CAPITOLO 5 Parte Sperimentale

CAPITOLO 5

Parte Sperimentale

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5.1 Strumentazione e materiale

La purificazione dei prodotti tecnici mediante cromatografia liquida è stata effettuata utilizzando una colonna di vetro Ø 26 mm con fase stazionaria: gel di silice Ø 0.06 ÷ 0.20 mm (C. Erba).

Per la TLC sono state impiegate lastre Silica gel 60 F254 Merck, utilizzando per la deposizione dei capillari tarati da 5 µl. Rivelatore: cabina oscura equipaggiata con lampada UV a due lunghezze d’onda: 254nm e 365nm.

Gli spettri UV-Vis sono stati ottenuti su uno spettrofotometro a doppio raggio della Shimadzu serie UV-2401PC interfacciato con un PC per l’elaborazione dei dati.

Gli spettri IR sono stati ottenuti su uno spettrofotometro FT-IR Shimadzu MIRacle10, anch’esso interfacciato con un PC per l’elaborazione dei dati.

Gli spettri 1H NMR sono stati registrati su uno spettrometro Varian 400

spectrometer operating at 400 MHz presso il Dipartimento di Chimica Farmaceutica.

L’analisi HPLC è stata condotta su un’apparecchiatura Shimadzu HPLC

LC-10AD costituita da una pompa, un sistema di dispensazione quaternario dei solventi, in grado di effettuare gradienti a bassa pressione e dotato di un rivelatore UV-Vis. Il sistema era interfacciato con un PC per l’elaborazione dei dati. La colonna usata è costituita da una fase stazionaria C18 (R= -C18H37) di

dimensioni 100x4.60 mm e particelle 100 A.

I solventi acetato di etile, etere di petrolio, di grado RP (Carlo Erba Reagenti), acetonitrile (HPLC grade Sigma-Aldrich) sono stati usati senza ulteriori

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trattamenti. Per l’analisi HPLC, l’acqua demineralizzata è stata distillata prima dell’uso e poi filtrata su membrane di nitrato di cellulosa con pori di 0.45 µm. Le miscele di solventi per HPLC sono state previamente degassate mediante bagno a ultrasuoni ( Soltec Sonica Ultrasonic Cleaner M2200) per evitare la formazione di bolle.

Come composti di riferimento per l’analisi cromatografica sono stati impiegati: 4-cloro-3-metil-fenolo (Sigma Aldrich) con grado di purezza del 99%, o-fenilfenolo come campione tecnico (> 99 %) presente in laboratorio senza ulteriori trattamenti; TCMTB, purificato mediante cromatografia su colonna a partire da un prodotto commerciale all’ 80 %; NOIT, purificato mediante evaporazione a pressione ridotta del solvente (glicole propilenico) da un prodotto commerciale al 45 % circa e successiva cromatografia su colonna del residuo.

Tutti gli altri prodotti utilizzati per le prove applicative sono preparati commerciali di grado tecnico, utilizzati senza ulteriori trattamenti.

Le prove di applicazione su pelle sono state effettuate su apparecchi dedicati a questo scopo: bottalini Fer.Ti13 ed armadio giragiare14.

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I bottalini sono interamente costruiti in acciaio e dotati di un sistema di riscaldamento; si usano comunemente in laboratorio, in quanto le loro contenute dimensioni permettono di fare prove su pelle, prima di portare la procedura su scala più grande.

Sono di forma cilindrica ruotante sul proprio asse, all’interno sono poste delle “mensole” allo scopo di trascinare le pelli fino alla sommità, per farle poi cadere per gravità. La caduta esercita sulle pelli un’energica azione meccanica, che favorisce la penetrazione dei prodotti chimici. Sono dotati di un sistema di riscaldamento e di controllo della velocità di rotazione.

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Anche l’armadio giragiare è utilizzato nei laboratori al medesimo scopo; di dimensioni ulteriormente ridotte, permette, quindi, di portare avanti fino a quattro prove contemporaneamente. Anch’esso è dotato di un sistema di riscaldamento e di controllo della velocità di rotazione.

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5.2 TCMTB

Purificazione del TCMTB all’80% (TCMTB80) con il metodo della cromatografia su colonna di gel di silice.

Alcune prove preliminari su lastrina TLC, deponendo 3 µl di una soluzione all’ 1% di TCMTB80 in acetato di etile, hanno mostrato che le condizioni: eluente acetato di etile / etere di petrolio= 95:5, risultavano appropriate.

Infatti, in queste condizioni, TCMTB80 mostra due macchie, una più grande con

Rf=0.62 e una più piccola con Rf=0.38.

Le frazioni ottenute sono state analizzate mediante TLC (tra le frazioni raccolte ce n’è una che mostra solo la macchia corrispondente a quella con Rf= 0.62) e, dopo evaporazione del solvente, analizzate allo spettrometro UV nella regione da 400 nm a 190 nm (solvente acetonitrile).

