3 RISULTATI.
3.1 Studio della sequenza del 3’UTR del trascritto della leptina.
Al momento dell’inizio del presente lavoro, la sequenza del messaggero della leptina nel topo (Mus musculus), non era completamente nota. La porzione disponibile in banca dati (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=nucleotide ACCESSION NUMBER:U18812) infatti, risultava costituita da 2793 nt (figura 1) contro i 3430nt della
sequenza completa caratterizzata nell’uomo (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=nucleotide ACCESSION
NUMBER:BC060830), mancando sia dell’elemento CPS (cleavage and polyadenylation sequence), di sequenza consensus: AAUAAA, che della coda di poliadenilazione, elementi caratterizzanti la regione terminale 3’UTR degli RNA messaggeri.
Utilizzando RNA totale estratto da tessuto adiposo bianco (WAT) di topo, abbiamo clonato la porzione terminale completa della regione 3’UTR del trascritto della leptina tramite 3’RACE (3’ rapid amplification of cDNA ends). In figura 3 è indicata la posizione del primer utilizzato per la 3’RACE (leptin F 3’UTR).
Il prodotto di 3’RACE (non mostrato), risolto su gel di agarosio al 2%, è caratterizzato da una singola banda all’altezza di circa 500 pb in riferimento ad un DNA ladder corso in parallelo (1KB DNA ladder, Gibco-BRL). Tale dimensione corrisponde, approssimativamente, alla lunghezza attesa per l’amplificato (511 pb, vedi figura 3), ipotizzando che l’mRNA della leptina abbia una dimensione molto simile in uomo e in topo. Il prodotto di 3’RACE, come evidenziato dall’esito del sequenziamento automatico, è lungo esattamente 444 nt, contiene l’elemento CPS a valle del quale inizia la coda di poliadenilazione (figura 2), indicando che la sequenza del messaggero è completa.
Questa porzione di 444 nt permette di estendere la regione nota del 3’UTR del trascritto della leptina di topo a 3241 nt.
L’intera regione 3’UTR è stata analizzata per la presenza di eventuali elementi consensus noti per essere implicati nella regolazione della stabilità e/o traducibilità dei trascritti, in particolare è stata ricercata la presenza di elementi AREs (A-U rich elements).
Sono stati individuati all’interno della regione 3’UTR completa, 6 elementi ARE classificabili per sequenza e disposizione, nell’ambito degli elementi AREs di classe 1, noti
per l’interazione con fattori trans-attivi implicati nella modulazione dell’emivita dei messaggeri e caratterizzati dalla presenza del consensus UUAUUU(U/A)(U/A)U (Zhang et al. , 2002).
Nel cDNA si rileva la presenza di un nonamero ATTTATTTA(posizione + 1003) di un pentamero ATTTA (posizione +2234) e di un elemento TTTTATA (posizione +2491) (figura 2).
L’elemento CPS/PAE di sequenza : AATAAA (posizione +3217), è pressoché ubiquitario nella regione terminale 3’ UTR di tutti gli mRNA, essendo lo stesso fattore cis-attivo che dirige il processo di cleavage e aggiunta della corta coda di poliadenilazione (<250 nt) in sede nucleare, nella fase di maturazione del trascritto nascente (Zhao et al., 1999). La sua presenza assume un significato particolare quando presente in concomitanza con l’elemento CPE (cytoplasmic polyadenylation element) di sequenza: TTTTAT, che invece compare con una bassa frequenza nei messaggeri (Richter e Thurkauf, 2001), presente anch’esso nella regione 3’ UTR da noi caratterizzata (posizione +2840 e + 3197) (figura 2).
Entrambi questi fattori, infatti, sono essenziali nel processo di poliadenilazione citoplasmatica (Mendez e Richter, 2001).
È noto che la disposizione dell’elemento CPE a monte del CPS/PAE, sia un fattore critico nel determinare la funzionalità del processo di poliadenilazione citoplasmatica (Richter, 1999).
È stato osservato, inoltre, che l’efficienza del processo di poliadenilazione citoplasmatica, è massima allorquando l’elemento CPE si trova collocato a monte rispetto all’elemento CPS/PAE separato da questo da un tratto di sequenza aspecifica di ampiezza compresa tra 10 e 30 nt (Richter, 1999). Nel messaggero della leptina, l’elemento CPE si trova al 5’ dell’elemento CPS/PAE ad una distanza di 14 nt (figura 2).
Nel complesso queste osservazioni indicano che, da un punto di vista puramente strutturale, il messaggero della leptina possa essere soggetto al fenomeno della poliadenilazione citoplasmatica e si può ipotizzare che tale processo possa avere effetto sulla la stabilità/traducibilità dello stesso messaggero, quindi determinare una regolazione post-trascrizionale della produzione dell’ormone.
PubMed Nucleotide Protein
1: U18812. Mus musculus obes...[gi:746416] Links
LOCUS MMU18812 2793 bp mRNA linear ROD 30-MAR-1995 DEFINITION Mus musculus obese precursor (ob) mRNA, complete cds.
ACCESSION U18812
ORGANISM Mus musculus Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Rodentia; Sciurognathi; Muridae; Murinae; Mus.
REFERENCE 1 (bases 1 to 2793) AUTHORS Zhang,Y., et al.
TITLE Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue JOURNAL Nature 372 (6505), 425-432 (1994)
REFERENCE 2 (bases 1 to 2793) CDS 57..560 ORIGIN
1 ggatccctgc tccagcagct gcaaggtgca agaagaagaa gatcccaggg aggaaaatgt
61 gctggagacc cctgtgtcgg ttcctgtggc tttggtccta tctgtcttat gttcaagcag 121 tgcctatcca gaaagtccag gatgacacca aaaccctcat caagaccatt gtcaccagga 181 tcaatgacat ttcacacacg cagtcggtat ccgccaagca gagggtcact ggcttggact 241 tcattcctgg gcttcacccc attctgagtt tgtccaagat ggaccagact ctggcagtct 301 atcaacaggt cctcaccagc ctgccttccc aaaatgtgct gcagatagcc aatgacctgg 361 agaatctccg agacctcctc catctgctgg ccttctccaa gagctgctcc ctgcctcaga 421 ccagtggcct gcagaagcca gagagcctgg atggcgtcct ggaagcctca ctctactcca 481 cagaggtggt ggctttgagc aggctgcagg gctctctgca ggacattctt caacagttgg 541 atgttagccc tgaatgctga agtttcaaag gccaccaggc tcccaagaat catgtagagg
