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5. HSP, STRESS OSSIDATIVO E PATOLOGIE

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5. HSP, STRESS OSSIDATIVO E PATOLOGIE

Come noto le HSP sono state riscontrate nelle cellule sottoposte ad un’ampia varietà di

condizioni di stress.

Lo stress ossidativo è coinvolto in una serie di condizioni patologiche compresa la

neurodegenerazione, le malattie cardiovascolari e l’ictus, e nell’invecchiamento naturale.

In queste condizioni, lo stress ossidativo si verifica come conseguenza dello squilibrio tra la

produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e la capacità del corpo di disintossicarsi

dagli intermedi reattivi di queste.

Questo squilibrio può portare come conseguenza una eccessiva produzione di ROS, come

osservato nelle malattie ischemiche, o può causare una diminuzione della capacità degli

enzimi antiossidanti.

Come risultato, il normale ambiente intracellulare è compromesso, si osserva ossidazione e

aggregazione delle proteine e del DNA vitale, che si traduce nel fallimento della normale

funzione cellulare.

Le proteine ossidate si accumulano causando così infiammazioni acute[51].

Tuttavia, i cambiamenti nello stato redox cellulare possono anche essere un segnale per

l'attivazione della cascata apoptotica [52].

Grazie alla loro funzioni versatili, HSP possono intervenire a seguito di stress ossidativo a

(2)

- 42 - Per prima cosa, alcune HSP, soprattutto i membri della famiglia Hsp70 e sue co-chaperon,

svolgono un ruolo cruciale nello smistamento di proteine e nel controllo di qualità,

selezionando e indirizzando proteine aberranti verso il proteosoma o ai lisosomi per la

degradazione.

Secondariamente. alcune HSP, come hsp27, Hsp70 e Hsp90. possono regolare negativamente

l'apoptosi inibendo la cascata, mentre altre hanno azioni anti-infiammatorie.

Così, anche se la “via della morte cellulare” è stata attivata, HSP può effettivamente

intervenire per salvare le cellule dalla morte programmata.

E' noto che l'esposizione ad uno stress “precedente” aumenta la tolleranza di una cellula allo

stress “successivo”, e questo effetto è stato dimostrato essere dovuto, almeno in parte, ad un

aumento della sintesi di Hsp dopo lo stress “precedente”.

Così, l’aumento della sintesi Hsp può, non solo garantire un corretto riavvolgimento proteico,

ma può prevenire attivamente il danno proteico a seguito di stress ossidativo.

(3)

- 43 - Questo fenomeno dimostra che gli organismi sono capaci di risposte di adattamento allo

stress, che si traduce in un miglioramento della tolleranza di una cellula verso lo stress.

Anche se l'esposizione prolungata a stress estremo è probabile che sia nocivo, stress lieve

attiva l’HSR (risposta allo shock termico) e questo può avere effetti benefici sia

immediatamente che più a lungo termine, infatti, l'esposizione transitoria a quasi tutti gli

stress ambientali possono avere un effetto di protezione incrociata contro altre forme gravi di

stress [53], indicando che "un po'di stress" può farci bene.

Così, stress da precondizionamento è stato dimostrato proteggere i muscoli cardiaci [54], i

muscoli scheletrici [55] e i neuroni [56] da successive condizioni di stress ossidativo,

principalmente causato dal danno ischemico da riperfusione.

Ci sono un certo numero di geni che sono sovra-regolati a seguito dell’esposizione ad uno

stress da precondizionamento, tra cui un tipo di Hsp, soprattutto Hsp70 [57,58].

Dopo esposizione a stress cellulare, le probabilità di sopravvivenza neuronali sono connesse

alla capacità della cellula di elevate sintesi di Hsp70 [59].

La resistenza dei muscoli cardiaci e scheletrici al danno ischemico è stato anche dimostrato

essere correlato a livelli di Hsp70 che aumentano a seguito dell'esposizione ad uno stress da

precondizionamento [60].

Oltre a Hsp70, altri gruppi di proteine sono up-regolate da uno stress da precondizionamento,

tra cui una vasta gamma di fattori di trascrizione come NFkappaB, geni antiossidanti, fattori

(4)

- 44 - Pertanto, gli effetti di uno stress da precondizionamento sono tali che i meccanismi di difesa

cellulare agiscono tutti in sinergia contro ogni successiva esposizione al danno dello stress

ossidativo.

