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5.DISCUSSIONE
Lo sviluppo craniofacciale richiede l’integrazione di segnali intrinseci ed estrinseci forniti da vari tessuti come le creste neurali, l’endoderma e l’ectoderma delle tasche faringee e il mesoderma parassiale.
Nonostante i fattori intrinseci espressi a livello delle creste neurali craniche (NCCs) giochino un ruolo critico nel controllo della normale morfogenesi degli archi faringei, adesso comincia ad esser chiaro che il corretto sviluppo delle strutture craniofacciali è fortemente influenzato anche dall’interazione delle NCCs con l’ambiente che le circonda (Trainor, 2005).
In questo scenario complesso gli studi condotti nel nostro laboratorio hanno fornito nuove indicazioni sui meccanismi molecolari che intervengono nello sviluppo cranio-facciale. Attraverso esperimenti funzionali condotti in embrioni di Xenopus è stato infatti dimostrato in vivo, che il “signaling” mediato dal recettore 5-HT2B è richiesto durante lo sviluppo scheletrico cranio-facciale in quanto influisce sul comportamento post-migratorio delle NCCs che migrano nel primo arco branchiale e formano l’articolazione mascella-mandibola (Reisoli et al., 2010).
Nell’ambito di questa problematica i dati ottenuti nel mio lavoro di tesi suggeriscono che il recettore serotoninergico 5-HT2B possa utilizzare la PLC beta 3 come principale effettore nella via di trasduzione del segnale coinvolta nella morfogenesi cranio-facciale.
Mediante esperimenti di perdita di funzione effettuati tramite microiniezione di un morpholino diretto contro la PLC beta 3 in embrioni precoci di Xenopus, ho ottenuto embrioni con specifici difetti cranio-facciali in gran parte sovrapponibili a quelli ottenuti dopo abrogazione della funzione del gene 5-HT2B.
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58 Più specificatamente i difetti cranio-facciali consistono in un quadrato ipomorfico fuso con la cartilagine di Meckel a formare un unico elemento, da cui deriva la perdita della articolazione mascella-mandibola ed in alcuni casi anche la perdita della parte distale della cartilagine di Meckel con una penetranza variabile. La diretta conseguenza di questa anomalia scheletrica è rappresentata dall’incapacità di aprire la bocca.
Questi dati quindi suggeriscono che la PLC beta 3 rappresenti l’effettore della via di trasduzione del segnale del recettore 5-HT2B durante lo sviluppo degli elementi scheletrici dell’arco mandibolare derivati dalle NCCs.
Allo scopo di confermare questo dato ed in particolare di dimostrare una interazione epistatica tra il recettore 5-HT2B e la PLC beta 3 sono state effettuate singole iniezioni e coiniezioni dei due morpholini a concentrazioni sotto soglia. Solo la coiniezione ha prodotto il fenotipo atteso.
Questi risultati dimostrano un’azione sinergica tra il recettore 5-HT2B e la PLC beta 3 e confermano il ruolo di quest’ultima come effettore della via del segnale attivata dal recettore 5-HT2B durante lo sviluppo cranio-facciale.
In conclusione il “signaling” del recettore 5HT2B è sufficiente e necessario a modulare la forma e la funzionalità di distinti elementi della mascella, incluso l’articolazione mascella-mandibola che è la maggior novità evolutiva dei vertebrati.
Il fenotipo ottenuto in questi esperimenti è molto simile a quello descritto a seguito di esperimenti di perdita di funzione del gene per l’endotelina (End1) condotti su embrioni di zebrafish (Miller et al., 2003). L’endotelina1, è un piccolo peptide secreto che induce l’attivazione di un recettore (Ednra) accoppiato a una proteina G della famiglia Gq/G11. Il mutante edn1 che manca del recettore Ednra presenta la cartilagine di Meckel fusa con il palatoquadrato. Questo significa che l’abrogazione del recettore porta come risultato alla perdita dell’articolazione mascella-mandibola. La via di segnalazione dell’endotelina sembra essere conservata nei vertebrati ed è stato dimostrato
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59 che il suo effettore è la PLC in particolare la PLC beta 3. Possiamo perciò ipotizzare che nella morfogenesi cranio-facciale, il recettore per l’endotelina e il recettore 5-HT2B cooperino nell’attivare una comune via di segnalazione il cui effettore è la PLC beta 3.
Poiché il recettore 5-HT2B sembra essere coinvolto anche nella morfogenesi oculare (vedi tesi Pietrasanta) nel mio lavoro di tesi ho cercato di rispondere alla domanda se anche in questo distretto la PLC beta 3 rappresentasse l’effettore della via di trasduzione del segnale attivata dal recettore 5-HT2B.
