto costosi come la colina marcata con C13. Tuttavia è stato osservato come sia necessario tenere sotto controllo la fermentazione in modo più accurato a causa della maggiore evaporazione, dovuta ad un minor controllo nel flusso di immissione del gas.
3.4.1 Analisi dell’incorporazione del deuterio nelle cellule batteriche
Attraverso la tecnica coltura-indipendente di ibridazione in situ con sonde oligonucleotidiche fluo-rescenti (FISH) accoppiata alla microspettroscopia Raman, il gruppo di ricerca della divisione di Microbial Ecology del Dipartimento di Microbiology and Ecosystem Science dell’Università di
Figura 3.25 Curve di crescita delle batch culture contenenti inulina e colina a 60 mM, in volumi fermentativi da 200 mL (A) e da 25 mL (B), misurate per il gruppo batterico identificato dalla sonda Chis150 e EnterbactD. I valori si riferiscono alle den-sità batteriche, espresse come Log10 cellule/mL, rilevate nelle fermentazioni avvenute ad opera di tre microbiota intestinali diversi utilizzati per l’inoculo: blu (I), rosso (II) e verde (III).
72 Vienna ha analizzato i campioni fecali dei substrati dal C7 al C10 delle fermentazioni per determi-nare le concentrazioni delle popolazioni batteriche che hanno incorporato nelle strutture cellulari il deuterio (D), proveniente dall’acqua pesante usata nel terreno di crescita (50% v/v). In Figura 3.26 è mostrato un esempio dello spettro che si è generato con la microspettroscopia Raman, in cui è sta-ta evidenziasta-ta la presenza dei picchi corrispondenti all’interferenza di alcune macromolecole biolo-giche, come proteine, acidi nucleici, acidi grassi e amminoacidi aromatici quali la fenilalanina, e quelli generati dall’energia vibrazionale dei legami C-D (carbonio-deuterio). Questo particolare shift nello spettro, ha confermato l’avvenuta incorporazione del deuterio nelle cellule batteriche me-tabolicamente attive nella fermentazione in analisi. L’analisi delle popolazioni batteriche, tuttora in corso, potrà eventualmente attribuire la maggiore attività metabolica di alcune specie rispetto ad al-tre.
Figura 3.26 Confronto tra due spettri Raman, corretti per la linea di base, di singole cellule cresciute prelevate dopo 24 ore di fermentazione fecale con inulina e colina (60 mM), come substrati, e con il 50% di acqua pesante (D2O) nel mezzo di crescita. Lo
spettro rosso, in confronto a quello nero, proviene da cellule che hanno incorporato il deuterio. Le frecce indicano i picchi gene-rati dall’energia vibrazionale di certe macromolecole biologiche presenti nel campione: in particolare, si nota il picco tra 2000 e 2500 cm-1 corrispondente ai legami C-D nelle cellule. AU = unità arbitraria