Sebbene studi su stress da precondizionamento possono essere utili in strategie terapeutiche,

la comprensione degli effetti molecolari e cellulari dello stress da precondizionamento può

aiutarci a determinare i livelli e la composizione delle HSP di protezione e di altri mediatori

citoprotettivi.

Sebbene ci sia una risposta cellulare allo stress questa è difficile da imitare terapeuticamente.

Diversi studi hanno quindi esaminato gli effetti della up-regolazione di Hsp70 in topi

transgenici che iper-esprimono Hsp70.

Sono stati successivamente esaminati gli effetti dello stress ossidativo con risultati talvolta

conflittuali.

Così, mentre alcuni studi hanno riportato una tolleranza maggiore al danno da cardiopatia

ischemica nei topi con sovra espressione di Hsp70 [61,62], altri hanno mostrato che i topi

transgenici con la stessa Hsp70 non tolleravano l’ischemia cerebrale meglio rispetto al

normale, anche se in vivo l’analisi suggerisce che topi con sovraespressione di Hsp70

mostravano lesioni cerebrali più piccole[63].

Questi risultati suggeriscono che, sebbene Hsp70 da sola non sia sufficiente per imitare le

azioni di protezione di stress da precondizionamento, è certamente un elemento importante

(5)

- 45 - Tuttavia, uno degli ostacoli più difficili per lo sviluppo di una terapia basata sulle Hsp per

qualsiasi malattia che coinvolge lo stress ossidativo, è il tempo giusto di induzione delle Hsp,

che deve avvenire all'interno di una finestra terapeutica relativamente piccola.

5.1.

Meccanismi di azione di HSP a seguito di stress ossidativo

La maggior parte dei danni ai tessuti che si verifica come conseguenza dello stress ossidativo

si ha dopo l'insulto reale, ad esempio in seguito a stress da riperfusione ischemica.

Pertanto, esiste una chiara opportunità terapeutica per un trattamento effettivo per agire

prima che la morte cellulare irreversibile si verifichi.

Un'efficace terapia anti-ossidante dovranno essere:

1) efficace nel rilevare i cambiamenti intracellulari,

2) essere in grado di proteggere dal mal ripiegamento proteico

3) essere in grado di impedire l'attivazione di eventi a valle. come l'escalation di reazioni

infiammatorie e l'attivazione di vie apoptotiche.

HSP sono note per svolgere un ruolo importante in tutte questi meccanismi cellulari.

HSP fungono anche da sensori di cambiamenti redox cellulari, forse la prima linea di difesa

contro il danno ossidativo deriva appunto dagli interruttori molecolari che riconoscono i

cambiamenti nell'ambiente redox intracellulare.

Nei batteri, Hsp33 è uno dei sistemi di proteine specializzate nel riconosce questo

(6)

- 46 - Queste proteine avvertono i cambiamenti redox nella cellula attraverso i loro numerosi

residui di cisteina altamente reattivi che lavorano in coordinazione con gli ioni di zinco.

A seguito di cambiamenti nello stato redox lo zinco è liberato da questo legame e si formano

legami disolfuro intermolecolari, che a loro volta attivano l'attività di chaperone della

proteina Hsp33 [65].

Anche nelle cellule eucariote è stato riscontrata una Hsp 33 simile [67,68].

Questi risultati suggeriscono che Hsp33 è altamente specializzata per le condizioni di stress

in cui le proteine si dispiegano come conseguenza.

Infatti, sembra che questa Hsp abbia un doppio sistema di sensori: i sensi di dominio dello

zinco che rilevano i cambiamenti redox e quelli che rilevano il dispiegamento proteico [65].

La piena attivazione di Hsp33 richiede l’attivazione di entrambi i domini[ 69].

Tuttavia, è chiaro che Hsp33 ed i suoi equivalenti negli eucarioti, come la HO-l (eme

ossigenasi 1) o Hsp32 e chaperon presenti nel reticolo endoplasmatico (ER), hanno un ruolo

unico nel rilevamento delle modifiche redox intracellulari e nel riequilibrare la capacità di

ripiegamento proteico al fine di superare l'accumulo di proteine ossidate [70,71].

