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2. MATERIALI E METODI
2.1 Substrati
Le fermentazioni in vitro sono state condotte mediante coltura di tipo batch con controllo di pH ap-plicate in due differenti set. I substrati saggiati erano quelli indicati nel disegno schematizzato in Tabella 2.1:
Set 1) Sono stati saggiati 8 substrati: colina (sottoforma di cloruro di colina) a tre differenti concen-trazioni, 1 , 10 e 60 mM (CH1, CH10 e CH60, rispettivamente), un liofilizzato di carne di filetto di manzo senza grasso, preventivamente digerito in vitro (BEEF) come descritto al paragrafo 2.2, inulina (IN) il controllo positivo, per la sua accertata capacità di stimolare la crescita dei bifidobat-teri, e acqua (H2O), in qualità di controllo negativo, e le combinazioni inulina con la colina 60 mM (IN+CH60) e inulina con il liofilizzato di carne digerito (IN+BEEF). Questi substrati sono stati sag-giati in fermentazioni del volume di 200 mL.
Set 2) Sono stati saggiati 2 substrati: inulina e colina 60 mM (IN+CH60) a confronto con il control-lo negativo (H2O), in un volume finale di fermentazione di 25 mL. Per entrambi la fermentazione è avvenuta in presenza del 50% di acqua pesante (D2O).
In entrambi i set di fermentazione, ad eccezione della colina, i substrati sono stati aggiunti ad una concentrazione pari all’1%.
Tabella 2.1 Substrati e nomenclatura utilizzati per distinguere i campioni ed i chemostati (vessel) dell’esperimento di fermen-tazione in batch, con controllo di pH, condotti in 200 o 25 mL di volume finale.
ID_Campione ID_Vessel Substrato Volume finale
C1 CH1 Colina (1 mM)
200 mL
C2 CH10 Colina (10 mM)
C3 CH60 Colina (60 mM)
C4 IN Inulina (1%)
C5 BEEF Filetto di carne (1%)
C6 IN+BEEF Inulina (1%) e filetto di carne (1%) C7 IN+CH60 Inulina (1%) e colina (60 mM)
C8 H2O Acqua (1%)
C9 D2O Acqua (1%) e D2O (50%)
25 mL C10 D2O_IN+CH60 Inulina (1%), colina (60 mM) e D2O (50%)
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2.2 Digestione gastro-intestinale in vitro di filetto di manzo
La digestione in vitro di filetto di manzo di prima scelta, cotto per 10 minuti su piastra, è stata ese-guita secondo il metodo adattato di Mandalari et al. (2008), il quale simula le condizioni chimico-enzimatiche essenzialmente di due fasi della digestione: la fase gastrica e quella duodenale. Questo processo è necessario per rendere più verosimile il substrato di carne nel momento in cui all’interno del corpo umano giunge al colon privo degli zuccheri semplici e di altre piccole molecole assorbite nel tratto superiore dell’apparato digerente (bocca, stomaco e intestino tenue).
Prima di iniziare la digestione del substrato, è stata preparata una sospensione di vescicole lipidiche, cioè una nano emulsione di fosfatidilcolina in soluzione salina di NaCl (150 mM; pH 2,5). Innanzi-tutto in un pallone da RotaVapor sottovuoto è stato rimosso per evaporazione il solvente clorofor-mio dalla L-α-fosfatidilcolina (PC) da uovo (100 mg/mL; Grade 1 da Lipid Products, UK), Questo è stato coperto con Argon per evitarne l’ossidazione. Successivamente è stato aggiunto NaCl (150 mM; pH 2,5) per reidratare la PC. La sospensione è stata incubata per 1 ora a 37°C in agitazione or-bitale, successivamente sottoposta ad ultrasuoni mediante sonicatore con sonda al titanio [Branson Sonifier Sound Enclosure]. Di seguito la nanoemulsione è stata microfiltrata (0,22 um) per rimuo-vere ogni possibile deposito di titanio derivante dal processo di sonicazione.