601 gaagaaacct tggcttccag gggtcttcag gagaagagag ccatgtgcac acatccatca 661 ttcatttctc tccctcctgt agaccaccca tccaaaggca tgactccaca atgcttgact 721 caagttatcc acacaacttc atgagcacaa ggaggggcca gcctgcagag gggactctca 781 cctagttctt cagcaagtag agataagagc catcccatcc cctccatgtc ccacctgctc 841 cgggtacatg ttcctccgtg ggtacacgct tcgctgcggc ccaggagagg tgaggtaggg 901 atgggtagag cctttgggct gtctcagagt ctttgggagc accgtgaagg ctgcatccac 961 acacagctgg aaactcccaa gcagcacacg atggaagcac ttatttattt attctgcatt 1021 ctattttgga tggatctgaa gcaaggcatc agctttttca ggctttgggg gtcagccagg 1081 atgaggaagg ctcctggggt gctgctttca atcctattga tgggtctgcc cgaggcaaac 1141 ctaatttttg agtgactgga aggaaggttg ggatcttcca aacaagagtc tatgcaggta 1201 gcgctcaaga ttgacctctg gtgactggtt ttgtttctat tgtgactgac tctatccaaa 1261 cacgtttgca gcggcattgc cgggagcata ggctaggtta ttatcaaaag cagatgaatt 1321 ttgtcaagtg taatatgtat ctatgtgcac ctgagggtag aggatgtgtt agagggaggg 1381 tgaaggatcc ggaagtgttc tctgaattac atatgtgtgg taggcttttc tgaaagggtg 1441 aggcattttc ttacctctgt ggccacatag tgtggctttg tgaaaaggac aaaggagttg 1501 actctttccg gaacatttgg agtgtaccag gcacccttgg aggggctaaa gctacaggcc 1561 ttttgttggc atattgctga gctcagggag tgagggcccc acatttgaga cagtgagccc 1621 caagaaaagg gtccctggtg tagatctcca aggttgtcca gggttgatct cacaatgcgt 1681 ttcttaagca ggtagacgtt tgcatgccaa tatgtggttc tcatctgatt ggttcatcca 1741 aagtagaacc ctgtctccca cccattctgt ggggagtttt gttccagtgg gaatgagaaa 1801 tcacttagca gatggtcctg agccctgggc cagcactgct gaggaagtgc cagggcccca 1861 ggccaggctg ccagaattgc ccttcgggct ggaggatgaa caaaggggct tgggtttttc 1921 catcacccct gcaccctatg tcaccatcaa actggggggc agatcagtga gaggacactt 1981 gatggaaagc aatacacttt aagactgagc acagtttcgt gctcagctct gtctggtgct 2041 gtgagctaga gaagctcacc acatacatat aaaaatcaga ggctcatgtc cctgtggtta 2101 gaccctactc gcggcggtgt actccaccac agcagcaccg caccgctgga agtacagtgc 2161 tgtcttcaac aggtgtgaaa gaacctgagc tgagggtgac agtgcccagg ggaaccctgc 2221 ttgcagtcta ttgcatttac ataccgcatt tcagggcaca ttagcatcca ctcctatggt 2281 agcacactgt tgacaatagg acaagggata ggggttgact atcccttatc caaaatgctt 2341 gggactagaa gagttttgga ttttagagtc ttttcaggca taggtatatt tgagtatata 2401 taaaatgaga tatcttgggg atggggccca agtataaaca tgaagttcat ttatatttca 2461 taataccgta tagacactgc ttgaagtgta gttttataca gtgttttaaa taacgttgta 2521 tgcatgaaag acgtttttac agcatgaacc tgtctactca tgccagcact caaaaacctt 2581 ggggttttgg agcagtttgg atcttgggtt ttctgttaag agatggttag cttataccta 2641 aaaccataat ggcaaacagg ctgcaggacc agactggatc ctcagccctg aagtgtgccc 2701 ttccagccag gtcataccct gtggaggtga gcgggatcag gttttgtggt gctaagagag 2761 gagttggagg tagattttgg aggatctgag ggc (+ 2793)
Figura 1
Sequenza incompleta del cDNA del messaggero della leptina in Mus
musculus, nota al momento dell’inizio del presente lavoro.(ACCESSION
NUMBER:U18812).
In verde è evidenziata la regione 5’ UTR, in rosso la ORF, in nero la porzione nota della regione 3’UTR.
AGTTTCAAAGGCCACCAGGCTCCCAAGAATCATGTAGAGGGAAGAAACCTTGGCTTCCAGGGGTCTTCAGGAGAAGAG AGCCATGTGCACACATCCATCATTCATTTCTCTCCCTCCTGTAGACCACCCATCCAAAGGCATGACTCCACAATGCTTGA CTCAAGTTATCCACACAACTTCATGAGCACAAGGAGGGGCCAGCCTGCAGAGGGGACTCTCACCTAGTTCTTCAGCAAG TAGAGATAAGAGCCATCCCATCCCCTCCATGTCCCACCTGCTCCGGGTACATGTTCCTCCGTGGGTACACGCTTCGCTG CGGCCCAGGAGAGGTGAGGTAGGGATGGGTAGAGCCTTTGGGCTGTCTCAGAGTCTTTGGGAGCACCGTGAAGGCTG CATCCACACACAGCTGGAAACTCCCAAGCAGCACACGATGGAAGCACTTATTTATTTATTCTGCATTCTATTTTGGA TGGATCTGAAGCAAGGCATCAGCTTTTTCAGGCTTTGGGGGTCAGCCAGGATGAGGAAGGCTCCTGGGGTGCTGCTTT CAATCCTATTGATGGGTCTGCCCGAGGCAAACCTAATTTTTGAGTGACTGGAAGGAAGGTTGGGATCTTCCAAACAAGA GTCTATGCAGGTAGCGCTCAAGATTGACCTCTGGTGACTGGTTTTGTTTCTATTGTGACTGACTCTATCCAAACACGTTT GCAGCGGCATTGCCGGGAGCATAGGCTAGGTTATTATCAAAAGCAGATGAATTTTGTCAAGTGTAATATGTATCTATGTG CACCTGAGGGTAGAGGATGTGTTAGAGGGAGGGTGAAGGATCCGGAAGTGTTCTCTGAATTACATATGTGTGGTAGGC TTTTCTGAAAGGGTGAGGCATTTTCTTACCTCTGTGGCCACATAGTGTGGCTTTGTGAAAAGGACAAAGGAGTTGACTCT TTCCGGAACATTTGGAGTGTACCAGGCACCCTTGGAGGGGCTAAAGCTACAGGCCTTTTGTTGGCATATTGCTGAGCTC AGGGAGTGAGGGCCCCACATTTGAGACAGTGAGCCCCAAGAAAAGGGTCCCTGGTGTAGATCTCCAAGGTTGTCCAGG GTTGATCTCACAATGCGTTTCTTAAGCAGGTAGACGTTTGCATGCCAATATGTGGTTCTCATCTGATTGGTTCATCCAAA GTAGAACCCTGTCTCCCACCCATTCTGTGGGGAGTTTTGTTCCAGTGGGAATGAGAAATCACTTAGCAGATGGTCCTGA GCCCTGGGCCAGCACTGCTGAGGAAGTGCCAGGGCCCCAGGCCAGGCTGCCAGAATTGCCCTTCGGGCTGGAGGATG AACAAAGGGGCTTGGGTTTTTCCATCACCCCTGCACCCTATGTCACCATCAAACTGGGGGGCAGATCAGTGAGAGGACA CTTGATGGAAAGCAATACACTTTAAGACTGAGCACAGTTTCGTGCTCAGCTCTGTCTGGTGCTGTGAGCTAGAGAAGCT CACCACATACATATAAAAATCAGAGGCTCATGTCCCTGTGGTTAGACCCTACTCGCGGCGGTGTACTCCACCACAGCAG CACCGCACCGCTGGAAGTACAGTGCTGTCTTCAACGGTGTGAAAGAACCTGAGCTGAGGGTGACAGTGCCCAGGGGAA CCCTGCTTGCAGTCTATTGCATTTACATACCGCATTTCAGGGCACATTAGCATCCACTCCTATGGTAGCACACTGTTG ACAATAGGACAAGGGATAGGGGTTGACTATCCCTTATCCAAAATGCTTGGGACTAGAAGAGTTTTGGATTTTAGAGTCTT TTCAGGCATAGGTATATTTGAGTATATATAAAATGAGATATCTTGGGGATGGGGCCCAAGTATAAACATGAAGTTCATTTA TATTTCATAATACCGTATAGACACTGCTTGAAGTGTAGTTTTATACAGTGTTTTAAATAACGTTGTATGCATGAAAGAC GTTTTTACAGCATGAACCTGTCTACTCATGCCAGCACTCAAAAACCTTGGGGTTTTGGAGCAGTTTGGATCTTGGGTTTT CTGTTAAGAGATGGTTAGCTTATACCTAAAACCATAATGGCAAACAGGCTGCAGGACCAGACTGGATCCTCAGCCCTGA AGTGTGCCCTTCCAGCCAGGTCATACCCTGTGGAGGTGAGCGGGATCAGGTTTTGTGGTGCTAAGAGAGGAGTTGGAG GTAGATTTTGGAGGATCTGAGGGC (+ 2793)
GTGATGTGATG
TTTTAT
TGGACACTTGGTATGTTGAAGGGATGAAAGTCCAAACAGGAAGT GACAGGGAAGACTGAAGAGACCGGGAAAGAGTGACAGGAAGTGCTGAGAGGACTTTATGGGC CACAAAAGTGGCTTCTGAAAGATCCCACGTGCCACAGTCTGGAGCGAAGGCTCGTGGTGGCT GGTGTCAGATTGCTCTGGGGCTGTGCTATGCCACCTTGGTCACCTCATCAAGCTGGAATGTCC TGAGCCTTTCGCTCAGAGAACCTTGCACTATGGCTTGTTCCCAGATTGTGAAACTTCCCATATG CAAAAATGCTTGGTTTGGTTTTTTTGGTTTTTGTTTTTGTTTTCTTTTTTAAATACATATATATATG TAACAACAGCAACAACAAAATTTTGTTTTAT
TTTGTGTCAATTCAAATAAA
TTAATGATGC CTCC(+ 3241) AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (+3261)Figura 2
Sequenza di cDNA corrispondente all’intrera regione 3’ UTR del messaggero della leptina. La sequenza in nero, fino alla posizione + 2793, corrisponde alla porzione precedentemente nota del messaggero (ACCESSION NUMBER:U18812).