La eme ossigenasi-l (HO-l) o Hsp32 è un enzima coinvolto nella degradazione dell'eme a

biliverdina, monossido di carbonio e ferro.

L’espressione di Hsp32 è inducibile in risposta ad un ampia e diversificata serie di fattori

indotti dallo stress, per esempio è indotto da NO (monossido d’azoto), dall'infiammazione,

(7)

- 47 - L'espressione di Hsp32 è regolata dall’attivazione del fattore di trascrizione delle HSP, heat

shock fattore 1 (HSF1).

L’espressione di Hsp32 e dei suoi effetti antinfiammatori e anti-apoptotici si ritiene essere

protettiva in numerosi stati patologici tra cui lesioni cardiache e ischemia/riperfusione.

5.2.

Effetti anti-apoptotici delle HSP

Lo stress ossidativo prolungato può portare alla morte cel1ulare mediante l'attivazione della

via apoptotica di morte cellulare.

Il rilascio di ROS (specie attive dell’ossigeno) può innescare una serie di vie intracellulari

che conducono il segnale verso il nucleo.

Così, in condizioni di stress ossidativo vengono attivate entrambe le vie, sia quella

mitocondriale che quella mediata dai recettori apoptotici [74,75].

I membri della famiglia di Hsp possono interagire con questi complessi a diversi livelli.

Così. gli effetti intracellulari di alcune HSP. come hsp27. Hsp70 e Hsp90. vanno al di la della

loro capacità di mantenere le proteine nel loro stato di ottimale ripiegamento.

Alcune HSP interagiscono primariamente con le proteine apoptotiche che sono attivate

attraverso la via mitocondriale di apoptosi mediata.

Le HSP svolgono quindi un ruolo importante nel potenziale di manutenzione e

sopravvivenza delle cellule, agendo come proteine anti-apoptotiche, una funzione che sembra

(8)

- 48 - Hsp70 e Hsp90 sembrano interagire con Apaf-l (fattore di attivazione di proteasi

apoptotica-l), inibendo gli eventi a valle dell’attivazione di Apaf-l [76-77].

Apaf-l è normalmente attivato dal citocromo c rilasciato dai mitocondri e questa attivazione

porta alla formazione dell’apoptosoma e la successiva attivazione della caspasi-9 [78].

Hsp27 è in grado di inibire l'apoptosi, o inibendo il rilascio del citocromo c mitocondriale

[79,80] o legandosi direttamente al citocromo c [81].

Inoltre. Hsp70 sequestra AIF rilasciato dai mitocondri. impedendo così la morte caspasi

cellula indipendente [82].

5.3.

Effetti antinfiammatori delle HSP

Uno degli eventi che si verifica a seguito del danno ossidativo è l'attivazione di percorsi

infiammatori. La risposta infiammatoria è principalmente regolata dal fattore di trascrizione

NFkappaB [83].

NFkappaB è normalmente localizzato nel citosol legato e inibito da IkappaB.

In seguito a stress ossidativo. NFkappaB si libera, trasloca al nucleo e attiva la trascrizione di

mediatori infiammatorio a valle quali iNOS, citochine infiammatorie come il TNF-alfa e

(9)

- 49 - Benché un meccanismo primariamente citoprotettivo, il processo infiammatorio può

trasformarsi in uno stimolo che induce l’apoptosi arrivando quindi fino alla morte cellulare.

[84].

Si suggerisce che vi sia una relazione tra Hsp70 e di mediatori infiammatori, come

cicloossigenasi-2 (COX-2) e il fattore di trascrizione NFkappaB.

Nei casi di infiammazione e ictus, un’esposizione ad uno stress di precondizionamento o

up-regolazione di Hsp70 riducono l’espressione di COX-2 e la produzione di monossido d’azoto

(NO) [85-86].

Queste azioni antiinfiammatorie di Hsp70 sono mediate dal legame di Hsp70 con NFkappaB

e la sua inibizione successiva.

E’ stato dimostrato che Hsp70 impedisce la traslocazione nucleare di NFkappaB e questo

effetto è mediato, almeno in parte, dalla inibizione di eventi che avvengono a monte

dell’attivazione di NFkappaB [87-88].

