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CAPITOLO 3
MATERIALI E METODI
3.1.
CARATTERIZZAZIONE
MECCANICA:
PROVE
DI
TRAZIONE
È stata effettuata la caratterizzazione meccanica delle seguenti tipologie di protesi fornite dall'azienda DIPROMED s.r.l (San Mauro Torinese TO Italia) :
1. Gelatina (film) 2. Gelatina (spugna) 3. Gelatina + GPTMS ( film ) 4. Gelatina + GPTMS ( spugna ) 5. PCL film 6. PCL/PEG1 60/40 7. PCL/PEG1 70/30 8. PCL/PEG2 60/40 9. PCL/PEG 2 70/30 10. PCL6_1I 11. PCL6_2I 12. PCL7_1I 13. PCL7_2I
I provini sono stati sollecitati lungo 2 direzioni perpendicolari: gli assi X ed Y. La dimensione dei campioni è 7 x 5 cm, 2 dei quali sono utilizzati per l'ancoraggio del dispositivo meccanico, l'area effettiva diviene così quella del quadrato centrale di 5 cm per lato. Tutti i provini sono fissati al dispositivo in modo da simulare l'ancoraggio continuo tra protesi e parete addominale. Ogni campione è testato per 4 volte ad una velocità costante (v) pari a 0,05%/s fino al raggiungimento di una deformazione (ε) massima del
43 10% della lunghezza iniziale. I dati ricavati sono utilizzati per valutare il comportamento meccanico delle mesh ed il modulo di Young definito come:
ε =
σ =
Dove: E = modulo elastico, ε = deformazione, σ = sforzo applicato, ΔL = deformazione campione, L0 = lunghezza iniziale, F = forza applicata, A = area effettiva
Successivamente sono ricavate le curve di stress-strain. Il modulo elastico delle mesh è calcolato eseguendo la regressione lineare sul primo tratto della curva. Dato che la forma canonica di una retta è: Y = mX + q, dove m = coefficiente angolare e q = intercetta asse Y; il coefficiente angolare m equivale al modulo elastico E.
3.2.
COLTURE CELLULARI
I test cellulari hanno previsto l’utilizzo di BJ Human Skin Fibroblast (ATCC-CRL-2522, Teddington UK), una linea di fibroblasti umani immortalizzati derivanti dalla pelle di prepuzio. Questa linea cellulare cresce in adesione, al 100% della confluenza ha una densità di 3,4x10 4 cells/cm2 e può replicarsi per un numero finito di volte (circa 72). Per la fase sperimentale, le cellule, una volta amplificate e giunte a confluenza, sono state trattate prima con PBS 1X (Phosphate Buffer Solution), per rimuovere inibitori enziamtici, e successivamente con una soluzione di tripsina / EDTA (0,05% w/v) per favorire il loro distacco dalle fiasche di coltura. La tripsina, infatti, è un enzima proteolitico ed idrolizza i legami che le cellule creano tra loro e con la fiasca. Successivamente, la fiasca trattata è riposta in incubatore fino al distaccamento delle cellule, quindi viene addizionata con mezzo di coltura per neutralizzare l’azione della tripsina. La sospensione cellulare ottenuta, dopo essere stata centrifugata per 5 min a 900 rpm, è risospesa in 3-4 mL di terreno. A
44 questo punto si procede con la conta cellulare: si preleva un quantitativo della sospensione ottenuta (50 µL), si addiziona ad un uguale volume di trypan blue e della nuova soluzione si preleva un'aliquota di 10 µL caricandola nella camera di Burker (Figura 10).
Figura 10. Rappresentazione del reticolo presente nella camera di Burker.
La camera è costituita da un vetrino rettangolare, con lati rispettivamente di 7,5 cm e 3,5 cm e uno spessore di 4 mm. La camera Burker presenta 2 celle che hanno una profondità di 1/10 mm e il piano di ogni cella risulta diviso in 9 quadrati di lato 1 mm. Ciascuno dei 9 quadrati comprende: 16 quadrati grandi di una superficie di 1/25 mm². La sospensione si distribuisce e si procede alla conta del numero di cellule presenti. Per avere il numero di cellule per ml si utilizza la formula (a)
(a) [nr cellule/nr quadranti contati]*10000
dove 10000 rappresenta il fattore volumetrico di conversione per la camera di Burker. Per ottenere il numero di cellule totali nel volume è sufficiente moltiplicare il valore ottenuto in (a) per il volume totale della sospensione.
