1 –TEMPO DI REPLICAZIONE

1 –TEMPO DI REPLICAZIONE

Per tempo di replicazione (RT) si intende l’ordine col quale vengono duplicati segmenti di DNA lungo i cromosomi. Nelle cellule eucariotiche, in cui il DNA è contenuto nel nucleo, i cromosomi sono composti da molecole di DNA lineari, molto lunghe ed a doppio filamento. Durante la fase S di ciascun ciclo cellulare (Fig. 1) viene duplicato tutto il DNA di una cellula per provvedere a formare una copia identica di ciascun cromosoma per la cellula figlia al termine della divisione cellulare.

Il processo di duplicazione del DNA procede a cominciare da siti definiti Origini di replicazione del DNA; la replicazione non inizia, in tutte le diverse origini, allo stesso tempo; esiste un ben definito ordine temporale col quale le origini vengono attivate. La replicazione non necessariamente comincia esattamente ogni volta

Fig. 1

Schema del ciclo cellulare I = Interfase

M = Mitosi

G1= Intervallo 1 (Gap1) G2= Intervallo 2 (Gap2)

sugli stessi siti di origine, ma i segmenti si replicano con la sequenza temporale prefissata senza preoccuparsi indipendentemente da dove esattamente, entro ciascun segmento, la replicazione ha inizio (Fig. 2).

In Fig. 2 possiamo ben notare che i domini di replicazione altro non rappresentano che clusters di origini di replicazione.

Delle ventiquattro ore complessive che necessitano per un ciclo di duplicazione cellulare circa dieci sono impegnate nella duplicazione del DNA; dobbiamo considerare che se tutte le origini della duplicazione del DNA partissero simultaneamente la durata della sintesi si ridurrebbe a circa un’ora o meno. Il fatto che, durante la fase S, i geni si replichino precocemente o tardivamente, è da anni sotto intenso studio (Gondor et al., 2009; Hiratani et al., 2009). Le dinamiche della replicazione del DNA sono state inizialmente studiate tramite la rivelazione di

Fig. 2

replicano segnenti di DNA cromosomico (Domini di replicazione) ad periodi di tempo ben definiti durante la fase S. Da Hiratani et al., 2009

BrdU incorporata nel DNA sintetizzato durante la fase S, mentre, attualmente si utilizzano metodi molecolari quali la PCR o la tecnica FISH. Con le diverse metodiche sono emerse interessanti caratteristiche:

1) le bande Q dei cromosomi coincidono con domini a replicazione tardiva mentre la bande R con domini a replicazione precoce (Dutrillaux et al., 1976);

2) i foci in replicazione appaiono come strutture in evidenza (Nakamura et al., 1986), che formano diversi patterns durante la fase S: in fase S precoce centinaia di piccoli foci sono distribuiti su tutto il nucleo; nella mid S sono per lo più localizzati nei nucleoli e nella periferia nucleare; nella fase S tardiva i foci formano clusters in corrispondenza delle regioni eterocromatiniche (O’Keefe et al.,1992; Dimitrova, 1999; Fig 3)

3) la maggior parte dei foci rimane attiva per 45-60 min prima che ne sia attivato un altro set; i foci sono strutture stabili rilevabili in vari cicli cellulari (Jackson & Pombo, 1998);

4) Ciascuno di essi rappresenta un dominio di replicazione con ampiezza di circa 1Mb e contiene un cluster di 5-10 origini che si accendono quasi contemporaneamente (Nakamura & al., 1986; Ma & al., 1998);

Replication foci BrdU

DNA (Hoeschst)

Fig. 3

5) ciò implica due livelli di controllo, un meccanismo “globale” che determina il tempo di replicazione di tutti i domini cromosomici ed una regolazione ”locale” dell’attività all’interno di ciascun dominio;

6) è stato dimostrato che il tempo di replicazione per ciascun dominio cromosomico viene programmato nella fase G1 svariate ora prima dell’inizio della replicazione del DNA, l’evento in G1 che stabilisce il tempo di replicazione, coincide precisamente con il momento di riposizionamento dei cromosomi dopo il completamento della mitosi precedente (Dimitrova et al., 1999);

7) e’ stata dimostrata, in molti studi, una forte correlazione fra trascrizione attiva e tempo di replicazione: i geni altamente trascritti con funzioni housekeeping vengono replicati in fase S precoce in tutti i tipi cellulari (Goldman et al., 1984); i geni la cui espressione è tessuto-specifica mostrano una tendenza a una replicazione precoce nei tessuti in cui sono espressi e tardiva in quelli in cui sono inattivi (Aladjem, 2007); nel caso di geni “imprinted”, cioè soggetti a espressione monoallelica dipendente dall’origine parentale, l’allele espresso si replica in fase S precoce e l’altro in fase S tardiva, mostrando quindi replicazione asincrona. Anche altri geni quelli con espressione monoallelica, come quelli i geni dei recettori olfattivi o i geni dei recettori delle cellule T mostrano asincronismo (Chess et al.,1994); questo non influenza la corretta replicazione del DNA (Goren & Cedar, 2003) e è stato spiegato considerando che tempo di replicazione e competenza trascrizionale di un elemento del DNA vengono regolati da uno specifico contesto cromatinico o da una specifica posizione nucleare (Cimbora et al., 2000; Reik et al., 1998).

Il tempo di replicazione nel genoma umano è stato mappato con differenti metodi che non interferiscano con le dinamiche della replicazione del DNA (Woodfine et al., 2004; White et al., 2004).

Come anticipato, i cromosomi mostrano molti domini di replicazione precoce e tardiva interspersi, che misurano da uno a più Mb separati da confini più o meno definiti. Ad ogni cromosoma è stato assegnato un valore di tempo di replicazione

medio con il cromosoma 22 il più precoce ed il cromosoma 4 il più tardivo fra gli autosomici, mentre entrambi i cromosomi sessuali sono tardivi.

A livello delle bande cromosomiche i valori del tempo di replicazione precoce correlano positivamente con una maggiore densità genica, un elevato contenuto in GC e una maggiore densità di sequenze Alu (sequenze ricche in GC) (Woodfine et al., 2004). Le mappe ad alta risoluzione confermano una eccellente correlazione tra le isocore (ampi segmenti di DNA aventi una composizione nucleotidica omogenea) con elevati valori G+C% e tempo di replicazione precoce (Costantini et al., 2008; Woodfine et al.,2004; Fig. 4).

Fig. 4

Cromosoma umano colorazione Giemsa. Le bande R (chiare) corrispondono a domini a replicazione precoce e le bande scure (G) corrispondono a domini a replicazione tardiva Ciascun dominio contiene uno o più clusters di origini organizzati per accendersi contemporaneamente. Le origini precoci sono rappresentate con cerchi bianchi, quelle tardive con cerchi grigi. (Costantini et al., 2004)

Clusters di origini tardive. Povere in GC, in Alu,-bassa densità genica,

deacetilazione H3/H4. G Clusters di origini precoci,

ricche in GC, in Alu-Alta densità genica-