Confrontando l’assorbimento massimo a 300 nm del TCMTB80 con quello della migliore frazione eluita dalla colonna si può dire di avere ottenuto uno standard con un grado di purezza di circa il 95 %.

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Il prodotto è stato inoltre caratterizzato tramite spettroscopia IR e 1H NMR

IR

2979 cm-1 banda larga e intensa (36% T) stretching dei C-H aromatici

2162 cm-1 stretching C ≡ N

1_{H NMR}

δ= 8.1 ppm (1H, ddd , J D-C = 8 Hz, J D-B =1.4 Hz, J D-A < 1 Hz ) HD

δ= 7.9 ppm (1H, ddd, J A-B = 8 Hz, J A-C =1.2 Hz, J A-D < 1 Hz ) HA

δ= 7.5 ppm (1H, td, J C-D, C-B oppure J B-A, B-C = 6 Hz, J B-D oppure J C-A < 1 Hz ) HB o HC

δ= 7.4 ppm (1H, td, J C-D, C-B oppure J B-A, B-C = 6 Hz, J B-D oppure J C-A < 1 Hz ) HC o HB δ= 5.2 ppm (2H, s ) CH2 7 HA HB HC HD CH 2

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È stata quindi costruita una curva di taratura con soluzioni a diverse concentrazioni di TCMTBpurificato in acetonitrile, analizzandole tramite HPLC a fase

inversa con rilevatore UV.

Condizioni:

o Fase mobile: acetonitrile /acqua = 60:40

o Flusso: 0.8 ml/min

o Lunghezza d’onda 280 nm

o Volume iniettato: 20 µl

Il TCMTBpurificato , in queste condizioni, ha un tempo di ritenzione di 3.6 min.

La curva di taratura che si ottiene è riportata di seguito.

Curva di taratura1. TCMTB y = 61916x + 264670 R² = 0,9988 0 2000000 4000000 6000000 8000000 10000000 12000000 14000000 16000000 18000000 20000000 0 50 100 150 200 250 300 A R E A p ic co mg/l

TCMTB

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5.3 NOIT

Per l’ottenimento di uno standard cromatografico di NOIT, dopo che il solo passaggio in colonna con gel di silice del prodotto di partenza aveva dato scarsi risultati, il passo successivo è stato quello di fare una distillazione a pressione ridotta per allontanare il solvente (glicole propilenico).

Il residuo, contenente NOIT concentrato, è stato infine cromatografato su colonna di gel di silice, utilizzando una colonna di vetro.

Anche in questo caso prove preliminari di TLC avevano mostrato che le condizioni: eluente acetato di etile / etere di petrolio= 95:5 risultavano appropriate mostrando una macchia con Rf= 0.45.

Le frazioni ottenute sono state analizzate mediante TLC e quella ritenuta migliore, dopo evaporazione del solvente, analizzata allo spettrometro UV nella regione da 400 nm a 190 nm (solvente acetonitrile).

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IR:

3100 cm -1 banda larga e intensa (27% T) stretching C=C nell’anello

2800-2900 cm-1 due bande strette (47%-25% T) CH2—CH2 e CH3 1616 cm-1 banda

stretta (50% T) C=O

780 cm-1 bending fuori dal piano CH2

1_{H NMR} δ= 8.4 ppm ( 1 H, d, J A-B = 6.2 Hz ) HA δ= 6.1 ppm ( 1 H, d, J B-A = 6.2 Hz ) HB δ= 3.6 ppm ( 2 H, t, J =7.2 Hz ) H1 δ= 1.5 ppm ( 2 H, multipletto ) H2 δ= 1.2 ppm ( 10 H, multipletto ) H3÷7 δ= 0.8 ppm ( 3H, t ) H8 8

Le frazioni raccolte dal passaggio in colonna di gel di silice sono state analizzate tramite HPLC per verificare la migliore in termini di purezza e utilizzarla, quindi, per costruire la curva di taratura.

H6 HB HA H1 H2 H3 H4 H5 H7 H8

80

Condizioni:

o Fase mobile: acetonitrile /acqua = 60:40

o Flusso: 0.8 ml/min

o Lunghezza d’onda 280 nm

o Volume iniettato: 20 µl

NOIT, in queste condizioni, ha un tempo di ritenzione di 3.2 min.

Di seguito la curva ottenuta:

Curva di taratura 2. NOIT

y = 41398x + 3E+06 R² = 0,9935 0 10000000 20000000 30000000 40000000 50000000 60000000 0 500 1000 1500 A re a mg/l

NOIT

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5.4 Miscela di fenoli

IR:

o-fenilfenolo:

3535 cm-1 banda stretta e intensa (25% T) stretching O-H

3239 cm-1 banda larga stretching C - H aromatici 1328 banda stretta (61%T) C=O

4-cloro-3-metil-fenolo:

3204 cm -1 banda larga e intensa (9.8% T) O-H

2957 cm-1 (67%T) banda dei CH aromatici

2929 cm-1 banda (72%T) C-H3

1236 cm-1 (43%T) stretching C-OH

La curva di taratura per o-fenilfenolo è stata ottenuta dal prodotto tecnico presente in laboratorio analizzato tramite HPLC.