In base al diverso protocollo sperimentale le cellule sono seminate ad una diversa concentrazione sulle protesi e, successivamente, messe in coltura in incubatore a 37°C e in atmosfera di CO2 al 5%.
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3.2.1.
MEZZO DI COLTURA
Le cellule sono state coltivate in terreno MEM (Egale's Minimum Essential Medium) addizionato con 10% FBS (Fetal Bovine Serum), precedentemente inattivato con il calore (55°C per 30 minuti), L-glutammina 2 mM, ed una miscela costituita di antibiotici-antimicotici costituita da Penicillina 100µU/mL, Streptomicina 10-1µU/mL, Anfotericina B 2,5x10-1µU/mL, per impedire eventuali contaminazioni di agenti microbici. Tutti i prodotti sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (St.Louis, U.S.A.). Il terreno è stato sostituito ogni 4-5 giorni di coltura. Le cellule vengono mantenute in incubatore a 37°C e in atmosfera di CO2 al 5%.
3.2.2.
PROTOCOLLO DI CONGELAMENTO
Le cellule, dopo amplificazione, giunte a confluenza vengono tripsinizzate e centrifugate a 900 rpm per 5 minuti. Il pellet cellulare è risospeso nella soluzione di congelamento contenente FBS 95% e DMSO 5% (Dimetilsolfossido, agente crioprotettivo capace di ridurre la formazione di cristalli di ghiaccio). Le cellule vengono successivamente aliquotate in criovyals sterili alla concentrazione di 1x106cell/mL circa. Il congelamento avviene gradualmente in bagno di isopropanolo a -80°C, capace di produrre un abbassamento costante e graduale della temperatura (1°C/min). Una volta congelate le cellule vengono trasferite in azoto liquido.
3.2.3.
PROTOCOLLO DI SCONGELAMENTO
Le cellule vengono rapidamente scongelate a 37°C per il ripristino della coltura e diluite in 10 ml di terreno. Dopo 24h di incubazione a 37°C e in atmosfera di CO2 al 5% il terreno di coltura viene cambiato al fine di eliminare il DMSO.
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3.3. PROTOCOLLI SPERIMENTALI
3.3.1. DETERMINAZIONE DELLA CITOTOSSICITA'
La valutazione del saggio di vitalità cellulare è effettuata tramite test dell’Alamar Blue (CellTiter Blue®, Promega, Madison U.S.A.); la resazurina (il reattivo) è un prodotto solubile in acqua capace di penetrare nelle cellule vitali, dove viene metabolizzata a livello mitocondriale in resorufina (Figura 11) rilevabile tramite spettrofotometria (573 nm) o fluorimetria (579ex/584em).
Figura 11 Reazione di riduzione della resazurina in resorufina che avviene al livello mitocondriale.
La diminuzione del valore di assorbanza/fluorescenza prodotta è correlata al grado di citotossicità causato dall’esposizione delle cellule al terreno condizionato dal materiale in esame. I test sono stati effettuati seguendo le direttive ISO 10993.
Sono state ricavate mesh di 48 cm2 (rapporto di estrazione 1 mL/6 cm2) e sterilizzate tramite gas plasma o in etanolo al 70% seguito da passaggio sotto raggi UV, 15 min per lato. 8 mL di terreno di coltura sono messi a contatto con ogni mesh per 24 h a 37 °C. Le cellule sono seminate a confluenza (densità 34000 cell/cm2) in una piastra da 96 pozzetti ed incubate per 24 h in terreno completo a 37 °C e in atmosfera di CO2 al 5%. Il terreno di semina è quindi rimosso e sostituito con il terreno condizionato (200 µL per pozzetto); ogni campione è testato su 8 pozzetti. È previsto un controllo negativo con fibroblasti in
47 terreno completo ed un controllo positivo con cellule trattate con una soluzione di terreno completo addizionato con DMSO 5%. A 24, 48 e 72 h sono acquisiste immagini in microscopia ottica (AX70, Olympus Italia, Milano) allo scopo di valutare nel tempo la morfologia cellulare.
