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INDICE
RIASSUNTO ... 3
SUMMARY... 6
CAPITOLO 1 INTRODUZIONE... 8
1.1 Le microparticelle (MP): ... 8 1.1.1 Caratteristiche delle MP ... 91.1.2 Le MP nei processi fisiopatologici ... 9
1.1.3 Effetti delle MP sulla modulazione della sintesi delle due chemochine IL-8 e MCP-1 ... 11
1.1.4 Proteomica e MP: cenni... 12
1.2 L'Epitelio delle vie aeree ... 14
1.2.1 Cenni di anatomia... 14
1.2.2 Funzioni dell'epitelio delle vie aeree ... 15
1.3 Le Chemochine ... 19
1.3.1 IL-8 (Interleukine-8)... 21
1.3.2 MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1) ... 21
CAPITOLO 2: SCOPO DEL LAVORO ... 24
CAPITOLO 3: MATERIALI E METODI ... 25
3.1 Materiali ... 25
3.1.1. Terreni di coltura e supplementi... 25
3.1.2 Trattamenti... 25
3.1.3 Kit ELISA ... 25
3.1.4 Primers e reagenti per RT-PCR... 25
3.1.5 SDS-PAGE ... 26
3.1.6 Soluzioni e buffers... 26
3.1.7 Modelli sperimentali... 30
3.2 Metodi ... 31
3.2.1Le colture cellulari... 31
3.2.2 Induzione di microparticelle da parte delle U937 attivate con Calcio-ionoforo A23187 (C29H37 N3O6) e stimolazione delle A549... 32
3.2.3 Effetto del salbutamolo sulla generazione delle MP ... 33
3.2.4 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) per la misurazione di MCP-1 ... 33
3.2.5 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) per la misurazione di IL-8 34 3.2.6 Estrazione di RNA... 35
3.2.7 RT-PCR ... 36
3.2.8 Valutazione del profilo proteico mediante SDS-PAGE delle MP e U937 .... 37
3.2.9 Determinazione proteica mediante il saggio di Bradford ... 37
3.2.10 SDS-PAGE... 38
3.2.11 Visualizzazione delle MP generate dalle U937 tramite la citofluorimetria a flusso (FACS) ... 39
3.3 Presentazione dei dati ed analisi statistica... 40
CAPITOLO 4: RISULTATI... 41
4.1 Le MP generate dalle U937 stimolate con A23187 aumentano la sintesi di IL-8 nelle A549. ... 41
4.2 L’attività biologica delle MP generate dalle U937 ayttivate con A23187, viene persa a seguito di filtrazione con filtri da 0.22µm e 100kDa. ... 42
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4.3 Le MP di U937 stimolate con concentrazioni crescenti di A23187 inducono aumento di IL-8 nelle A549 in modo direttamente proporzionale alla concentrazione
di A23187. ... 43
4.4 L’RT-PCR mostra un aumento di mRNA di IL-8 nelle A549 stimolate con il sovranatante delle U937 attivate con A23187... 44
4.5 Le MP generate dalle U937 stimolate con A23187, inducono un aumento di MCP-1 nelle A549. ... 45
4.6 IL lisato delle MP generate dalle U937 stimolate con A23187 applicato alle A549, induce in queste ultime un aumento di MCP-1 anche maggiore delle MP integre... 46
4.7 Il salbutamolo inibisce le oscillazioni del Ca2+ intracellulare contrastando l’azione del A23187. ... 47
4.8 L’RT-PCR mostra un aumento di mRNA di MCP-1 nelle A549 stimolate con il sovranatante delle U937 attivate con A23187... 48
4.9 Le MP generate dalle U937 stimolate con A23187 sono state contate mediante citofluorimetria a flusso (FACS). ... 49
4.10 e MP generate dalle U937 stimolate con A23187 sono state lisate ed è stato analizzato il loro contenuto proteico... 50