D'altra parte, l'infiammazione stessa è uno stimolo per aumentare la produzione di Hsp70

[89-90].

Esiste un meccanismo di feedback negativo tra alcuni mediatori dell'infiammazione e Hsp70.

Per esempio la sovra-espressione di COX-2 inibisce la sintesi Hsp70 in seguito a shock

termico. e l’espressione dell’inibizione di Hsp70 può essere invertita somministrando

(10)

- 50 - Sorprendentemente, i farmaci anti-infiammatori non steroidei (FANS) che inibiscono la

COX-l e la COX-2 aumentano la sintesi Hsp70.

Tuttavia, questa azione dei FANS è probabilmente mediata dall’attivazione di HSFl piuttosto

che dall'inibizione di NFkappaB [92].

In sintesi c'è una grande quantità di prove che dimostrano che le HSP hanno effetti benefici

su danni causati dallo stress ossidativo, come il mal ripiegamento proteico, l'apoptosi e

infiammazione.

E' ben noto che, a seguito di un’esposizione ad uno stress di precondizionamento, la corretta

composizione e la localizzazione di complessi di Hsp può preparare una cella a far fronte alle

successive condizioni di stress ossidativo.

5.4.

Ruolo delle HSP nei disturbi causati dallo stress

ossidativo

Lo stress ossidativo gioca un ruolo in una vasta gamma di condizioni patologiche,

Si è visto che le HSP intervengono nella neurodegenerazione e nelle condizioni ischemiche

del cervello (ictus) e del cuore (malattie cardiovascolari).

Questi sono complessi disturbi multifattoriali, che coinvolgono un numero di percorsi e di

meccanismi cellulari e quindi non è sempre possibile distinguere il livello preciso in cui sono

(11)

- 51 -

5.5.

Neurodegenerazione

Anche se la causa della maggior parte delle malattie neurodegenerative è molto specifica,

colpendo solitamente determinate popolazioni di neuroni e causando un fenotipo clinico

caratteristico, è probabile che la maggior parte di questi disturbi condivida alcuni percorsi

comuni.

Ad esempio, una serie di meccanismi che includono eccito-tossicità data dall’acido

glutammico, l’eccessiva produzione di ROS, la compromissione del trasporto assonale, il mal

ripiegamento proteico , la neuro-infiammazione e l’attivazione della cascata apoptotica sono

tutti implicati nello svolgere un ruolo in una serie di malattie neurodegenerative tra cui la

malattia di Alzheimer (AD), la malattia di Parkinson (PD), la malattia di Huntington (HO) e

la Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA).

Per alcuni di questi disturbi, la generazione di modelli di topi transgenici è stato un utile

strumento di sperimentazione non solo per lo studio della patogenesi della malattia, ma anche

per i test preclinici.

Ci sono una serie di studi che descrivono gli effetti benefici della “up-regulation” di HSP in

modelli di malattie neurodegenerative quali PD e AD.

In uno modello in vivo di sclerosi multipla (SM), uno stress ipertermico breve da

precondizionamento ha dimostrato portare ad un notevole livello di neuroprotezione che è

accompagnato da un aumentato dei livelli di Hsp70 e una ridotta attivazione di NFkappaB

(12)

- 52 - E’ importante sottolineare che questi effetti di un condizionamento termico in questo

modello della SM può essere parzialmente imitato dagli inibitori di Hsp90

In modelli cellulari di SLA una sovra-espressione di Hsp70 è stata evidenziata per ridurre la

formazione di aggregati, migliorare l'attività e la sopravvivenza delle cellule [95-96].

Questi effetti citoprotettivi delle HSP non sono limitati alle Hsp70. ma alla sovra-espressione

simultanea di più HSP tra cui Hsp70, Hsp40 e hsp27 [97-98].

Poiché infatti tutte le funzioni di Hsp richiedono una interazione finemente sintonizzati tra

esse, le co-chaperon e proteine bersaglio, non è sorprendente che un’aumentata espressione

di una singola HSP sia meno efficace.

5.6.

Malattie cardiovascolari: danno ischemico cardiaco e

celebrale

L'ictus è la principale causa di disabilità grave negli Stati Uniti e in Europa e deriva da una

interruzione nella fornitura di sangue al cervello. dovuta ad ischemia (mancanza di sangue)

causata da trombosi o embolia o a causa di una emorragia.