La porzione in rosso corrisponde a 444 nt isolati tramite 3’RACE da RNA totale da tessuto adiposo bianco di topo.
In posizione + 3241 inizia il tratto di coda di poliadenilazione minima di 20nt indicata in
corsivo.
In grassetto sono evidenziati elementi di sequenza omologhi al consensus noto per alcuni elementi AREs di classe 1.
In blu sono evidenziati due elementi CPE (cytoplasmic polyadenylation element).
In verde è indicato un elemento CPS/PAE (cleavage polyadenylation
+2521 tgcatgaaagacgtttttacagcatgaacctgtctactcatgccagcactcaa aaaccttggggttttggagcagtttggatcttgggttttctgttaagagatgg ttagcttatacctaaaaccataatggcaaacaggctgcaggaccagactggat cctcagccctgaagtgtgcccttccagccaggtcataccctgtggaggtgagc
gggatcaggttttgtggtgctaagagaggagttggaggtagattttggaggat ctgagggcgtgatgtgatgttttattggacacttggtatgttgaagggatgaa agtccaaacaggaagtgacagggaagactgaagagaccgggaaagagtgacag gaagtgctgagaggactttatgggccacaaaagtggcttctgaaagatcccac gtgccacagtctggagcgaaggctcgtggtggctggtgtcagattgctctggg gctgtgctatgccaccttggtcacctcatcaagctggaatgtcctgagccttt
cgctcagagaaccttgcactatggcttgttcccagattgtgaaacttcccata
tgcaaaaatgcttggtttggtttttttggtttttgtttttgttttctttttaa atacatatatatatgtaacaacagcaacaacaaaattttgttttattttgtgt caattcaaataaattaatgatgcctccaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’+3261 +2746 +3251 TTTTTTTTTTTTTTGCGCCGGCGC Oligo-d(T Anchor)12 TTAAGTTTATTTAATTACTACGGAGG leptin 3’ PROBE R leptin 3’ PROBE F +3094 LEPTIN F 3’UTR +3065 LEPTIN #1 Figura 3
Rappresentazione dei primers utilizzati, in relazione alla sequenza del cDNA di una parte del 3’UTR del messaggero della leptina.
In figura è riportata una porzione del 3’UTR: dalla posizione +2521 alla coda minima di poliadenilazione di20 nt.
In rosso è indicata la sequenza dei primers (foreward) disegnati sul filamento senso del cDNA.
In blu sono riportate le sequenze dei primers (reverse) complementari al filamento senso del cDNA.
3.2 Studio di espressione della proteina CPEB negli adipociti.
La proteina CPEB (cytoplasmic polyadenylation element binding protein) lega gli elementi CPE e regola la poliadenilazione citoplasmatica. Ci siamo quindi chiesti se, tale fattore, fosse espresso nel WAT, sito di produzione specifico ed elettivo per la leptina. Fin ora non era mai stata descritta l’ espressione del gene cpeb in questo distretto, ma affinché un sistema di controllo post-trascrizionale della produzione di leptina, basato sulla poliadenilazione citoplasmatica, possa essere attivo, è necessario che il gene della proteina CPEB si attivamente trascritto e tradotto negli adipociti.
3.2.1 Presenza del trascritto per CPEB.
Tramite RT-PCR (reverse transcription-PCR), condotta su RNA totale estratto da WAT di topo, è stata valutata la presenza del messaggero per la proteina CPEB in questo tessuto.
Come controllo positivo è stato utilizzato RNA totale estratto da ovaie, mentre RNA totale estratto da milza è stato utilizzato come controllo negativo. I tessuti utilizzati come controllo sono stati scelti per il fatto che la proteina CPEB è stata descritta nei processi di oogenesi, anche nel topo (Richter, 2001), mentre nella milza non è mai stata caratterizzata.
Nel profilo elettroforetico su gel di agarosio al 2% del prodotto di RT-PCR per CPEB (figura 4), si evidenzia una unica banda che, come atteso, corre ad un’altezza di 300 pb (stimata da comparazione con 1Kb DNA ladder corso in parallelo).
Una singola banda è evidente nella corsia del prodotto di RT-PCR da RNA di ovaie (figura 4 A, corsia 2), la cui altezza stimata di 300 pb è del tutto sovrapponibile alla banda presente nella corsia del prodotto di RT-PCR da RNA di adipociti (corsia 1 figura 4 A).
Nel profilo eletroforetico del prodotto di RT-PCR, condotta su RNA da milza (figura 4 B ), non si nota nessuna banda, le corsie riservate al controllo negativo della PCR, (nel quale la reazione di PCR viene condotta con la stessa mix utilizzata per gli altri campioni, ma viene aggiunta H2O al posto di RNA) sono anch’esse prive di segnale e sono altresì assenti bande
aspecifiche.
Le osservazioni precedenti consentono di affermare che il gene per la proteina CPEB è attivamente trascritto in adipociti ex-vivo di WAT murino.
A 300 pb B 300 pb
1 2
1
2
Ctrl-Figura 4
Profilo elettroforetico su gel di agarosio al 2% del risultato di RT-PCR specifica per il messaggero di CPEB.
A) corsia 1: RT-PCR su RNA totale da ovaie.
corsia 2: RT-PCR su RNA totale da adipociti WAT. Ctrl - =controllo negativo (H2O).
B) corsia 1: RT-PCR su RNA totale da adipociti WAT. corsia 2: RT-PCR su RNA totale da milza.
Ctrl - =controllo negativo (H2O).
Le frecce indicano l’altezza corrispondente a 300 pb in riferimento ad un DNA ladder di 1Kb (non mostrato in A).
3.2.2 Presenza della proteina CPEB.
La proteina CPEB non è mai stata studiata negli adipociti, è noto però che nei tessuti da cui è stata isolata (tessuto nervoso, oociti, blastomeri) presenta una localizzazione citoplasmatica o nucleare (Piccioni et al., 2005).
Abbiamo preparato estratti proteici totali di tessuto adiposo bianco, cervello, polmone e sinaptosomi, che sono stati sottoposti a SDS-PAGE su gel di poliacrilammide al 12%, trasferimento su nitrocellulosa e successivo immunoblotting con un anticorpo anti CPEB 1 murina, l’isoforma più abbondante nel sistema nervoso di topo (Si et al., 2003).