Lo sviluppo dell’occhio nei vertebrati è un complesso processo che coinvolge molteplici interazioni induttive tra il neuroectoderma del prosencefalo, l’ectoderma superficiale e le cellule delle creste neurali (Trainor and Tamm 1995; Cvekl and Tamm, 2004). In particolare alla morfogenesi dell’occhio contribuisce il mesenchima perioculare (POM), una struttura formata da cellule mesenchimali che derivano sia dalle creste neurali che dal mesoderma, e che circondano l’occhio nelle prime fasi di sviluppo (Gage and Zacharias,2009).
Nel nostro laboratorio è stato dimostrato che in Xenopus a livello del POM risulta essere espresso il gene per il recettore serotoninergico 5-HT2B (De Lucchini et al., 2005; Reisoli et al., 2008; Reisoli et al., 2010). Insieme al recettore 5-HT2B risulta essere coespresso nel POM il gene per il fattore di trascrizione Pitx2, un gene fondamentale per lo sviluppo dell’occhio. Pertanto in esperimenti di perdita di funzione della PLC beta 3 ho analizzato l’espressione genica di Pitx2 nelle cellule del POM che si portano nel segmento
anteriore dell’occhio e che esprimono Pitx2.
Gli embrioni microiniettati con PLC-MO e ibridati con la sonda Pitx2 a stadio 33-34, presentano sulla superficie dell’occhio del lato iniettato un segnale di ibridazione ridotto.
Questo fenotipo potrebbe essere dovuto o a una “downregolazione” di Pitx2, o ad una alterata migrazione delle cellule che lo esprimono, o ancora, a
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60 fenomeni di apoptosi. Il fenotipo riscontrato negli embrioni iniettati con il PLC beta 3-MO e ibridati con la sonda Pitx2 è simile a quello mostrato dagli embrioni iniettati con il 5-HT2B-MO, in esperimenti condotti in parallelo nel mio laboratorio. Questi dati suggeriscono che anche durante la morfogenesi oculare il recettore 5-HT2B agisca utilizzando la PLC beta 3 come principale effettore.
Questa ipotesi trova supporto dai risultati ottenuti da esperimenti di ibridazione in situ in embrioni microiniettati con il PLC beta 3-MO in cui è stato utilizzato il marcatore Dct, specificatamente espresso nell’epitelio pigmentato.
I dati ottenuti confermano che il blocco della via di segnalazione della PLC beta 3 altera la morfogenesi oculare, determinando la mancata chiusura della fessura ottica. Fenotipo simile è stato riscontrato in esperimenti fatti in parallelo in cui è stato analizzato l’epitelio pigmentato, tramite ibridazione in situ con il marcatore Dct, di embrioni iniettati con il 5-HT2B-MO.
L’epitelio pigmentato della retina prende origine dal neuroepitelio della coppa ottica, ma per svilupparsi correttamente necessita di segnali induttivi da parte di altre cellule, tra cui quelli provenienti dalle cellule del POM che derivano dalle creste neurali. L’epitelio pigmentato inoltre partecipa alla chiusura della fessura ottica (Bharti et al.,2006; Martìnez-Morales et al.,2004). È possibile ipotizzare che bloccando la segnalazione della PLC beta 3 viene alterato il comportamento delle cellule del POM che derivano dalle creste neurali e questo potrebbe causare delle modificazioni nei segnali induttivi necessari al corretto sviluppo dell’epitelio pigmentato, determinando la mancata chiusura della fessura ottica.
Esperimenti di immunoistochimica mi hanno permesso di visualizzare i muscoli estrinseci dell’occhio che, negli embrioni iniettati con PLC beta 3-MO, risultano avere una connettività alterata. Questo fenotipo risulta sovrapponibile a quello ottenuto negli embrioni iniettati con il 5-HT2B-MO.
Come noto da esperimenti effettuati sul topo, le cellule del POM che derivano dalle creste neurali contribuiscono alla formazione del tessuto
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connettivo che riveste i muscoli estrinseci dell’occhio (Shih et al., 2006), ma
non nella formazione del muscolo che è di derivazione mesodermica. Quindi un’alterazione della via di segnalazione della PLC beta 3, probabile effettore del recettore 5-HT2B, potrebbe interferire con la morfogenesi delle fasce connettivali, modificando l’inserzione dei muscoli extraoculari.
Questi ulteriori risultati avvalorano la tesi che la PLC beta 3 questa sia il principale effettore del recettore 5-HT2B non solo nello sviluppo cranio-facciale, ma anche durante la morfogenesi oculare in Xenopus.