Dopo 72 h di incubazione, il terreno condizionato viene aspirato e le cellule sono incubate con 100 µL di terreno completo e 10 µL di Alamar blue. Dopo 150 minuti viene effettuata la lettura delle unità di fluorescenza relativa (RFU) tramite spettrofluorimetro. La vitalità del campione viene espressa come percentuale rispetto al controllo negativo.
Espressione della vitalità cellulare (VC):
%VC = (RFU150' campione /RFU150' controllo negativo) x 100
I materiali che presentano una vitalità superiore al 70% vengono testati per la curva di crescita.
3.3.2. CURVE DI CRESCITA
Lo scopo del test è quello di valutare il trend di crescita cellulare sui diversi campioni di protesi rispetto al controllo effettuando analisi di vitalità cellulare in giorni stabiliti. Il saggio di vitalità cellulare effettuato è Alamar Blue test (CellTiter Blue®, Promega, Madison U.S.A.).
Sono ricavate mesh di 1,9 cm2 o 9,6 cm2 a seconda della multiwell utilizzata (rispettivamente multiwell da 24 o 6 pozzetti) che vengono prima trattate in etanolo al 70% e poi sottoposte a processo di sterilizzazione con irraggiamento UV 15 minuti per lato ed infine tenute per 2 h prima della semina ad equilibrarsi in terreno completo a 37 °C in incubatore. Sui campioni le cellule vengono seminate ad un valore di confluenza del 15% (questo corrisponde a circa 104 cellule per le multiwell da 24 e circa 45x103 in quelle da 6), come controllo le cellule sono seminate in multiwell in terreno completo. Dopo 24 h di incubazione i campioni seminati vengono trasferiti in nuovi pozzetti così da eliminare ogni segnale aspecifico dovuto alle cellule non adese ad i campioni. A tempi definiti (1, 3, 7, 10, 14, 17, 21 giorni) è stato eseguito Alamar Blue Test per valutare la vitalità cellulare. Dopo
48 30 minuti e 150 minuti viene effettuata la lettura delle unità di fluorescenza relativa (RFU) tramite spettrofluorimetro. La vitalità di ogni campione viene valutata attraverso il calcolo del rate metabolico delle cellule
Rate Metabolico = (RFU150' - RFU30' )/120’
Al 21° giorno i campioni vengono fissati con paraformaldeide al 4% per 30 min a temperatura ambiente e conservati a 4 °C in PBS 1X per i successivi saggi immunoistochimici.
3.3.3. PREPARAZIONE CAMPIONI PER ANALISI DEL
SECRETOMA
Per l'analisi delle proteine secrete i campioni sono incubati in terreno MEM (Egale's
Minimum Essential Medium) senza siero e rosso fenolo per 24h. Il volume utilizzato varia
tra 1 e 2 mL a seconda della dimensione del campione da analizzare. Per la raccolta del secretoma si utilizza un terreno senza siero in quanto, le proteine in esso contenute, potrebbero mascherare quelle provenienti dalla secrezione dei campioni. Successivamente il terreno viene recuperato e centrifugato prima per 5 minuti a 900 rpm per eliminare i detriti cellulari, poi per 20 minuti a 2000G. Il sovranatante così ottenuto è conservato a -80°C .
3.3.4. ESTRAZIONE DELLA MATRICE
Per decellularizzare un campione si procede come da protocollo. Dopo aver rimosso il terreno, si effettuano 3 lavaggi con PBS 1X (Phosphate Buffer Solution) e si aggiunge per 3 volte PBS/dH2O 1:5 con DOC (Sodio Deossicolato) 0,5% w/v per 1 minuti a in ghiaccio, quindi si osservano i campioni al microscopio per verificare l'avvenuta decellularizzazione. La matrice extracellulare si presenta come una serie di filamenti ramificati.