L’estratto di cervello e quello da sinaptosomi sono stati utilizzati come controlli positivi, considerando che la proteina CPEB è stata descritta in diversi distretti cerebrali e che fa parte della PSD (post synaptic density), frazione proteica della quale sono arricchiti i sinaptosomi stessi (Si et al, 2003).
La figura 5 rappresenta il risultato del western blot.
Nella lastra autoradiografica si evidenzia un segnale abbastanza netto rispetto al rumore di fondo, ad un’altezza uguale per tutti i campioni e corrispondente ad un peso molecolare di 62 KDa, come previsto dalle specifiche dell’anticorpo utilizzato. La dimensione è stata stabilita sottoponendo a corsa ellettroforetica anche un marker di dimensioni molecolari (Kaleidoscope, Bio-Rad non mostrato). In particolare sono evidenti due bande molto ravvicinate in ogni corsia, probabilmente prodotte da una reattività crociata dell’anticorpo primario, con un’altra isoforma della proteina. Come controllo negativo è stato utilizzato un estratto proteico totale di polmone di topo, considerando che non sono noti studi di espressione della proteina CPEB in tale tessuto; nessun segnale è stato infatti evidenziato per immunoblotting di questo preparato (non mostrato).
Secondo quanto mostrato in figura 5 nei controlli positivi (cervello e sinaptosomi), il segnale relativo alla proteina CPEB 1 è più debole di quanto osservabile nel WAT: ciò è, dovuto ai diversi tempi di esposizione utilizzati, indicati nella didascalia della figura 5. Complessivamente si dimostra che la proteina CPEB 1 è tradotta e presente in adipociti ex-vivo di WAT di topo.
B A 62 KDa Figura 5
Profilo di immunoblotting per CPEB 1 da estratto proteico di adipociti, in A, e da estratto proteico di cervello e sinaptosomi, in B.
1
2 3
62KDa
Sono state ottenute due immagini dello stesso filtro esposto per 20 minuti in A e per 6 minuti in B.
Corsia 1 = estratto proteico di WAT di topo.
Corsia 2 = controllo positivo: estratto proteico di cervello di topo. Corsia 3 = controllo positivo: estratto proteico da sinaptosomi di topo.
Le frecce indicano il peso relativo delle bande presenti nell’immagine, dedotto dal profilo di un marker di dimensioni molecolari (Kaleidoscope, Bio-Rad, non mostrato).
3.3 Studio della poliadenilazione nell’mRNA della leptina.
3.3.1 Premesse teoriche e tecniche del metodo RACE-PAT.
La tecnica di RACE-PAT (rapid amplification of cDNA ends-polyadenylation test), permette di valutare l’estensione della coda di poliadenilazione di un particolare trascritto (figura 6).
L’RNA totale viene retrotrascritto in ss-cDNA utilizzando un oligo d(T)12 anchor
primer, che sia appaia alle code di poliadenilazione degli mRNA messaggeri.
Per ogni messaggero, più la coda di poliadenilazione è estesa, maggiori sono le probabilità che il primer si appai in posizioni diverse.
Di ogni mRNA si ottiene quindi un pool di ss-cDNA di lunghezza variabile.
Segue l’amplificazione del cDNA di interesse, utilizzando un primer specifico del suo 3’UTR (nel nostro caso Leptin #1 e aP2 F) e lo stesso oligo d(T)12 anchor primer.
Mediamente la lunghezza della coda di poliadenilazione degli RNA messaggeri è <250 nt, ma in quei trascritti che subiscono poliadenilazione citoplasmatica, può raggiungere 1000-2000 nt.
Se la leptina subisse un processo di poliadenilazione citoplasmatica, il prodotto di RACE-PAT, sarebbe costituito da un pool di cDNA di lunghezza variabile da un minimo di 201 pb (distanza dell’inizio della sequenza complementare al primer Leptin #1 alla fine della coda di poliadenilazione minima riportata sulla sequenza in figura. 3) ad un massimo di 1000 pb o più.
Se invece, la coda di poliadenilazione del messaggero della leptina, non subisse allungamento, il prodotto finale della RACE-PAT, sarebbe un pool di cDNA di lunghezza omogenea di circa 201 pb. Queste diverse situazioni si possono mettere in evidenza e possono essere discriminate, tramite corsa elettroforetica su gel di agarosio al 2% del prodotto di RACE-PAT. Nel caso in cui la coda di poliadenilazione del messaggero non subisca allungamento, il profilo sarà caratterizzato da una singola banda netta, mentre se la coda del messaggero venisse allungata, il prodotto di RACE-PAT, sarebbe evidenziabile come uno smear esteso e specifico sopra una banda minima di 201 pb.
Questa tecnica è stata utilizzata per visualizzare la lunghezza della coda di poliadenilazione del messaggero della leptina in WAT totale, in adipociti da coltura
primaria sottoposti a vari trattamenti, e in adipociti ottenuti dall’induzione del differenziamento terminale di colture di fibroblasti della linea cellulare stabile murina 3T3 L1.
AA 2 AAAAAAAAAAAA
Primer 3’UTR specifico
Anchor dt
RT, PCR RT, PCR
Lunghezza costante della coda di poliadenilazione
Lunghezza variabile della coda di poliadenilazione
Anchor dt
Primer 3’UTR specifico 1
Figura 6
Schema generale del saggio di poliadenilazione RACE-PAT (rapid amplification of cDNA ends-polyadenylation test).
1= generico messaggero che non subisce poliadenilazione citoplasmatica. 2= generico messaggero che subisce poliadenilazione citoplasmatica.
3.3.2 RACE-PAT sul tessuto adiposo bianco.
Per il saggio di poliadenilazione del messaggero della leptina, è stato utilizzato RNA totale estratto da WAT di topo. Il saggio viene condotto in duplicato e in parallelo per ogni campione. L’RNA totale estratto da ciascuno di essi, viene sottoposto a RACE-PAT utilizzando nella fase di amplificazione, per un set, il primer Leptin#1 e nell’altro il primer aP2 F. Il gene aP2, è espresso intensamente negli adipociti terminalmente differenziati, codificando per un fattore di trascrizione (TF) adipocita-specifico marker del commitment adipocitario (Herrea et al., 1989). Il messaggero del gene ap2 è stato utilizzato come controllo negativo del saggio di RACE-PAT, in quanto presenta una regione 3’UTR ridotta (lunga 895 nt), nella quale non si rileva l’elemento CPE (né altri elementi cis-regolatori noti); ci si attende perciò, che tale mRNA non sia interessato a processi di allungamento della coda di poliadenilazione in sede citoplasmatica.
Gli esperimenti sono stati condotti su topi C57 Bl/Ks wild type (wt) e su mutanti obesi della linea C57 Bl/Ks db/db. Tale mutante, che è geneticamente deficiente della forma funzionante del recettore della leptina (Lee et al., 1996), è stato scelto perche’ è un modello estremo di iperleptinemia (almeno 20 volte rispetto al wild type) (Maffei et
al., 1995 (B) ) permettendo quindi di valutare in vivo lo stato di poliadenilazione del
messaggero, in situazioni di estrema diversità della produzione dell’ormone. Nel topo
db/db si assiste anche ad una overespressione del messaggero della leptina, che non è
spiegabile solo sulla base di meccanismi trascrizionali. Considerando la struttura del 3’UTR del messaggero della leptina, è possibile ipotizzare che la maggior quantità di mRNA della leptina nei db/db possa essere messa in relazione causale con una alterazione dei sistemi di controllo post-trascrizionale, agenti sulla stabilità di questo messaggero in questi animali.