Per la fase gastrica è stata fatta una sospensione con 15 g di carne in NaCl (150 mM) e fosfatidilco-lina (2,4 mmol/L). Sono stati aggiunti gli enzimi gastrici pepsina (146 U/mL; Sigma-Aldrich P7000) e lipasi gastrica (60 U/mL; Sigma-Aldrich 8612 AP-15) e, dopo aver aggiustato il pH a 2,0, la soluzione è stata incubata a 37°C per 2 h in agitazione.
Per procedere con la fase duodenale, il pH della soluzione è stato portato a 6,5 con NaOH e sono stati aggiunti CaCl2 (11,7 mM; Applichem), Bis Tris (0,73 mM; Applichem), i sali biliari taurocola-to di sodio (4 mM; Sigma-Aldrich) e glico-desossicolataurocola-to di sodio (4 mM; Sigma-Aldrich), e gli en-zimi α-chimotripsina (5,9 U/mL; Sigma-Aldrich), tripsina (104 U/mL; Sigma-Aldrich), colipasi (3,2 μg/mL; Sigma-Aldrich), lipasi pancreatica (54 U/mL; Sigma-Aldrich) e α-amilasi (25 U/mL; Sig-ma-Aldrich). Gli enzimi sono stati lasciati agire a 37°C per 1 h in agitazione.
Per simulare l’assorbimento dal bolo delle piccole molecole formatesi durante la digestione, la so-spensione finale è stata dializzata secondo il metodo di Mills et al. (2008). Con membrana Spec-tra/Por [Spectrum Labs, cut-off di 1 kDa], in soluzione da dialisi (NaCl 10 μmM) è stata lasciata in agitazione a 4°C tutta la notte. La sospensione dializzata è stata di seguito liofilizzata e conservata a -20°C fino al momento dell’uso.
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2.3 Colture fecali in batch a pH controllato in anaerobiosi
I profili di fermentazione dei vari substrati sono stati determinati usando delle colture fecali in batch anaerobiche e a pH controllato secondo il metodo perfezionato da Connolly et al. (2010).
Ciascun recipiente di fermentazione usato (il chemostato o vessel) della capacità di 280 o 25 mL è rivestito da una camicia per la circolazione dell’acqua alla temperatura costante e controllata da un bagno termostatico, la chiusura è munita delle aperture necessarie al passaggio dell’azoto, puro e filtrato sterilmente, in entrata ed in uscita, necessario a mantenere l’anaerobiosi. Sono inoltre pre-senti le valvole di entrata della sonda per la misura del pH, la valvola per il prelievo dei campioni e le valvole per il dosaggio, durante il processo fermentativo, di acido o base per il mantenimento del pH ai valori prestabiliti. Questi contenitori di fermentazione sono stati montati, aggiunti di un anco-retta magnetica, sterilizzati ed asetticamente riempiti con il mezzo basale di nutrimento. Il terreno basale di nutrimento conteneva: peptone (2 g/L), estratto di lievito (2 g/L), NaHCO3 (2 g/L), sali bi-liari (glicocolato e taurocolato di sodio; 0,5 g/L), L-cisteina.HCl (0,5 g/L), KH2PO4 (0,04 g/L), K2HPO4 (0,04 g/L), NaCl (0,1 g/L), MgSO4.7H2O (0,01 g/L), CaCl2.6H2O (0,01 g/L), emina (0,05 g/L, precedentemente disciolta in 1 mL di NaOH 4 M), resazurina (sol 0,1%; 1 mL/L), Tween 80 (2 mL/L) e vitamina K (10 μL/L, Sigma-Aldrich). Per le batch culture in presenza di acqua deu-terata D2O (50% v/v), la stessa è stata aggiunta previa sterilizzazione in autoclave. Dopo l’aggiunta del terreno sterile, vi è stato fatto gorgogliare N2, tutta la notte per mantenere l’anaerobiosi. Il giorno seguente è stata aggiunta una soluzione di L-cisteina (0,5% v/v di una soluzione al 10%) che agisce come riducente. Si sono quindi aggiunti i substrati di ogni vessel (Tabella 2.1) e si è aggiustato il pH a circa 7,2; durante tutta la fermentazione il pH è stato mantenuto fra 6,8 e 7,8 grazie all’aggiunta di NaOH 0,5 M o HCl 0,5 M, regolata dal pH-metro collegato [Electrolab 260 pH Con-troler Module, UK] e munito di pompe peristaltiche per l’aggiunta dell’acido e della base.