49 Successivamente si effettuano 3 lavaggi con PBS/dH2O 1:5 in ghiaccio, poi 2 con dH2O in ghiaccio in modo da ripulire completamente i campioni dalla presenza del DOC. La matrice extracellulare ottenuta viene digerita aggiungendo una soluzione 1:100 di tripsina 0.25 µg/µL in AMBIC (Ammonio Bicarbonato) 20 mM ed incubando overnight. Una volta digerita la matrice, dopo ulteriore raschiatura, viene recuperata, scaldata a 95 °C per 15 minuti e successivamente centrifugata a 14000 rpm per 15 minuti. Il campione così ottenuto è conservato a -80°C.
3.3.5. ANALISI SECRETOMA E ECM
Le analisi dei campioni aliquotati come descritto è stata effettuata grazie alla collaborazione del dipartimento di Proteomica e System Biology del CNR di Pisa. I campioni proteici raccolti vengono prima sottoposti a digestione enzimatica con tripsina, poi la miscela proteica è frazionata mediante nano-HPLC in fase inversa direttamente sul supporto dello spettrometro di massa MALDI, infine analizzato con spettrometria di massa mediante MALDI-TOF/TOF sia in singola massa (registrazione dei precursori peptidici) sia in tandem MS/MS per l'identificazione delle proteine. L'analisi degli spettri porta all'identificazione delle proteine presenti nei campioni e permette una loro comparazione semiquanitativa.
Per prima cosa in ogni campione raccolto viene effettuata una riduzione dei ponti disolfuro con l'ausilio di ditiotreitolo (DTT), azione che viene resa irreversibile dal trattamento con la iodoacetamide, agente che alchila i gruppi sulfidrilici mediante carbammidometilazione. La denaturazione delle proteine rende accessibili i siti di scissione della tripsina (lisina o arginina). Prima di separare i peptidi il campione ottenuto dalla digestione viene filtrato in modo da eliminare eventuali impurezze. I costituenti della miscela peptidica sono separati mediante cromatografia liquida ad alta risoluzione (High Performance Liquid
Chromatography, HPLC) a ripartizione in fase inversa nel quale la fase stazionaria è
apolare mentre la fase mobile è altamente polare (pH acido). I diversi peptidi vengono quindi eluiti in base al diverso coefficiente di ripartizione nelle due fasi. Il campione viene processato in due colonne in sequenza, la prima è utilizzata solamente per concentrare i peptidi mentre nella seconda avviene la separazione vera e propria. Il sistema
50 cromatografico è collegato attraverso un capillare ad un sistema di campionamento che permette la miscelazione dell'eluato con una matrice ionizzabile (acidi organici insaturi) e la deposizione direttamente sulla piastra dello spettrometro di massa MALDI (Matrix
Assisted Laser Desorption Ionization). Alla fine si ottengono dei depositi cristallini o spot
sulla piastra dello spettrometro di massa. L'analisi del contenuto dei peptidi degli spot è effettuata con l'analizzatore di massa MALDI TOF-TOF (Applied Biosystem-MDS Csiex). Affinché il campione possa essere analizzato mediante lo specifico tempo di volo (TOF) deve essere allontanato dal supporto metallico (desorbimento) e successivamente ionizzato. In condizioni di vuoto spinto un raggio laser colpisce la matrice e la ionizza trasferendole parte della sua energia; in queste condizioni la matrice vaporizza e trasporta il peptide intatto verso l'analizzatore (processo di desorbimento). La matrice poi trasferisce la sua energia all'analita con una reazione di tipo acido base, si formano così gli ioni molecolari dei peptidi che, opportunamente accelerati da campi elettrici, sono indirizzati nell'analizzatore fino a raggiungere l'elettrodo rivelatore. la misura del TOF degli ioni nell'analizzatore è proporzionale al rapporto massa/carica dell'analita. Lo spettro che ne risulta è definito spettro in singola massa, e riporta il panorama complessivo dei picchi di massa relativi a tutti i peptidi contenuti negli spot. A questo tipo di analisi è associato il massa/massa (o tandem MS/MS) che permette di identificare la sequenza amminoacidica dei peptidi. L'analita in questo caso viene indirizzato in una camera di collisione nella quale viene sottoposto a frammentazione, gli ioni creati vengono successivamente analizzati in base al loro TOF.