In figura 7 è rappresentato il profilo elettroforetico, acquisito al transilluminatore, del prodotto di RACE-PAT condotto sull’ RNA totale estratto dal WAT dei topi db/db e
wt.
Nel test condotto con Leptin#1 ( figura 7 A ) si osserva la presenza di una singola banda dell’altezza di 201 pb sormontata da un cospicuo smear sia nell’amplificato proveniente da animali wt che da db/db. Come risulta dal confronto con il profilo prodotto dal DNA ladder (1Kb DNA ladder, Gibco-BRL), lo smear si estende, in entrambi i casi fino ad una altezza apparente corrispondente alla migrazione di una
banda da 1000 pb circa. Non si mettono in evidenza significative differenze tra la lunghezza dello smear tra le corsie wt e db.
Il primer utilizzato nel controllo: aP2 F, è disegnato su un tratto della regione 3’ UTR del cDNA del trascritto di aP2, in modo da produrre un amplificato di RACE-PAT di circa 350 nt in assenza del fenomeno della poliadenilazione citoplasmatica. Il profilo di RACE-PAT condotta per aP2, è caratterizzato dall’assenza di smear e dalla presenza di una banda netta dell’altezza di 350 pb sia nel caso di RNA proveniente da wt che da
db/db.
È da notare anche una differenza nell’intensità delle bande a 201 pb nel caso della leptina, rispetto a quella delle bande di 350 pb nel caso di aP2, si nota infatti una luminosità ridotta nelle corsie di figura 7 A, nonostante i cicli di amplificazione utilizzati nella fase di PCR del test, fossero stabiliti con lo scopo di produrre una quantità di cDNA uniforme nei due set (30 cicli per la leptina e 35 cicli per aP2), considerando l’abbondanza di messaggero specifico presente negli adipociti. Questo effetto è molto probabilmente dovuto al fatto che una quantità simile di cDNA nei due casi, è localizzata in corrispondenza della banda minima nel caso di aP2 mentre si ripartisce lungo tutto lo smear, nel caso della leptina.
Nonostante la quantità di RNA totale di partenza fosse per ogni campione pari ad 1μg, si può notare anche una differenza nell’intensità del segnale proveniente da wt rispetto a db/db nel test condotto per il messaggero della leptina. Nonostante questo test sia tutt’altro che quantitativo, si osserva, coerentemente con quanto riportato in letteratura, una maggiore intensità della banda da 201 pb nella corsia del topo db/db.
Sia nel test condotto per aP2 che in quello per leptina il controllo negativo è privo di alcun segnale e in nessuna delle corsie si evidenzia alcuna banda aspecifica.
Questi risultati indicano che il messaggero della leptina presenta una coda di poliadenilazione di lunghezza molto superiore a quella esibita dal messaggero di Ap2.
Lo smear rappresentante la coda di poliadenilazione del cDNA della leptina raggiunge una lunghezza massima stimabile intorno a 1000 pb.
Si può osservare anche che la coda di poliadenilazione del messaggero della leptina, nei mutanti obesi db/db non è sensibilmente diversa (solo leggermente più corta) rispetto a quella di animali wt.
1 Kb 516 pb 350 pb 201 pb lept in/c
c-
db
wt
db
leptina
aP2
c-1Kb ladder B A
wt
Figura 7Profilo elettroforetico del risultato di RACE-PAT condotto in parallelo su RNA totale estratto da adipociti di tessuto adiposo bianco (WAT) di topo, con primer specifico per la leptina (A) o con primer specifico per AP2 (B).
C - =controllo negativo (H2O).
db = prodotto di RACE-PAT condotto su RNA totale proveniente da WAT di esemplari mutanti db/db della linea C57Bl/ks.
wt = prodotto di RACE-PAT condotto su RNA totale proveniente da WAT di esemplari wild type.
Di fianco all’immagine sono riportati, come riferimento, le dimensioni relative delle bande dedotte confrontando il profilo dei campioni con quello del DNA ladder (1Kb ladder).
Per un’accurata valutazione dell’estensione dello smear e della sua effettiva specificità, il prodotto di RACE-PAT del messaggero della leptina, una volta risolto su gel di agarosio al 2%, è stato trasferito su filtro di nitrocellulosa ed ibridato con una sonda di circa 100 pb specifica per il cDNA della leptina. La sonda è disegnata in maniera “nested”, ovvero internamente al prodotto di amplificazione delimitato dai primers leptin#1 e Anchor dT (vedi figura 3).
Si conserva un’immagine del gel acquisita al transilluminatore, in cui è stata allineata una scala centimetrica al profilo del DNA ladder.
La figura 8, rappresenta l’autoradiografia del filtro trasferito dal gel rappresentato in figura 7.A dopo l’ibridazione con la sonda “nested”. La scala centimetrica nell’immagine agli U.V. viene riportata, in proporzione, sull’immagine acquisita del profilo di ibridazione e questo permette di osservare che l’ibridazione della sonda è avvenuta lungo tutta l’estensione dello smear, con un minimo in corrispondenza della banda di 201 pb. Il profilo di ibridazione, quindi, indica che gli smear non sono un artefatto tecnico, ma un segnale specifico che contiene, al suo interno, un tratto terminale del 3’UTR del cDNA della leptina e una estesa coda di poliadenilazione. Non si osserva, come atteso, alcun segnale né nel caso dei prodotti di PCR amplificati con il primer aP2 F (non mostrato), né nel controllo negativo, nel quale è assente il prodotto di RACE-PAT, assicurando che la procedura non ha subito contaminazioni significative.
L’ibridazione conferma che la lunghezza degli smear è solo leggermente minore nei topi db/db rispetto ai wt. È evidente una lieve differenza dell’intensità del segnale prodotto dalla sonda nel caso db, come già osservato al transilluminatore.
1 Kb
250 pb
db
wt
leptina
Figura 8
Autoradiografia del southern blot ottenuto dalla porzione A di gel rappresentato nella figura 7.
Di fianco, è riportata, in proporzione, la scala di riferimento corrispondente a quella affiancata al DNA ladder di figura 7.
3.3.3 Saggio dello stato di poliadenilazione della leptina su 3T3 L1.
La linea cellulare stabile murina di fibroblasti 3T3-L1, viene differenziata terminalmente in adipociti, tramite la somministrazione di un mix di differenziamento (vedi materiali e metodi punto 2.3) con lo scopo di ottenere un modello cellulare in vitro di adipociti. Il differenziamento completo si manifesta con una tipica modificazione morfologica e può essere valutato specificamente tramite positività alla colorazione con coloranti lipofilici come l’Oil Red. Le cellule 3T3 L1 sono trattate nello stesso modo degli adipociti primari e sull’RNA totale estratto, è stato condotto un saggio di RACE-PAT .
In figura 9 è mostrato il profilo elettroforetico che si ottiene da questi campioni. Non si evidenzia nessun segnale specifico per il cDNA della leptina nel profilo elettroforetico (figura 9 B) dove non compare alcuna banda minima di 201 pb.