Questa mancanza di afflusso di sangue lascia i neuroni senza supporto nutrizionale causando

(13)

- 53 - L'ossigeno e il glucosio si esauriscono, la produzione di ATP è ridotta. E ciò porta ad un

fallimento dei processi che sono energia-dipendenti, compreso il mantenimento del

potenziale di membrana neuronale.

Questo a sua volta innesca una serie di eventi che includono il rilascio di glutammato nello

spazio extracellulare, l'afflusso di calcio , l'attivazione di sistemi d’infiammazione, e la morte

apoptotica.

In aggiunta. l'aumento del glutammato extracellulare ha un effetto eccito-tossico sui neuroni

vicini.

La mancanza di fornitura di energia porta alla generazione di ROS e quindi a danno

ossidativo, aggravando ulteriormente il danno cellulare.

Così, in corsa c'è una rapida attivazione di una serie di percorsi distruttivi.

Inoltre, quando l'afflusso di sangue viene ripristinato nella parte danneggiata del cervello

questo reintroducendo ossigeno può provocare ulteriore danni ossidativi (danno da

riperfusione).

A seguito di danno ischemico da riperfusione vi è un transitorio aumento di espressione Hsp

in alcune regioni del cervello come nell'ippocampo, nella corteccia entorinale e striata, con

un picco 24-48 ore dopo l’evento.

Altresì la fornitura di sangue nei muscoli cardiaci ha gli stessi effetti deleteri osservati

(14)

- 54 - In condizioni ischemiche del cuore, come infarto del miocardio, la produzione di ROS e

stress ossidativo svolge un ruolo importante nella patologia che porta alla morte delle cellule

muscolari cardiache.

Ci sono ampie prove dell'induzione di HSP nella cardiopatia ischemica [99-100] e della

relazione inversa tra i livelli di Hsp nel cuore e la sua resistenza ad ischemia [101].

Negli esperimenti di condizionamento è stato dimostrato che l'attivazione dell'eme ossigenasi

(HO) è un elemento importante per gli effetti protettivi da precondizionamento nel cuore

[102].

Nei modelli di ischemia cardiaca. gli effetti protettivi dell’iperespressione genetica di Hsp70

sono inequivocabili.

A seguito di un insulto ischemico, la sovraespressione di Hsp70 nei topi trasgenici ha

dimostrato causare una dimensione dell'infarto minore e un miglioramento della funzione

miocardica rispetto ai loro fratellini non-transgenici.

Tuttavia, l'induzione farmacologica di HSP ha dimostrato essere propensa nel proteggere i

neuroni dal danno ischemico.

Ad esempio, il pretrattamento con la proteina chinasi C (PKC) ha dimostrato essere

neuroprotettivo nell’ischemia celebrale in un modello di ratto [103,104]. I

In questi topi, sia i livelli di hsp27 che quelli di hsp70 sono significativamente elevati come

conseguenza di trattamento farmacologico e la dimensione dell'infarto è risultata

(15)

- 55 -

5.7.

Meccanismo neuroprotettivo di precondizionamento

ischemico celebrale [105]

L’ischemia cerebrale è una delle cause più comuni di morte e la principale causa di disabilità

nel mondo.

Con precondizionamento ischemico cerebrale (BIP) si definisce una transitoria ischemia

subletale che si traduce in tolleranza a successivi attacchi, altrimenti letali, di ischemia

cerebrale.

Molti tentativi sono stati fatti per comprendere i meccanismi molecolari e cellulari alla base

della neuroprotezione offerta dal precondizionamento ischemico.

Molti studi hanno dimostrato che i meccanismi neuroprotettivi possono coinvolgere una serie

di vie molecolari di regolazione, come: l'attivazione della N-metil-D-aspartato (NMDA), i

recettori per l'adenosina, l'attivazione di vie di segnalazione, le protein chinasi mitogene

attivate (MAPK), la sovra-regolazione di Bcl-2, le proteine da shock termico (HSP),

l'attivazione della via ubiquitina-proteasoma e la via autofagico-lisosomiale.