Gli spettri ricavati da ogni spot sono analizzati dal programma Global Protein Server Explorer (Applied Biosystem) che identifica le proteine mediante la tecnica de Peptide Mass Fingerprinting.
3.3.6. IMMUNOISTOCHIMICA
L’analisi vuole valutare la produzione di collagene di tipo I e tipo III al termine del periodi di coltura. Per il riconoscimento del collagene di tipo I è stato selezionato come anticorpo primario COL1A1 (D-3) (sc-25974, Santa Cruz Biotechnology, U.S.A) ed il relativo secondario coniugato con FITC (Fluoresceina IsoTioCianato) (donkey anti-goat
igG-51
FITC, sc-2024, Santa Cruz Biotechnology, U.S.A). Il collagene di tipo III è identificato
dall'anticorpo primario COL3A1 (S-17) (sc-8780-R, Santa Cruz Biotechnology, U.S.A) ed il relativo secondario coniugato il fluoroforo rodamina (bovine anti-rabbit IgG-R, sc-2367, Santa Cruz Biotechnology, U.S.A).
I campioni fissati con PFA 4% per 20 minuti a temperatura ambiente, dopo essere stati lavati per 3 volte con PBS 1X, sono trattati con Triton X-100 allo 0,1% in PBS 1X per 2 minuti a temperatura ambiente per permeabilizzare le membrane. Dopo aver effettuato altri 3 lavaggi con PBS 1X di 5 minuti ciascuno, i campioni vengono lasciati per 30 min in BSA al 5%. Questo passaggio è necessario per bloccare eventuali siti aspecifici riconosciuti dagli anticorpi. Una volta rimossa la BSA, i campioni sono incubati con una miscela costituita dai due anticorpi primari 1:100 in BSA 1% per 1 h a 37 °C. Dopo 3 lavaggi con PBS 1X i campioni sono incubati, in assenza di luce, con una miscela degli anticorpi secondari 1:200 in BSA 1% per 1h a 37 °C. 15 minuti prima della fine dell'incubazione è stato aggiunto ad ogni campione DAPI (4',6-diamin-2-fenildiolo) 1:1000, colorante organico fluorescente che lega regioni di DNA ricche di sequenze A-T mettendo così in evidenza il nucleo cellulare.
L'analisi dei campioni e effettuata con microscopio ottico a fluorescenza (AX70, Olympus Italia, Milano) con obiettivi 4X, 10X e 20X.
3.3.7. SAGGI RICERCA MARKER INFIAMMAZIONE
3.3.7.1. INTERLEUCHINA 10
L'interleuchina 10 (IL-10) ha un'azione inibitoria sull'attività dei macrofagi e sulla sintesi delle citochine pro-infiammatorie come IL-2, IL-3, TNF-α: per tutta questa serie di azioni è ritenuta una citochina antiinfiammatoria. Per quantificare la presenza dell'IL-10 nel mezzo di coltura è stato effettuato un kit ELISA (Enzyme_Linked Immuno_Sorbent Assay) della Booster Biological Technology (Fremont, CA). In questo tipo di saggio l'antigene viene riconosciuto da due anticorpi: il primario lo fissa al pozzetto ed il secondario permette la quantificazione. L'antigene per essere misurabile deve avere due epitopi diversi, uno per
52 ognuno degli anticorpi. L'anticorpo secondario marcato con la biotina viene a sua volta riconosciuto dal complesso Avidina-Biotina-Perossidasi (ABC) e una volta aggiunto la 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), substrato della perossidasi, ha inizio il processo di ossidazione.
Figura 12 Processo di ossidazione della 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina.
Immediatamente si sviluppa una colorazione blu intenso che, dopo l'aggiunta della soluzione di stop, vira al giallo ed è rilevabile con spettrofotometria in quanto assorbe a 450 nm (Figura 12).