L’ibridazione su filtro con la sonda “nested” prima descritta, del Southern-blot del filtro in figura 9, non ha prodotto alcun segnale nei campioni provenienti da 3T3 L1 (non mostrato), indicando che gli smear visibili nel profilo elettroforetico, sono prodotti del tutto aspecifici. Sugli stessi campioni è stata testata, per RACE-PAT, anche la presenza della porzione terminale del trascritto di aP2 e in questo caso si mette in evidenza un segnale specifico sul profilo elettroforetico, indicato dalla presenza di bande minime di altezza compatibile con quella attesa per il saggio condotto con primer aP2 F (350 pb circa) (figura 9 A). Come controllo positivo, è stato utilizzato RNA totale estratto da adipociti primari di topo, processato in parallelo all’RNA dei 3T3 L1 (corsie 5 di figura 9 A e B) e RNA totale da adipociti primari di topo trattati con dexametasone 150 nM per 6H (corsie 6 di figura 9 A e B). In questi casi si mette in evidenza la presenza di un segnale specifico sia per il test con primer per aP2 che per leptina. Per le 3T3 L1 differenziate in adipociti, è descritto un livello di secrezione basale di leptina, molto basso in accordo con i livelli trascrizionali del gene ob (Rentsch e Chiesi, 1996) ed è nota una bassa responsività di queste cellule a trattamenti di breve durata con induttori della sintesi di leptina come insulina o glucocorticoidi (MacDougald et al., 1995). Queste osservazioni rendono inutile l’utilizzo delle 3T3 L1 nello studio di un eventuale meccanismo di poliadenilazione citoplasmatica alla base della produzione di leptina. Considerando che la quantità di mRNA della leptina espresso a livello basale in questo modello, può essere sotto il livello di sensibilità della tecnica di RACE-PAT, non è al momento possibile escludere comunque, che il meccanismo di poliadenilazione
citoplasmatica sia funzionante nelle 3T3 L1, d’altra parte non sono noti studi di espressione dei fattori trans-attivi implicati nella poliadenilazione citoplasmatica in questa linea cellulare.
aP2
leptina
300pb 200pb1 2
4
5 6
1
2 3
4
5
6
Ctrl+ 3T3 L1 Ctrl+ 3T3 L13
B A Figura 9Profilo elettroforetico su gel di agarosio al 2% del risultato di RACE-PAT con primer specifico per AP2 (A) o con primer specifico per la leptina (B), condotto in parallelo, su RNA totale estratto da fibroblasti 3T3 L1 differenziati in adipociti.
Corsie da 1-4 : RACE-PAT su RNA totale estratto da 3T3 L1 differenziati. Corsia 5 : controllo positivo, RACE-PAT su adipociti primari non trattati.
Corsia 6 : controllo positivo, RACE-PAT su adipociti primari trattati con dexametasone 150 nM per 6H.
Di fianco sono indicate, come riferimento, le altezze delle bande del DNA ladder 1 Kb prossime alle bande minime di AP2 e di leptina.
3.4 Studi di poliadenilazione e produzione di leptina negli adipociti
primari.
Considerando il risultato del test di poliadenilazione sulle 3T3-L1 (vedi figura 9), abbiamo messo a punto un protocollo per l’allestimento di colture di adipociti primari, nelle quali indurre la produzione di leptina.
Nell’allestimento delle colture primarie vengono utilizzati topi adulti (6-8 mesi) mediamente del peso di 30-35 gr. Vengono sacrificati 4-6 animali per ogni esperimento dai quali viene raccolta, generalmente, una quantità di tessuto adiposo pari ad 0.5-1 gr circa per ogni esemplare. Dopo digestione con collagenasi, il numero totale di adipociti ottenuti viene valutato tramite conteggio in emocitometro (camera di Burker) approssimando che la media di tre conteggi equivalga a 1/10000 del numero di adipociti per litro di sospensione.
Mediamente da 4 gr di tessuto si riescono ad ottenere circa 18-20X106 adipociti, che vengono suddivisi in pozzetti da coltura cellulare secondo tre classi sperimentali:
a) Induzione con insulina. b) Induzione con dexametasone. c) Controllo.
Per ogni classe si preparano da 1 a 3 repliche in base al numero di cellule totali disponibili, considerando che per l’estrazione dell’RNA con TriPure isolation reagent viene consigliata una quantità di cellule dell’ordine di 1-2X106 per ogni campione.
La sospensione di adipociti viene quindi suddivisa in modo che ciascuna replica riceva almeno 1X106 cellule.
Per valutare il tempo ottimale di incubazione degli adipociti con gli induttori, è stato eseguito un test E.L.I.S.A. per la leptina, sul mezzo di coltura prelevato a diversi tempi di incubazione con gli induttori.
Confrontando i nostri dati sperimentali con quanto riportato in letteratura (vedi introduzione 1.5) e considerando che il fenomeno della poliadenilazione ha implicazioni pre-traduzionali, il periodo di incubazione ottimale è stato stabilito intorno alle 6-7 H, sia per insulina che per il dexametasone. Sono stati sottoposti all’esperimento solo quelle colture primarie di adipociti in cui il test E.L.I.S.A. aveva verificato una certa
induzione della produzione di leptina in seguito a trattamento con insulina e/o dexametasone. Il protocollo sperimentale è schematizzato in figura 10.
Isolamento fat pad + Insulina + Dexamethasone controllo 200nM 150nM Test E.L.I.S.A. significativa Non significativa Saggio di poliadenilazione Figura 10
Schema del protocollo di induzione e processamento degli adipociti in coltura primaria, estratti da WAT perigonadale e perirenale di topo.
Estrazione RNA
Induzione
L’ induzione della produzione di leptina nei campioni trattati con insulina o dexametasone, è risultata variabile e non sempre significativa. In figura 11 sono riportate le medie dei valori della concentrazione di leptina ottenuti in 5 esperimenti indipendenti. Il valore medio di leptin/cell count calcolato su tutti i campioni sottoposti a trattamento insulinico, non è risultato significativamente (p=0.13) superiore al valore medio di leptin/cell count relativo ai campioni di controllo. Anche per i campioni trattati con dexametasone, il valore medio di leptin/cell count su tutti i test E.L.I.S.A. condotti non risulta significativamente superiore al corrispondente valore medio di leptin/cell count dei relativi campioni di controllo (p=0.75).
La quantità di leptina secreta nei campioni (n= 7) trattati con insulina 200 nM per 6 ore, è di 505,3 ± 228,9 pg/ml, mentre nei campioni (n= 6) trattati con dexametasone 150 nM per 6 ore, è risultata di 205,5 ± 83.89 pg/ml contro un valore medio di 240.4 ± 80,89 pg/ml dei controlli (n= 10). Controllo Insulina Dexametasone ctrl ins dexa ctrl -- ins -- dexa 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 Lep tina, pg/ml Classi di trattamento C ontrollo Insulina D exam eta Figura 11
Valori medi della concentrazione di leptina misurata tramite metodo E.L.I.S.A. (Quantikine mouse leptin immuno assay kit, Reserch & Diagnostic) nel mezzo di coltura di adipociti primari sottoposti al protocollo di induzione, relativi agli esperimenti di RACE-PAT
Ctrl = controllo, nessun induttore somministrato. Totale n= 10 campioni Ins = insulina 200 nM/6H, Totale n= 7 campioni
Dexa = dexametasone 150 nM/6H, Totale n= 6 campioni
Data l’ampia variabilità, le differenze non sono statisticamente significative. Si nota inoltre che nelle nostre mani, i tempi e le dosi utilizzati per quanto riguarda il trattamento con dexametasone, non sono sufficienti ad indurre la produzione di leptina. Il livello di poliadenilazione del messaggero della leptina, negli adipociti da coltura primaria, è stato valutato sia tramite RACE-PAT che tramite LM-PAT (ligase mediated polyadenylation test) (vedi anche materiali e metodi 2.16 e in figura 12). La tecnica di LM-PAT, consente una stima più accurata della lunghezza complessiva della coda di poliadenilazione rispetto alla RACE-PAT (la startegia esperimentale è rappresentata in figura 12 ).
RT, PCR RT, PCR
AAAA 2 AAAAAAAAAAAA
Oligo-dT
Lunghezza costante della coda di poliadenilazione
Lunghezza variabile della coda di poliadenilazione TTT TTT TTT TTT TTT 1 AAAA 1 2 AAAAAAAAAAAA TTT TTTTTTTTTT Primer 3’UTR specifico Primer 3’UTR specifico Anchor dt Anchor dt Oligo-dT Ligasi T4 Figura 12
Schema del funzionamento del saggio di poliadenilazione LM-PAT (ligase mediated polyadenylation test).