Una migliore comprensione dei processi che portano alla morte cellulare dopo l'ictus, nonché

dei meccanismi endogeni neuroprotettivi da BIP che proteggono contro gli insulti ischemici

cerebrali successivi, potrebbe aiutare a sviluppare nuove strategie terapeutiche per questa

(16)

- 56 - In generale, qualsiasi stimolo in grado di provocare lesioni a un tessuto o organo può, se al di

sotto della soglia di danno, attivare meccanismi protettivi endogeni e quindi potenzialmente

ridurre l'impatto di un successivo attacco più grave.

Un insulto ischemico sotto-soglia applicato ad un organo, per esempio, attiva vie cellulari

che possono contribuire a ridurre i danni causati da gravi episodi ischemici successivi.

Questa osservazione suggerisce che il precondizionamento ischemico è una reazione

adattativa ad uno stimolo potenzialmente nocivo, come l'ischemia, l’ipossia, l’ipoglicemia, o

l’infiammazione.

Il cervello è uno degli organi più sensibili al danno.

E' ben accertato che, almeno nei mammiferi, il cervello è di circa il 3% della massa corporea,

ma riceve circa il 15% della produzione totale cardiaca e consuma il 20% di ossigeno del

corpo.

Un costante flusso di sangue al cervello è essenziale per fornire ossigeno e glucosio ai

neuroni.

Se questo flusso è interrotto anche solo per un breve periodo di tempo, il risultato è un danno

cellulare o la morte.

I neuroni sono raramente sostituite una volta che sono morti, così il danno alle regioni colpite

può essere permanente.

(17)

- 57 - Riduzione del flusso ematico al di sotto della prima soglia inducono un guasto elettrico

all'interno dei neuroni e ulteriore riduzione del flusso ematico al di sotto della seconda soglia

conducono al fallimento del metabolismo e delle pompe di ioni.

Cellule con perfusione inferiore rispetto alla seconda soglia sono designate a morire.

Tra le due soglie, le cellule sono elettricamente in silenzio, ma mantengono comunque un

basso livello di attività metabolica.

Se il normale flusso di sangue viene ripristinato entro un ragionevole lasso di tempo, il

sistema si può recuperare senza danni apparenti.

Lunghi periodi di ischemia, comunque, porteranno alla morte,

Quindi, queste cellule hanno un destino variabile, e ciò è conosciuto come ”penombra

ischemica”.

Sono appunto le cellule all’interno di questa penombra ischemica le beneficiarie del

precondizionamento ischemico.

Negli ultimi anni, i meccanismi di BIP sono stati studiati sistematicamente e ciò ha portato

alla scoperta di meccanismi che vi partecipano.

Questo apre una finestra per scoprire i meccanismi endogeni neuroprotettivi e,

potenzialmente, una finestra di opportunità nell’utilizzare questi meccanismi in clinica per il

(18)

- 58 -

5.8.

HSP ed ischemia celebrale

Sebbene la sintesi proteica sia per la maggior parte inibita dopo l’ischemia cerebrale, la

restante sintesi attiva può avere un ruolo importante nel mantenimento della vitalità cellulare.

Le HSP risultano infatti essere sintetizzate durante l’ischemia.

Molti ricercatori hanno dimostrato gli ampi collegamenti tra la sovraespressione di HSP70 e

la tolleranza al danno cerebrale ischemico.

Inoltre, RNA messaggero (mRNA)di HSP70 è comparso nei casi di ischemia di 15 min, 2

giorni dopo il trattamento “placebo” e nei casi di ischemia di 15 min, 2 giorni dopo il

precondizionamento di 10 minuti.

Ulteriori studi hanno riferito che il precondizionamento termico con una temperatura di 44 °

C protegge i neuroni del cervelletto di ratti modulando l'espressione HSP70.

HSP70 mRNA è stata rilevata dopo il precondizionamento termico a 30, 60, e 90 min e

aumentata gradualmente nel tempo, mentre oligodeossinucleotidi antisenso HSP70

inibiscono gli effetti protettivi del precondizionamento termico contro l'apoptosi.

Tutti questi risultati implicano che HSP70 ha un ruolo importante nel processo di

precondizionamento.

I meccanismi delle HSP70-mediata alla base della BIP non sono quindi solo legati alle sue

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