…il potenziale creativo dei sistemi di
regolazione è dovuto alla loro natura gerarchica e
combinatoria. Notevoli variazioni di forme animali
possono prodursi a diversi livelli, semplicemente
rimaneggiando i sistemi dei numerosi geni regolatori
che determinano il momento in cui si esprime l’uno o
l’altro gene. E’ la somiglianza dei geni che governano
lo sviluppo embrionale di organismi molto diversi che
rende alla fine possibile l’evoluzione di forme diverse.
Se per la comparsa di ogni nuova specie fosse stata
necessaria la formazione di nuovi sistemi di
regolazione, non ci sarebbe stato abbastanza tempo
per permettere l’evoluzione descritta in paleontologia.
E’ il «bricolage» evolutivo che permette agli elementi
regolatori di combinarsi in svariati sistemi di
sviluppo…
UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI PISA
Facoltà di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali
Tesi di laurea in SCIENZE BIOLOGICHE
Sarah Decembrini
RUOLO DEL CICLO CELLULARE NELLO
SVILUPPO RETINICO DEI VERTEBRATI
SOMMARIO
ABSTRACT ... 6
RIASSUNTO... 8
INTRODUZIONE ... 10
Lo sviluppo del sistema nervoso. ...11
Formazione delle vescicole encefaliche. ...12
Organizzazione istologica del sistema nervoso centrale embrionale...12
Lo sviluppo dell’occhio nei Vertebrati...15
Morfogenesi e struttura della retina. ...15
Determinazione del destino neurale di cellule retiniche: modello della “competenza” cellulare...21
Fattori estrinseci nella retinogenesi. ...23
Fattori intrinseci nella retinogenesi...24
Geni pax...25 Geni Otx...26 Geni Six...27 Geni Rx ...28 Gene Chx10...29 Gene Xbh1...30
Geni proneurali con dominio “helix-loop-helix”...30
La CMZ:una ricapitolazione della retinogenesi...34
Ciclo cellulare e differenziamento. ...37
Gene gadd45γ (growth arrest and DNA damage-inducible). ...40
Scopo della Tesi...44
MATERIALI E METODI ... 45
Tecniche di base di biologia molecolare...46
Costrutti...46 Vettori plasmidici. ...46 Cloni plasmidici...49 Anticorpi ...50 Anticorpi I° ...50 Anticorpi II° ...51
Embrioni di Xenopus laevis...51
Trattamenti con Idrossiurea/Afidicolina (HUA). ...53
Lipotrasfezione di embrioni di Xenopus laevis...53
Vettori di espressione...56
Microiniezione. ...58
Visualizzazione ed analisi delle cellule lipotrasfettate. ...58
Trattamento statistico dei dati...59
Incorporazione di BrdU...59
Istologia...60
Fissazione...60
Disidratazione ...60
Inclusione...61
Criosezioni di retine embrionali. ...61
Immunoistochimica. ...61
Iniezione e rivelazione della Bromodeossiuridina (BrdU). ...62
Ibridazione in situ su sezioni. ...63
Sintesi in vitro delle sonde...63
Ibridazione e rivelazione...63
Microfotografie. ...66
RISULTATI... 67
“Timing” retinogenetico in Xenopus leavis...68
L’espressione di Xbh1, Xotx2, Xotx5 e Xchx10 identifica distinti tipi cellulari retinici. ...69
Espressione dei fattori di trascrizione homeobox nella CMZ...72
Analisi funzionale del gene Xchx10. ...72
“Pattern” di espressione del gene Xgadd45γ durante la retinogenesi. ...75
Analisi funzionale del gene Xgadd45γ nel differenziamento dei tipi cellulari retinici. 75 La proliferazione forzata dei progenitori retinici richiede la presenza di Xotx2 per promuovere il differenziamento di cellule bipolari. ...81
Effetto del blocco del ciclo cellulare mediato da HUA su proliferazione cellulare, differenziamento ed espressione genica durante la retinogenesi...83
Lipotrasfezione dei fattori responsabili del differenziamento retinico in presenza del blocco del ciclo cellulare...87
Colipotransfezione di Xgadd45y e Xchx10...87
Colipotrasfezione di Xgadd45γ e Xotx5...90
Colipotrasfezione di Xgadd45γ e Xotx2...90
Colipotrasfezione di Xgadd45γ e Xbh1...93
Inibizione di Xotx5 in seguito a lipotrasfezione di Xgadd45γ. ...93
DISCUSSIONE... 96
“Timing” retinogenetico in Xenopus laevis...97
Fattori di trascrizione homeobox: geni chiave della specificazione dei tipi cellulari retinici? ...98
Effetti del blocco del ciclo cellulare sul destino dei tipi cellulari retinici...99
Progressione del ciclo cellulare, espressione dei geni chiave del destino
differenziativo e “timing” retinogenetico. ...103
ABSTRACT
The different types of vertebrate retinal cells exit from the cell cycle at distinct times of development. Early differentiating neuronal progenitors generate ganglion cells, followed by cones, horizontal cells, amacrine cells, rods and finally bipolar cells. According to current models, retinal neuronal progenitors would change their differentiation competence over time; thus the type of cells generated by a progenitor would partly depend on its birth date. By in vivo lipofection exepriments, we found that forced arrest of the cell cycle induced by the antiproliferative gene Xgadd45γ supports differentiation of early retinal cell types and prevents the generation of late retinal cell types. Conversely, forced progression of the cell cycle by overexpression of Xcdk2 and
XcyclinA2 exerts the opposite effect. We recently found that some homeobox