1 messaggero che NON subisce poliadenilazione citoplasmatica. 2 messaggero che subisce poliadenilazione citoplasmatica.
L’RNA totale viene preventivamente incubato a 42°C con oligomeri di timidina di 12-14 nt con lo scopo di ridurre la disponibilità di siti di appaiamento per l’oligo anchor primer. Nei trascritti con coda di poliadenilazione corta, gli oligomeri satureranno verosimilmente tutta la sua lunghezza, mentre nei messaggeri che subiscono poliadenilazione citoplasmatica, l’appaiamento degli oligomeri lascerà scoperte, con una probabilità maggiore, delle aree di lunghezza e distribuzione casuale lungo la coda.
Oligomeri appaiatisi in posizione contigua vengono ligati tra loro utilizzando T4 DNA ligasi, in modo da generare un tratto continuo privo di nick.
L’incubazione con oligo d(T) Anchor primer in proporzione di 5X rispetto agli oligomeri.viene condotta a 12 °C, in questo modo si favorisce un appaiamento in posizione terminale rispetto alla coda, essendo questa una condizione termodinamicamente e stericamente più stabile.
La lunghezza del cDNA ottenuto per retro-trascrizione, rappresenterà, con alta probabilità l’intera estensione della coda di poliadenilazione del messaggero di origine.
Dal pool di cDNA così ottenuti, si amplifica, tramite PCR il cDNA corrispondente al messaggero d’interesse, utilizzando un primer specifico per la sua region 3’UTR e lo stesso oligo d(T) Anchor primer.
Nel caso in cui il messaggero subisca poliadenilazione citoplasmatica, il profilo elettroforetico della LM-PAT, risulterà caratterizzato da uno smear costituito da una serie di bande discrete sopra una banda minima.
Per messaggeri che non subiscono poliadenilazione citoplasmatica, il profilo elettroforetico di di LM-PAT sarà caratterizzato da una singola banda .
3.5 Saggi di poliadenilazione su adipociti da coltura primaria.
Quei campioni per i quali il test E.L.I.S.A. ha evidenziato una induzione significativa della produzione di leptina sono stati processati per l’estrazione di RNA e test di poliadenilazione.
Per alcuni esperimenti è stata effettuata soltanto RACE-PAT o LM-PAT, in altri casi il test di poliadenilazione, è stato condotto in parallelo sia per RACE-PAT che per LM-PAT.
In figura 13 e 14 sono raffigurati due gel rappresentativi, in cui è stata applicata rispettivamente, la tecnica della RACE PAT e della LM-PAT. Questo tipo di colorazione (bromuro di etidio) non permette di fare valutazioni quantitative e specifiche circa la lunghezza dello smear. Da qui in avanti saranno quindi presentati i risultati di ibridazione con la sonda radioattiva.
1 3 4 5 6 7 8
Figura 13
Profilo elettroforetico su gel di agarosio al 2% (dopo corsa di 120’) del risultato di un esperimento di RACE-PAT con primer specifico per aP2 o con primer specifico per la leptina, condotto in parallelo su RNA totale estratto da adipociti da coltura primaria, sottoposti al protocollo di induzione.
1, 2, 3 = campioni di controllo
4, 5 =campioni trattati con dexametasone 150 nM/6H 7, 8 = campioni trattati con insulina 200nM/6H C - = controllo negativo
Di lato sono riportate le dimensioni delle bande del DNA ladder prossime alle altezze delle bande minime di leptina e aP2.
300 pb 200 pb
leptina
2C-aP2
C-8 7 6 1 2 3 4 5Figura 14
Profilo elettroforetico su gel di agarosio al 2% (dopo corsa di 90’) del risultato di un esperimento di LM-PAT con primer specifico per la leptina, su RNA totale estratto da adipociti da coltura primaria, sottoposti al protocollo di induzione. 1, 2, 3 = controllo.
4, 5, 6 = campioni trattati con insulina 200nM/6H.
Di lato è riportata le dimensioni della banda del DNA ladder (1Kb DNA ladder, non mostrato) prossima all’ altezza della banda minima della leptina.
5 6
1 2 3 4
200 pb
In figura 15 è raffigurato il profilo autoradiografico ottenuto da ibridazione con sonda marcata α32
P-CTP specifica per la leptina, del filtro proveniente da southern blot di un saggio di RACE-PAT su coltura di adipociti primari sottoposti a protocollo di induzione.
Si nota per tutti i campioni una banda minima dell’altezza di 200 pb circa, di intensità variabile, che si estende in uno smear di lunghezza variabile.
Questa differenza è da mettere in relazione sia con una quantità non omogenea di cDNA del messaggero della leptina tra i campioni, sia con il fatto che la totalità del segnale per alcuni di essi, si localizza in una banda piuttosto netta, mentre per altri il segnale si distribuisce su una lunghezza maggiore.
Come nel caso della RACE-PAT condotta su adipociti ex-vivo, l’ibridazione della sonda lungo tutto lo smear e in corrispondenza della banda da 200 pb, indica la specificità del prodotto di questo saggio.
Lo smear presente nel campione proveniente dal trattamento insulinico, risulta il più esteso, sia rispetto ai campioni di controllo che a quelli trattati con dexametasone.
Nei campioni trattati con dexametasone, si mette in evidenza uno smear generalmente poco esteso, comunque superiore a quello del campione di controllo, in accordo con la bassa significatività dell’induzione della produzione di leptina da parte di questo induttore, osservata con metodo E.L.I.S.A. (punto 3.4).
Come si vede in figura 15, l’intensità degli smear si affievolisce col crescere della lunghezza; questo è dovuto al fatto che l’Anchor primer utilizzato nella RACE-PAT, ha maggior probabilità di appaiarsi a regioni della coda di poliadenilazione di lunghezza intermedia rispetto a porzioni terminali.
In generale, la variabilità dell’intensità del segnale, ha effetto sulla valutazione dell’estensione degli smear, in quanto, un segnale più intenso, mette in maggior risalto la traccia relativa rispetto al rumore di fondo evidenziando anche le porzioni di peso molecolare più alto.
200 pb 300 pb 500 pb 600 pb pb
C2
C3
D2
D3
I1
1200 pb 800 pb Figura 15Profilo autoradiografico (lastra esposta per 1 ora) del southern blot della RACE-PAT sul messaggero della leptina, condotta su adipociti da coltura primaria.
I1= campione trattato con insulina 200nM per 6H.
D2, D3 = repliche del trattamento con dexametasone 150nM per 6H. C2, C3 = repliche di controllo, nessun induttore somministrato. Sul lato destro dell’immagine è riportata, in proporzione, la scala di riferimento in pb della migrazione elettroforetica.
In figura 16, è rappresentato il profilo di ibridazione del filtro ottenuto per southern blot di un test LM-PAT del messaggero della leptina, su adipociti da coltura primaria.
Sono visibili solo due tracce, relative ad un trattamento insulinico e ad un controllo, in entrambi i casi si osserva che il segnale origina da una banda minima di 200 pb circa e si estende in uno smear. Si nota anche una differenza nell’intensità dei segnali tra i due gruppi, la traccia del trattamento insulinico è infatti più intensa, come evidente in particolar modo nella regione inferiore comprendente la banda minima. Rispetto al profilo di figura 15, si può notare che in questo caso, il segnale degli smear è più netto e l’intensità del segnale si mantiene uniforme per gran parte della lunghezza delle tracce, come effetto del procedimento di LM-PAT (figura 12).