L’inoculo fecale preparato e omogeneizzato aggiungendo feci in ragione del 10% (p/v) in tampone fosfato salino (PBS 1X) sterile e ridotto è stato successivamente aggiunto a ogni vessel (10% v/v). I campioni fecali sono stati raccolti da 3 donatori sani, femmine, di età tra i 24 e i 51 anni, che non avessero assunto trattamenti antibiotici da almeno 3 mesi, che non avessero integrato la dieta con prebiotici o probiotici nei giorni precedenti all’esperimento e che non fossero soggetti a disordini intestinali.
Durante ogni fermentazione, sono stati raccolti campioni da 5 mL e da 3 mL, dai vessels da 200 mL e da 25 mL rispettivamente, in 4 tempi differenti: al momento dell’inoculo fecale (Tempo 0) e dopo 5, 10 e 24 ore di fermentazione (Tempo 5, 10 e 24). Da ogni campionamento:
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due aliquote da 375 μL sono state fissate in paraformaldeide (PFA 4%) per l’analisi delle popolazioni batteriche con la tecnica dell’ibridazione fluorescente in situ (FISH) e Raman-FISH;
tre aliquote da 1,5 mL (due da 750 μL per i vessels da 25 mL) sono state centrifugate a 4°C a 13000 rpm per 5’ per separare le cellue microbiche ed i solidi sospesi. Il surnatante è stato utilizzato per la quantificazione della trimetilammina (TMA) mediante GC-MS e per il sag-gio enzimatico condotto per la determinazione della colina.
2.4 Analisi coltura-indipendente del microbiota intestinale mediante ibridazione in
situ con sonde fluorescenti (FISH) e conta diretta al microscopio a fluorescenza
I cambiamenti nella popolazione batterica durante ogni fermentazione sono stati osservati con la tecnica dell’ibridazione fluorescente in situ (FISH), ovvero l’ibridazione di sonde marcate con Cy3 con regioni del 16S rRNA specifiche per alcuni gruppi di batteri in analisi. La FISH è stata eseguita secondo il metodo descritto da Daims et al. (1999).
I campioni fecali appena raccolti sono stati fissati in paraformaldeide 4% (pH 7,2), successivamente lavati con PBS 1X filtrato e risospesi in 300 μL di una soluzione sterilizzata e filtrata di PBS 1X ed etanolo 96% (1:1; v/v). I campioni sono stati quindi conservati a -20°C prima di ogni utilizzo. Per l’ibridazione in situ sono stati utilizzati appositi vetrini ricoperti di Teflon e poli-L-lisina con 6 pozzetti (diametro 10 mm) per l’ibridazione di altrettanti campioni [Tekdon Inc., Myakka City, FL, USA]. La sospensione microbica, debitamente diluita in PBS/SDS (soluzione di 0,1% di SDS 10% in PBS 1X), è stata fissata al vetrino e sottoposti successivamente a lavaggi in etanolo a concentra-zione crescente (50, 80 e 96%, 3’ in ognuno), per far aderire le cellule batteriche e rendere le mem-brane più permeabili alle sonde. Per l’ibridazione delle cellule di bifidobatteri e lattobatteri è stato necessario un trattamento di permeabilizzazione con lisozima (1 mg/mL di 50000 U/mg proteina) per 15’ a temperatura ambiente.
In seguito, sono stati applicati su ogni pozzetto 55 μL di una soluzione contenente 50 μL di buffer di ibridazione (Hybridization Buffer, HB) e 5 μL di sonda (50 ng/μL). Ogni millilitro di HB contiene i seguenti reagenti: 180 μL di NaCl 5 M, 20 μL di Tris/HCl 1 M (pH 8,0), 1 μL di SDS 10% e acqua distillata per arrivare a volume. Per alcune sonde (Tabella 2.2) è stato necessario aggiungere for-mammide per ottenere la massima stringenza di ibridazione e quindi la corretta specificità di lega-me. I vetrini sono stati poi incubati per 3 ore in un forno da ibridazione [Boekel InSlide OutTM
36 Hybridization Oven Model 241000] alla temperatura di ibridazione specifica di ogni sonda (Tabella 2.2), in camera umida per evitare l’evaporazione del buffer.