Ha un tempo di ritenzione di 2.8 min.

La stessa procedura è stata utilizzata per la ottenere la curva del 4-cloro-3-metil-fenolo acquistato.

82 Curva di taratura 4. OPP

Curva di taratura 5. PCMC y = 30897x + 762787 R² = 0,9981 0 5000000 10000000 15000000 20000000 25000000 30000000 0 200 400 600 800 1000 A R E A mg/l

o-fenilfenolo

4-cloro-3-metilfenolo

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5.5 Prove applicative su pelle

Pezzi di pelle piclata (vedi paragrafo 4.2.3.1) a disposizione in laboratorio Dermacolor, sono stati pesati e numerati.

Il bagno è stato portato ad una densità di 1.4-1.5 °Bé aggiungendo NaCl (1.5 Kg per circa 10 l) i pezzi di pelle sono stati conciati al cromo nel giragiare con:

- 50%15 di bagno

- 10%3 di sale di cromo ( espresso come Cr2O3 )

Dopo 3 h si è aggiunto l’ 1 % di ossido di magnesio verificando successivamente che il pH fosse intorno a 4 (qualora inferiore, si aggiunge 0.3% di bicarbonato di Na fino a pH intorno a 4). A seguire, è stato effettuato, nello stesso bagno, il trattamento con i biocidi (3 h) secondo la seguente tabella.

Al termine di questa operazione, i pezzi di pelle sono stati sciacquati con acqua e posti a cavalletto.

CAMPIONE PESO in g TCMTB NOIT MISCELA

FENOLI TCMTB / NOIT 1 490 2 714 0,05% 3 645 0,1% 4 495 0,2% 5 352 0,1% 6 497 0,2% 7 759 0,1% 8 736 0,2% 9 569 0,1% 10 587 0,2% 11 589 12 675 0,2% 13 577 0,1% 14 523 0,2% 15 619 16 708 0,1% nessun trattamento nessun trattamento nessun trattamento 15

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5.5.1 Determinazione del contenuto di biocidi su campioni di pelle

Da ciascun pezzo di pelle è stato prelevato un campione, una parte del quale è servita per la determinazione del peso secco, mentre su 1 ± 0.1 g è stata effettuata la ricerca del contenuto di biocidi.

Il campione macinato è stato estratto con acetonitrile (20 ml) in bagno a ultrasuoni per 1 h. (Durante questa operazione la temperatura aumenta fino a 35-40 °C)

L’estratto è stato filtrato attraverso membrana di nitrato di cellulosa(0.45 µm), e il filtrato analizzato tramite HPLC nelle medesime condizioni delle curve di taratura.

• Fase mobile: acetonitrile /acqua = 60:40

• Flusso: 0.8 ml/min

• Lunghezza d’onda 280 nm

• Volume iniettato: 20 µl

Di seguito i risultati ottenuti:

trattamento quantità effettiva di p.a. in 1g estratto (mg/L) area picco (TCMTB) area picco (NOIT) area picco (OPP) area picco (PCMC) quantità trovata (mg/l) TCMTB quantità trovata (mg/l) NOIT quantità trovata (mg/l) (OPP) quantità trovata (mg/l) (PCMC) 1 nessun trattamento −−− 671705 −−− 45645 44472 10,85 −−− 1,48 2,96 2 0.05% TCMTB (20%) 5 536856 −−− 14656 23036 8,67 −−− 0,47 1,53 3 0.1% TCMTB (20%) 10 403770 −−− 8592 10845 6,52 −−− 0,28 0,72 4 0.2% TCMTB (20%) 20 643288 124962 23235 40232 10,39 3,02 0,75 2,68 5 0.1% NOIT (45%) 22,5 462743 330331 38867 43927 7,47 7,98 1,26 2,92 6 0.2% NOIT (45%) 45 752536 1625946 64237 59602 12,15 39,28 2,08 3,97 7 0.1% TCMTB/NOIT 10/1.5 586135 38756 66310 86659 9,47 0,94 2,15 5,77 8 0.2% TCMTB/NOIT 20/3 1139131 40435 24760 79661 18,40 0,98 0,80 5,30 9 0.1% OPP/PCMC 5/12 591212 46127 73337 96458 9,55 1,11 2,37 6,42 10 0.2% OPP/PCMC 10/24 144496 175223 169482 219896 2,33 4,23 5,49 14,64 11 nessun trattamento −−− 91662 −−− −−− −−− 1,48 −−− −−− −−− 12 0.2% TCMTB (20%) 20 439359 4468 7924 19008 7,10 0,11 0,26 1,27 13 0.1% TCMTB (20%) 10 227753 −−− 60400 35473 3,68 1,95 2,36 15 nessun trattamento −−− 70534 9209 54412 58945 1,14 0,22 1,76 3,92 16 0.1% OPP/PCMC 5/12 −−− −−− 74434 134201 −−− −−− 2,41 8,93