Anche correggendo per differenza di intensità tra i due campioni, la lunghezza dello smear relativo al trattamento insulinico, risulta maggiore del campione di controllo.
400 pb 500 pb 600 pb 800 pb 700 pb 1200 pb 200 pb pb
C2
C3
D1
I2
Figura 16Profilo autoradiografico (lastra esposta per 1 ora) del southern blot della LM-PAT sul messaggero della leptina, condotta su adipociti da coltura primaria.
I2 = campione trattato con insulina 200nM per 6H.
D1 = campione trattato con dexametasone 150nM per 6H. C2,C3 = repliche di controllo, nessun induttore somministrato.
Sul lato destro dell’immagine è riportata, in proporzione, la scala di riferimento in pb della migrazione elettroforetica.
Per la valutazione di una eventuale correlazione tra allungamento dello smear e induzione della produzione di leptina, è necessaria una stima accurata dell’estensione degli smear. I filtri ibridati con sonda marcata α32
P-CTP provenienti da southern blot delle RACE-PAT e delle LM-PAT, sono stati quindi sottoposti ad analisi densitometrica utilizzando un phosphoimager, che attraverso l’ausilio del software OptyQuant, permette di misurare l’intensità del segnale in qualsiasi punto dell’magine.
Per eliminare la variabilità sulla stima della lunghezza degli smears generata dalle differenze di intensità tra i vari campioni, l’intensità di ogni segnale, misurata a qualsiasi livello lungo gli smear, deve essere corretta per l’intensità assoluta della traccia. È stata quindi campionata l’intensità del segnale degli smear a 4 livelli, uguali per tutti i campioni, scelti arbitrariamente affinché il primo livello comprenda le bande minime e l’ultimo sia all’altezza della fine dello smear più esteso come indicato nello schema di figura 17. Come indice dell’intensità assoluta di ogni traccia, viene scelto il valore letto dallo strumento in corrispondenza del livello delle bande minime (livello A). Ciascun valore di intensità misurato lungo ogni smear, viene quindi diviso per il valore letto al relativo livello A e corretto per il rumore di fondo.
Per ogni esperimento, viene calcolata la media su tutte le repliche, delle intensità normalizzate lette a ciascun livello.
Viene applicato un test di significatività (t-test) tra I valori medi ottenuti in questo modo, per i campioni trattati con ciascun induttore, contro i rispettivi valori medi corrispondenti ai campioni di controllo.
Si ottiene una stima della significatività dell’ipotesi di un allungamento differenziale tra campioni sottoposti a trattamento con insulina o dexametasone rispetto ai campioni non trattati Per ogni esperimento, viene valutata la correlazione tra intensità normalizzata del segnale di smear letto a ciascun livello per ogni campione e valore di leptin/cell count corrispondente. In figura 18, è riportata l’analisi di regressione e significatività per la RACE-PAT mostrata in figura 15 Si mette in evidenza una buona significatività della regressione soprattutto per il livello D (p=0.007).
1 2 3 4
Livello
Figura 17
Schema seguito nel campionamento delle intensità degli smear acquisite al Cyclone phospho imager, condotto sui filtri corrispondenti ai Southern-blot ibridati, dei test di poliadenilazione su adipociti da coltura primaria.
Livello A : comprende la banda minima presente in tutti i campioni alla medesima altezza.
Livelli B-D : campionamenti ad altezze arbitrarie ma omogenee tra i campioni. A bande minime Livello B Livello C Livello D
0 .2 .4 .6 .8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 b/a 0 .05 .1 .15 .2 .25 .3 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 c/a leptin/cell count 0 .02 .04 .06 .08 .1 .12 .14 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 d/a D/A C/A C/A D/A B/A B/A leptin/cell count leptin/cell count St.dev media B B//AA 1,022 1,0647 Dexa 0.0344 0,l257 Ctrl Figura 18
Analisi dei valori densitometrici dell’ibridazione su RACE-PAT mostrata in figura 15. A) Rette di regressione tra intensità degli smear a ciascun livello per ogni
campione e valore di leptin/cell count relativo.
B) Analisi della regressione e della significatività dei valori densitometrici B A St.dev media D D//AA 0.016 0.029 Dexa 0.0019 0.0148 Ctrl regressione p=0,0071 t-test p=0,338 St.dev media C C//AA 0.0653 0.1036 Dexa 0.0155 0.0485 Ctrl regressione p=0,0156 t-test p=0,3653 t-test p=0,3236 regressione p=0,7946
Anche se non in tutti gli esperimenti di RACE-PAT condotti, siamo in grado di indicare una chiara correlazione tra induzione della produzione di leptina e allungamento dello smear del suo messaggero, è comunque da notare una tendenza ad una relazione diretta tra questi parametri.
La figura 19 mostra su livelli sovrapposti, l’allungamento medio degli smear nelle diverse classi di trattamento sul totale di 6 esperimenti di RACE-PAT condotti. L’analisi della varianza (ANOVA) ha messo in evidenza una differenza marginalmente
significativa tra i gruppi (p= 0.09).
ctrl ins dex 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 in tensità rela tiva classi di trattamento B/A C/A D/A Classi di trattamento
*
Intensità relativa smea
r
Dexa
Ctrl Ins
Figura 19
Grafico riassuntivo dell’effetto del trattamento sulla lunghezza degli smear relativo a 6 esperimenti di RACE-PAT.
Ctrl = controllo. Totale campioni n= 10
Ins = trattamento con insulina. Totale campioni n= 7
Dexa = trattamento con dexametasone. Totale campioni n= 6
I diversi colori indicano la lunghezza relativa dello smear misurata ai vari livelli * p= 0.09 riferito al t-test condotto tra ctrl vs ins per il livello D/A.
In figura 20 sono riassunti ed elaborati, i risultati ottenuti tramite LM-PAT su campioni di controllo e campioni trattati con insulina. Il confronto tra le medie tramite t-test, rivela una differenza marginalmente significativa per quanto riguarda i valori della lunghezza dello smear relativi a D/A (p=0.08).
Tale risulato si riflette coerentemente anche nell’analisi di regressione, che mette in evidenza una significativa e positiva correlazione tra livelli di leptina/cell count e allungamento della coda di poliadenilazione, particolarmente significativa per i livelli D/A (figura 21). c tr l in s 0 .0 0 .1 0 .2 0 .3 0 .4 0 .5 0 .6 0 .7 0 .8 0 .9 1 .0 in te ns it à r e lat iv a c la s s i d i tr a tta m e n to B /A C /A D /A Figura 20 Ctrl Ins Classi di trattamento
*
Intensità relativa smea
r
Grafici riassuntivi dell’effetto del trattamento insulinico sulla lunghezza degli smears relativi a 2 esperimenti di LM-PAT.
Ctr= controllo. Totale campioni n=5
Ins= trattamento con insulina. Totale campioni n=5
y 0 50 100 150 200 250 300 350 0 0,5 1 1,5 2 le pt in /cel l count = 274,04x + 118,35 Figura 21
Grafici riassuntivi dell’effetto del trattamento insulinico sulla lunghezza degli smears relativi a 2 esperimenti di LM-PAT.
Valutazione della correlazione tra valore di leptin/cell count di ogni replica e intensità relativa degli smear ad ogni livello.
I valori della regressione e relativa significatività, tra i due parametri, per ciascun livello, sono i seguenti:
B/A : r2= 0,011 p= 0.39 C/A : r2= 0,22 p= 0.6 D/A : r2= 0,2 p= 0.03 B/A B/A 0 50 100 150 200 250 300 350 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 C/A lept in/cell count y = 12,205x + 148,62 0 50 100 150 200 250 300 350 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 leptin/cell c ount D /A D/A y = 385,28x + 125,93 y = 274,04x + 118,35 C/A