A fine ibridazione, le cellule sono state assoggettate a lavaggio per 10-15’ in un buffer di lavaggio (Washing Buffer, WB) (Tabella 2.3) e alla temperatura specifica di ogni sonda (Tabella 2.2). Al buffer WB è stato inoltre aggiunto 4’,6-diamidin-2-fenilindolo diidroclorato (DAPI 50 ng/μL). Di seguito i vetrini sono stati raffreddati per qualche secondo in acqua ghiacciata e asciugati rapida-mente con aria compressa. I campioni sono stati trattati con Antifade (ProLong® Gold, Life Te-chnologies) per proteggere la fluorescenza dal decadimento ed aumentare l’indice di rifrazione del campione e quindi migliorare le condizioni per la successiva osservazione al microscopio. I vetrini successivamente coperti con vetrino coprioggetto sono stati lasciati al buio per 12-24 ore per con-sentire la corretta penetrazione dell’antifade. Le slides possono poi essere conservate a 4°C fino alla lettura al microscopio.
E’ stato utilizzato un microscopio a fluorescenza [Olympus®
System Microscopes Model Bx51] munito di lente oculare 10X e obiettivo ad immersione 100X, provvisto di filtri specifici per le lun-ghezze d’onda di eccitazione (550 nm) ed emissione(570 nm), adatte per la rilevazione dell’indocarbocianina (Cy3). Con l’aiuto di un reticolo (5X5 mm) in dotazione per uno degli obiet-tivi, utilizzato per delimitare un campo di osservazione, sono state contate le cellule batteriche posi-tive all’ibridazione, presenti in 15 campi di osservazione. La determinazione della densità cellulare è stata effettuata applicando la seguente formula:
dove:
0,8 si riferisce al fattore di diluizione del campione derivato dal fissaggio in PFA subito do-po il campionamento (rapdo-porto tra il volume finale del campione appena lavato dalla PFA, 300 μL, e il volume di campione fecale prelevato per il fissaggio con la PFA, 375 μL);
FDvessel è il fattore di diluizione del campione derivato dalla diluizione avvenuta durante la
fermentazione per l’aggiunta di acido e base al mezzo;
FDhyb è il fattore di diluizione del campione prima del fissaggio sul vetrino di ibridazione, usato per una particolare sonda;
3140 si riferisce al rapporto tra l’area del pozzetto (diametro 10 mm) e l’area del campo vi-sivo (l’area della griglia, lato sull’oculare 5 mm), tenendo conto del fattore d’ingrandimento dovuto al microscopio (10X l’oculare e 100X l’obiettivo);
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50 è il fattore di conversione per esprimere il valore in mL di campione, poiché sul pozzetto se ne fissano solo 20 μL;
l’ultimo fattore corrisponde alla media di cellule batteriche contate (in almeno 15 campi vi-sivi casuali).
La densità cellulare è stata poi espressa in scala logaritmica (log10 batteri/mL campione).
Per conoscere la crescita batterica dopo 24 ore di fermentazione è stato inoltre calcolato il delta di crescita:
Tabella 2.2 Lista delle sonde usate con la rispettiva sequenza nucleotidica (dal 5’al 3’), le condizioni di ibridazione (pretrat-tamento, la percentuale di formammide da aggiungere al buffer di ibridazione (HB), la temperatura di ibridazione -TH e di
lavaggio -TW), ed il relativo riferimento bibliografico (REF).
* Queste sonde sono utilizzate insieme in concentrazioni equimolari (tutte a 50 ng/μL).
** a = Manz et al., 1996; b = Langendijk et al., 1995; c= Weller et al., 2000; d = Franks et al., 1998; e = Devereux et al., 1992; f = Ootsubo et al., 2002; g = Daims et al., 1999; h = Hold et al., 2003; i = Harmsen et al., 1999.