Ogni campione di terreno è testato in doppio dopo essere stato diluito opportunamente (1:2 o 1:5 rispettivamente per campioni derivanti da curva di crescita in piastra da 26 o da 6 pozzetti). Dopo aver incubato per 90 minuti a 37 °C la piastra con i campioni si aggiunge l'anticorpo secondario 1:100 per 60 minuti a 37 °C. Successivamente si eseguono 3 lavaggi di 1 min ciascuno con PBS 0,01 M e si aggiunge 0,1 mL di una soluzione di
Avidina-53 Biotina-Perossidasi 1:100 per 30 minuti a 37 °C. Infine dopo aver lavato 5 volte con PBS si aggiunge la 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina per 25/30 minuti. In questo lasso di tempo si sviluppa una colorazione blu che dopo l'aggiunta della soluzione di stop della TMB diviene immediatamente gialla. Dalla lettura dell'assorbanza della piastra a 450 nm si ottiene la densità ottica (O.D.450) di ogni campione. Per analizzare i dati si ricava la densità ottica relativa degli standard e dei campioni:
O.D.450r = O.D.450campione - O.D.450bianco
Dopo aver costruito la curva standard con valori O.D.450 in ordinata, e le concentrazioni in ascissa, si può ricavare la concentrazione dell'IL-10 presente in ogni campione dal suo valore di O.D.450r. I campioni analizzati sono inizialmente diluiti, il valore ottenuto dall'estrapolazione con la retta standard va quindi moltiplicato per il fattore di diluizione, così da ottenere il valore della concentrazione di IL-10 nel campione iniziale.
3.3.7.2. INTERLEUCHINA 6
L’interleuchina 6 (IL-6) è una citochina multifunzionale che può avere un ruolo fondamentale nei meccanismi di difesa dell’ospite: infatti regola le reazioni in fase acuta, la risposta immunitaria e l’ematopoiesi. Normalmente non viene prodotta, ma la sua espressione è indotta da nel corso di reazioni infiammatorie acute associate a lesioni, traumi, stress, infezioni a da una grande varietà di una varietà di citochine. L’IL-6 agisce su una vasta gamma di tessuti esercitando azioni diverse a seconda della natura delle cellule-target; è coinvolta, ad esempio, nel processo di induzione della differenziazione delle cellule B e nella proliferazione e differenziazione di cellule T.
L'IL-6 è stata quantificata nel mezzo di coltura attraverso L'ECLIA (Immuno Assay in
ElettroChemio Luminescienza) in immunoanalizzatore (Cobas, Roche Diagnostics
Limited, England).
Ogni campione, opportunamente diluito in PBS 1X (1:10 se derivanti da controllo o 1:100 per campioni derivanti da mesh ), viene testato in doppio. Dopo aver incubato 30 µL di ogni campione con un anticorpo monoconale biotinato specifico anti-IL-6, viene effettuata
54 una seconda incubazione con un anticorpo monoclonale marcato con un complesso di rutenio e di microparticelle rivestite di streptavidina; i due anticorpi formano un complesso sandwich con l'antigene presente nel campione. La miscela di reazione viene poi aspirata nella cella di misura dove le microparticelle vengono attirate magneticamente alla superficie dell'elettrodo. Successivamente un lavaggio della camera permette l'eliminazione delle particelle non legate. L'emissione della chemioluminescenza è indotta applicando una tensione all'elettrodo, questa viene misurata mediante fotomoltiplicatore. I risultati vengono calcolati in base ad una curva di calibrazione.
3.3.8. COLTURE CON PIRFENIDONE
Il pirfenidone è un farmaco utilizzato per il trattamento della fibrosi polmonare con proprietà antifibrotiche ed antiinfiammatorie. Per valutare il possibile utilizzo di questo farmaco nell'ambito del trattamento delle ernie è stata testata la sua citotossicità su colture di BJ Human Skin Fibroblast.
In una 96-multiwell le cellule sono seminate in terreno completo al 100% di confluenza (104 cellule) ed al 50% (5x103 cellule) e poste per 24 h in incubatore. Il terreno di semina viene quindi rimosso e sostituito con una soluzione di terreno completo e pirfenidone a diverse concentrazioni: 0,1% w/v; 0,07% w/v; 0,05% w/v; 0,03% w/v; 0,01% w/v. Il controllo sono fibroblasti in terreno completo, ed in parallelo sono testate le medesime concentrazioni del solvente nel quale si scioglie il pirfenidone (DMSO). Dopo 72 h è stato eseguito Alamar Blue Test per valutare la percentuale della sopravvivenza cellulare. La vitalità del campione viene espressa come percentuale rispetto al controllo negativo.