transcription factors play a pivotal role in specifying distinct retinal cell fates such as ganglion cells (Xbh1), photoreceptors (Xotx5) and bipolar cells (Xotx2). In addition, we have characterized a fourth homeobox transcription factor, Xchx10, which is sufficient to specify bipolar cell fate. We found that block of cell cycle progression of embryonic retinal progenitors by Hydroxyurea-Aphidicolin (HUA) treatment downregulates mRNA expression of these four key genes without affecting mRNA expression of other transcription factors such as Xrx1 and Xath5. Our findings supports the idea that cell cycle progression of neuronal retinal progenitors is necessary to support the expression of key genes of cell fate specification, and thus controls proper retinal histogenesis. This is also suggested by the observation that forced cell cycle progression does not support bipolar cell differentiation any more when Xotx2 is knocked down. A working model predicts that over-expression of one of the key genes of cell fate specification would have stronger and/or different effects in the absence of cell cycle progression than its over-expression in normal cycling progenitors. This is what we observed by co-lipofecting Xgadd45γ with the three transcriptional activators Xotx5, Xotx2 and Xchx10. In these experiments, each gene strongly supports differentiation of one specific cell type: photoreceptors (Xotx5 and Xotx2) or bipolar cells (Xchx10). On the other hand, the effect of colipofection of Xgadd45γ and Xbh1, which is a transcriptional repressor, does not differ from that of simple Xbh1 lipofection. We speculate that cell fate specification of retinal neurons depends on distinct combinations of key homeobox transcription
factors, and that cell cycle progression is necessary to support their transcription, to refine their pattern of expression and possibly regulate their timing of activation.
RIASSUNTO
I differenti tipi cellulari retinici che compongono la retina dei Vertebrati escono dal ciclo cellulare in momenti diversi dello sviluppo. I primi progenitori neuronali che si differenziano daranno origine a cellule gangliari, seguite da coni, cellule orizzontali, cellule amacrine, bastoncelli ed infine da cellule bipolari. In accordo con questo modello i progenitori cellulari retinici cambiano la loro competenza differenziativi con il passare del tempo, cosicché il tipo cellulare generato da un progenitore è parzialmente dipendente dalla sua data nascita.
Esperimenti di lipotrasfezione in vivo dimostrano che forzando l’arresto del ciclo cellulare, mediante sovraespressione del gene antiproliferativo Xgadd45y, si ottiene la formazione di tipi cellulari precoci a discapito dei più tardivi. Viceversa, forzando la progressione del ciclo cellulare con XciclinaA2/Xcdk2 si ottengono effetti opposti. Recentemente è stato scoperto che alcuni fattori di trascrizione di tipo homeobox svolgono un ruolo centrale nella determinazione del destino differenziativo di cellule retiniche. Xbh1 induce differenziamento di cellule gangliari, Xotx5 dii fotorecettori e
Xotx2 di cellule bipolari. In questa tesi è stato caratterizzato un quarto fattore di
trascrizione di tipo homeobox, Xchx10, che è sufficiente per specificare il destino bipolare.
E’ stato osservato che il blocco della proliferazione cellulare di progenitori retinici con idrossiurea-afidicolina (HUA) inibisce la trascrizione di questi quattro fattori chiave del destino differenziativo, mentre non modifica l’espressione di altri fattori di trascrizione come Xrx1 e Xath5. La nostra idea è che la progressione del ciclo cellulare in progenitori retinici sia necessaria per la specificazione del destino cellulare, controllando in questo modo l’istogenesi retinica. Inoltre è stato notato che forzando la progressione del ciclo cellulare non si ha differenziamento di cellule bipolari in assenza di espressione di Xotx2 .Un modello interpretativo dei dati ottenuti prevedeva che la sovraespressione di un solo gene chiave del destino retinico potresse avere effetti più forti, o differenti, in assenza della progressione del ciclo cellulare piuttosto che in condizioni normali. Questo è esattamente ciò che è stato osservato colipotrasfettando
Xgadd45y con i tre attivatori trascrizionali Xotx2, Xotx5 e Xchx10. In questi esperimenti
ogni gene spinge fortemente il differenziamento verso uno specifico tipo cellulare: fotorecettori (Xotx2 e Xotx5) o cellule bipolari (Xchx10). Diversamente, gli effetti
prodotti dalla co-lipotrasfezione di Xgadd45y e Xbh1, che è un repressore trascrizionale, non differiscono di molto dall’effetto generato dalla semplice trasfezione con il solo Xbh1.
In questa tesi viene proposto che la specificazione del destino cellulare dei neuroni retinici sia regolata da fattori di trascrizione chiave di tipo homeobox e che la progressione del ciclo cellulare sia necessaria a supportare la loro trascrizione, regolando il loro “pattern” di espressione e il loro “timing” di attivazione.