Sonda Sequenza (5’3’)
Pre-trattamento
Formammide
(%) TH TW REF**
BAC303 CCAATGTGGGGGACCTT No 0 46 48 [a]
Bif164 CATCCGGCATTACCACCC Lisozima 0 50 50 [b]
CFB286 TCCTCTCAGAACCCCTAC No 50 46 48 [c] Chis150 TTATGCGGTATTAATCTYCCTTT No 0 50 50 [d] DSV687 TACGGATTTCACTCCT No 10 46 48 [e] EnterbactD TGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTT No 20 60 60 [f] Erec482 GCTTCTTAGTCARGTACCG No 0 50 50 [d] EUB338* GCTGCCTCCCGTAGGAGT No 35 46 48 [g] EUB338II* GCAGCCACCCGTAGGTGT EUB338III* GCTGCCACCCGTAGGTGT Fpra655 CGCCTACCTCTGCACTAC No 0 58 58 [h]
Lab158 GGTATTAGCAYCTGTTTCCA Lisozima 0 50 50 [i]
Tabella 2.3 Composizione del buffer di lavaggio (WB), in relazione alla percentuale di formammide presente nel buffer di i-bridazione (HB). Tutti i valori sono espressi in mL (volume finale WB = 50 mL).
Componenti Formammide (%) in HB 0 10 20 35 50 NaCl 5 M 9 4,5 2,15 0,7 0,18 Tris/HCl 1 M (pH 8,0) 1 1 1 1 1 EDTA 0,5 M (pH 8,0) 0 0 0,5 0,5 0,5 ddH2O 40 44,5 46,35 47,8 48,32
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2.4.1 Determinazione dell’incorporazione del deuterio tramite Raman-FISH
I campioni fissati in paraformaldeide e successivamente conservati in PBS:Etanolo, prelevati duran-te le fermentazioni C7, C8, C9 e C10, sono stati spediti alla divisione di Microbial Ecology del Di-partimento di Microbiology and Ecosystem Science dell’Università di Vienna. Il gruppo di ricerca, guidato dal dr. David Berry, ha analizzato le popolazioni batteriche che hanno incorporato nello scheletro carbonioso cellulare il deuterio dalla D2O, presente nel terreno di crescita, mediante FISH accoppiata a microspettroscopia Raman, descritta nel lavoro di Berry et al. (2015).
2.5 Determinazione del consumo di colina libera mediante saggio enzimatico -
spettrofotometrico di ossidazione della colina
La quantificazione della colina libera presente all’interno dei campioni prelevati al momento dell’inoculo fecale e dopo 24 ore di fermentazione è stata eseguita tramite un saggio enzimatico spettrofotometrico, secondo il metodo descritto da Woollard & Indyk (2000).
Dal surnatante di ogni campione sono stati prelevati 200 μL a cui sono stati aggiunti 46 μL di Pro-tein Precipitate Solution (PPS) (FastDNATM SPIN Kit for Feces, MP Biomedicals Cat number 116570-200), e trascorsi 10’ di incubazione a 4°C l’eventuale precipitato proteico è stato separato mediante centrifugazione a 14000 rpm per 5’. Questo pretrattamento dei campioni con PPS è stato introdotto per purificare il campione da interferenti la cui presenza era stata rilevata durante i saggi preliminari di messa a punto del protocollo operativo. Il test è stato eseguito utilizzando una piastra da 96 pozzetti. In breve, 5 μL di campione (o di acqua per il bianco, o di una soluzione standard per la curva di taratura) sono stati aggiunti a 150 μL di reagente cromogeno fresco. Il reagente cromo-geno consisteva in una soluzione di Trizma buffer (0,05 M, pH 8,0) contenente colina ossidasi (1-1,2 U/mL), perossidasi (2,5-2,8 U/mL), 4-aminoantipirina (0,15 mg/mL) e il fenolo (0,5 mg/mL). Il metodo sfrutta le seguenti reazioni enzimatiche:
1. Ossidazione della colina: la colina ossidasi è una ossidoreduttasi che in presenza di ossige-no reagisce con la colina libera liberando acqua ossigenata
COLINA + O2 BETAINA ALDEIDE + H2O2
2. Ossidazione del fenolo: la perossidasi è una ossidoreduttasi che in presenza di acqua ossi-genata ossida il fenolo liberando acqua
FENOLO + H2O2 → FENOLO OSSIDATO + H2O
colina ossidasi
39 3. Formazione del composto cromogeno: il fenolo ossidato reagisce con la 4-aminoantipirina
formando una chinone-imina, che attribuisce alla soluzione un colore rosa
FENOLO OSSIDATO + 4-AMINOANTIPIRINA → CHINONE-IMINA (incolore) (rosa 505 nm)
Dopo l’aggiunta del reagente, i campioni sono stati incubati a 37°C per 15’ e di seguito lasciati raf-freddare a temperatura ambiente per 15’ prima di procedere alla lettura spettrofotometrica eseguita con l’ausilio di un lettore spettrofotometrico per micropiastre [Biotek®
PowerWave340 Microplate Spectrophotometer]. Il composto finale della reazione è stato rilevato mediante lettura dell’assorbanza a 505 nm.