3.3.9. METALLOPROTEINASI
La presenza delle MMP-2 e MMP-9 nel mezzo di coltura cellulare ed all'interno delle cellule, è stata valutata tramite tecnica zimografica grazie alla collaborazione con l'Istituto di Biochimica Clinica del CNR di Milano. Sono seminate 105 cellule sui campioni e in
55 pozzetti come controllo. Al decimo giorno di coltura in incubatore a 37 °C in atmosfera al 5% di CO2, il terreno viene prelevato ed aliquotato e, dopo aver lavato con PBS 1X, ad ogni campione è aggiunto il tampone di lisi. Successivamente il pellet è recuperato e sottoposto a 3 cicli di congelamento in N2 liquido, scongelamento in bagnetto a 37 °C ed agitazione con vortex, in modo da lisare completamente le cellule. L'omogenato così prodotto viene aliquotato. Sui campioni di terreno e di omogenato è effettuata la zimografia, una tecnica elettroforetica su gel di poliacrilammide che permette l'identificazione delle MM-2 e MMP-9, grazie all'idrolisi del substrato specifico la gelatina allo 0,01% incorporata nel gel. Difatti le MMP-2 e MMP-9 sono definite anche gelatinasi, dato che oltre ad alcune isoforme di collagene, catalizzano la degradazione della gelatina. Nello specifico si tratta di un SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate - PolyAcrylamide Gel
Electrophoresis): elettroforesi su gel di poliacrilammide in presenza di sodio dodecil
solfato, detergente anionico che si lega alle proteine con un rapporto costante, permettendo la separazione in base al peso molecolare. La corsa è effettuata in condizioni native per quanto riguarda la struttura conformazionale terziaria o quaternaria delle proteine: i campioni infatti, non vengono pretrattati con β-mercaptoetanolo e incubati ad elevate temperature come nel caso della tecnica western-blotting per denaturare le proteine;in questo modo le metallo proteinasi, MMP-2 e MMP-9, presenti nel campione caricato nel gel sono in uno stato nativo e quindi funzionanti. La quantità di proteine caricate per ciascun campione nel pozzetto di caricamento è stata di 15-30 µg. Per ogni corsa elettroforetica vengono caricati proteine standard per la valutazione dei pesi molecolari e una soluzione contenente forme ricombinanti pure delle MMP-2 e MMP-9. L'elettroforesi viene eseguita in un Running Buffer a pH 8.3, a 80 volt per circa 9-10 h. In seguito all'elettroforesi l'SDS è rimosso dal gel (o zimogramma) grazie a 3 cicli di lavaggio con soluzione al 2.5% di Triton X-100, quindi lo zimogramma viene incubato in un appropriato tampone di reazione per zimografia (Tris–HCl 50 mM pH 7.5, NaCl 200 mM, NaN3 0.002%, ZnCl 0.05 mM, CaCl2 5 mM and Brij-35 0.02%) a 37 °C per 21 h. Il calcio e lo zinco sono cofattori essenziali per l'attivazione del sito catalitico delle metalloproteinasi. al termine dell'incubazione nel tampone di reazione, il gel viene sottoposto ad incubazione per 3 h a temperatura ambiente con soluzione all0 0.5% di Coomassie Blue Brillant in Acetonitrile/metanolo (10%-30% rispettivamente) in modo da fare interagire la gelatina presente nel gel con il Comassie. La degradazione della gelatina è resa visibile decolorando il gel mediante incubazione per 3 cicli da 30 minuti ciascuno in soluzione di acetonitrile al 10% metanolo al 30%. Le aree dove è avvenuta la digestione della gelatina da parte delle
56 MMPs appariranno chiare, di contro le zone dove non è avvenuta la digestione appariranno blu scure. L'ampiezza della chiarificazione rispetto al back round riflette il livello delle attività delle MMP-2 MMP-9. L'identificazione di MMP-2 MMP-9 e la valutazione delle loro attività è stata eseguita in ChemiDoc Imaging System (BIO-RAD) comparando i livelli delle proteine ricombinanti e dei marcatori di peso molecolare.