La colina presente nei campioni è stata quantificata sulla base della retta di calibrazione costruita misurando le assorbanze di campioni a concentrazioni di colina di 50, 100, 150, 200 e 250 mg/L, previa sottrazione del bianco. Una soluzione madre di colina è stata preparata sciogliendo 130,75 mg di colina bitartrato (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) in 25 mL di ddH2O, corrispondente a 2500 μg/mL di colina idrossido (data la scarsa stabilità della colina in ddH2O, questa soluzione è stata usata fresca). Mediante diluizioni seriali della soluzione madre sono stati preparati le 5 solu-zioni standard utilizzate per costruire la curva di calibrazione (Tabella 2.4). La realizzazione della curva di taratura e l’analisi dei dati dei campioni reali è stata riportata in concentrazione molare (mM); ogni misura è stata eseguita in triplicato.
Tabella 2.4 Concentrazione di colina nei campioni standard utilizzati per costruire la retta di regressione, del saggio enzima-tico di ossidazione della colina, espressa in μg/mL e molarità (mM).
Standard Concentrazione (μg/mL) Molarità (mM) 1 50 0,41 2 100 0,82 3 150 1,24 4 200 1,65 5 250 2,06
2.6 Determinazione della produzione di trimetilammina (TMA) mediante GC-MS
La quantità di trimetilammina (TMA), presente all’interno dei campioni prelevati durante le batch culture al momento dell’inoculo fecale e dopo 24 ore di fermentazione, sono state determinate me-diante gas-cromatografia (GC) accoppiata alla spettrometria di massa (MS) secondo il metodo
de-40 scritto da Shim & Baek (2012). Questo metodo, descritto in letteratura, è stato messo a punto nel la-boratorio dove ho operato validandolo per i campioni da analizzare.
I campioni prelevati durante le fermentazioni in vitro sono stati centrifugati a 13000 rpm a 4°C per 5’ al momento della raccolta. Il surnatante è stato separato dal pellet e conservato a -80°C fino al momento dell’uso. Un’aliquota pari a 0,5 mL di campione scongelato, previa eventuale diluizione in acqua distillata, è stata aggiunta ad una vial da 15 mL, insieme allo Standard Interno (2-ottanolo, in volume pari a 25 μL di una soluzione madre 10 mM di ottanolo, per concentrazione finale di 50 μM) e 4,5 mL di buffer. L’estrazione della TMA dai campioni in analisi è stata fatta con il metodo Headspace Solid-phase Microextraction (HS-SPME), come proposto per la quantificazione della TMA in campioni provenienti da diversi alimenti e bevande (Béné et al., 2001; Chan et al., 2006), urina umana (Mills et al., 1999) e rifiuti liquidi e solidi provenienti da industrie agricole per saggia-re l’inquinamento ambientale (Kim et al., 2002). Per la SPME [Supelco Co., Bellefonte, Pa.] è stata usata una fibra SPME, 65 um di polidimetilsilossano/divinilbenzene (PDMS/DVB), con apposito supporto.
Il buffer usato per l’analisi della TMA è costituito da una soluzione di Na2HPO4 (50 mM, pH 11 con NaOH), per spostare l’equilibrio della TMA in soluzione verso la forma indissociata (pKa pari a 9,87), volatile e quindi massimizzare la concentrazione della TMA nello spazio di testa. Il 2-ottanolo è stato usato come Standard Interno (SI), perché è un composto volatile che non interferi-sce con i composti in analisi ed ha un tempo di ritenzione differente da quello della TMA e da altri composti presenti nella matrice del campione: il 2-ottanolo ha un tempo di ritenzione (RT) attorno a 17,24’, mentre la TMA a 2,22’. La vial con il campione è stata dunque posta dall’autocampionatore in un termostato a 40°C per 5’ per permettere il raggiungimento dell’equilibrio tra fase liquida e gassosa dei composti volatili, dopo di che la fibra SPME entrando nella vial è stata completamente esposta (1 cm) allo spazio di testa, per permettere l’adsorbimento dei composti sulla fibra, per 15’ a 40°C. Dopo l’adsorbimento, i composti volatili sono stati desorbiti nell’iniettore del GC per 1,2’ a 250°C.
Per l’analisi è stato utilizzato un gascromatografo munito di autocampionatore e accoppiato ad uno spettrometro di massa [Thermo ScientificTM TSQTM Quantum GCTM, con TRACE GC UltraTM e TriPlusTM Autosampler], iniezione (splitless), colonna [RTXR – VOLATILE AMINE 30 m x 0,32 mm, RESTEK] con flusso di gas elio (carrier), alla velocità di flusso di 1,2 mL/min, pro-grammata di temperatura:
Fase isoterma 35°C per 3’ GradienteT 2°C/min fino a 50°C Fase isoterma 50°C per 1’
41 Fase isoterma 160°C per 2’
Il rivelatore all’uscita della colonna è costituito da uno spettrometro di massa (MS) con una transfer line a 250°C e energia di ionizzazione pari a 70 eV; l’acquisizione dei dati (mass range 40-300 Da) è stata impostata sia in modalità Full Scan (lo spettrometro di massa rivela tutti i rapporti m/z delle molecole in uscita) sia in Single Ion Monitoring o SIM (usato quando l’identità della molecola in analisi è nota a priori perché, rivelando solo lo specifico rapporto m/z , si aumenta di molto la speci-ficità e sensibilità del sistema di rivelazione), con un tempo di scan di 0,2”.
Per l’analisi quantitativa della TMA presente nei campioni, è stato usato il software Thermo Scien-tificTM XcaliburTM 2.1.0 build 1139 (versione 1.0.1.03) normalizzando inizialmente sullo SI, e suc-cessivamente quantificando il composto sulla base della retta di calibrazione.
La soluzione madre di TMA standard (100 mM) è stata preparata sciogliendo 47,8 mg di TMA-HCl (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo., USA.) in 5 mL di buffer Na2HPO4-NaOH (50 mM). Questa solu-zione è stata poi diluita per avere una solusolu-zione alla concentrasolu-zione 1 mM da cui, per diluizioni successive, sono stati preparati 6 standard alle concentrazioni indicate in Tabella 2.5, in triplicato. In ogni vial (15 mL) d’analisi sono stati inseriti 0,5 mL di ciascun standard, 25 μL di SI (10 mM) e 4,5 mL di buffer. L’analisi degli standard è stata preceduta da quella del “bianco”, una vial vuota, per verificare la presenza di eventuali interferenze.
Tabella 2.5 Concentrazioni degli Standard di TMA usati per la costruzione delle rette di taratura dell’analisi della TMA me-diante GC-MS. Standard Concentrazione TMA (uM) 1 1 2 10 3 20 4 50 5 100 6 200
2.7 Analisi statistica dei dati e delle componenti principali (PCA)
Per l’analisi statistica dei dati ottenuti è stato utilizzato il software STATISTICA StatSoft®, Inc. 1984-2010 (versione 9.1). E’ stata eseguita l’analisi della varianza ANOVA ed in caso di
significa-42 tività le similarità fra le medie sono state attribuite dal post-hoc (Bonferroni o LSD). Il livello di si-gnificatività è stato fissato con un intervallo di confidenza del 95% (P-value < 0,05).
L’analisi delle componenti principali (PCA) dei delta di crescita di ogni gruppo batterico (T24-T0) insieme ai valori delle produzioni di TMA (T24-T0) e dei consumi di colina (T0-T24) di ogni cam-pione, è stata eseguita usando il software PAST® ver. 3.06 (Hammer & Harper, University of Oslo, 2015).
