T ABELLE SUPPLEMENTARI

(1)

T

ABELLE SUPPLEMENTARI

Dati originali dello screening compiuto tramite microarray sui miRNA annotati in X.tropicalis (vedi materiali e metodi e risultati)

Name st33/st42 log _ratio

St33-cyclopamine/ st42 log ratio

St42-HUA/st42

log ratio St33 sum of means SNR>4

U6-snRNA-2 0,07 0,17 0,09 5981250 Y U6-snRNA-1 -0,07 -0,17 -0,09 4854250 Y xtr-let-7c 1,88 0,05 3,11 2670750 Y xtr-miR-214 2,13 -0,14 3,79 2488000 Y xtr-miR-130b 1,62 -0,2 2,33 1604250 Y xtr-miR-124 -1,29 -2,91 -1,11 1401750 Y xtr-miR-129 1,97 -0,11 3,49 1168750 Y xtr-miR-184 1,69 -0,43 3,27 1063750 Y xtr-miR-130a 1,33 -0,34 0,7 920500 Y xtr-miR-155 1,97 -0,41 1,65 864750 Y xtr-miR-142-5p -0,22 1,03 0,8 804250 Y xtr-let-7e 1,92 -0,14 2,05 646500 Y xtr-miR-210 1,89 -0,3 1,61 581750 Y xtr-miR-23b 1,82 0,25 1,9 561000 Y xtr-miR-181b 1,48 -1,27 -0,26 475250 Y xtr-miR-222 1,05 -0,23 3,16 434250 Y xtr-miR-383 1,43 0,26 1,66 430750 Y xtr-miR-122 1,84 0,19 2,29 421750 Y xtr-miR-183 -2,07 -0,85 0,54 393000 Y

xtr-miR-202 1,84 0,29 Non espresso 382000 Y

xtr-miR-20a 0,07 1,03 1,64 285500 Y

xtr-miR-103 1,66 0,12 1,29 280000 Y

xtr-miR-125a 1,54 -1,03 Non espresso 262750 Y

xtr-miR-23a 1,28 -0,15 1,81 198500 Y xtr-miR-24a-24b 0,91 0,67 3,81 197250 Y xtr-let-7i 1,51 0,11 1,74 190000 Y xtr-miR-106-20a 0,55 0,32 1,95 184750 Y xtr-miR-20b -0,15 0,75 0,26 176750 Y xtr-miR-125b 1,28 -0,61 3,67 176000 Y

(2)

xtr-miR-130c -0,45 -0,17 Non espresso 175250 Y

xtr-miR-199a-199b 1,88 0,53 3,09 153750 Y

xtr-miR-204 -2,07 -2,12 0,08 142750 Y xtr-miR-133a-b-c-d 0,96 -0,05 2,89 142500 Y xtr-let-7a 1,03 -0,37 2,53 140000 Y xtr-miR-18a -0,22 -0,19 1,52 137750 Y xtr-miR-15a 1,56 0,5 0,34 129250 Y xtr-miR-27b 2,45 1,35 1,43 121250 Y

xtr-miR-200b 1,16 Non espresso 0,9 115750 Y

xtr-miR-34b 2,63 0,46 1,19 115500 Y xtr-miR-9a-9 -2,08 -0,76 -0,84 114500 Y xtr-miR-30b -1,46 -0,11 0,46 114500 Y xtr-miR-1a -3,41 -0,13 -6,98 114500 Y xtr-miR-17-5p -1,08 -0,03 1,01 109250 Y xtr-miR-182 -2,02 -2,95 1,83 107250 Y xtr-miR-22 2,18 -0,85 1,84 105500 Y xtr-let-7b 10,5 1,76 3,33 101750 Y xtr-miR-107 0,71 1,59 3 100250 Y xtr-miR-223 -0,71 0,83 1,66 98750 Y xtr-miR-451 -0,17 -2,42 0,52 96000 Y

xtr-miR-16a -1,73 -0,32 Non espresso 95750 Y

xtr-miR-92a 1,81 1,81 4,88 95750 Y

xtr-miR-363-3p -0,16 0,81 4,45 93000

xtr-miR-302 2,14 Non espresso Non espresso 91250

xtr-miR-16b -1,95 -0,69 Non espresso 89750

xtr-miR-9a*-9* -2,36 0,33 -0,68 89500

xtr-miR-148b 2,34 1,16 0,52 86000

xtr-miR-191 0,92 0,81 1,14 83250

xtr-miR-194 1,52 -3,57 0,77 82750

xtr-miR-18b -0,83 4 1,02 80750

xtr-miR-181a -3,21 -2,41 -5,35 80750

xtr-miR-15c 1,1 -0,17 Non espresso 80250

xtr-miR-138 0,59 0,27 2,14 80000

xtr-miR-27c -0,11 0,3 Non espresso 79000

xtr-miR-98 2,76 Non espresso 2,08 78750

(3)

xtr-miR-9b -2,11 0,19 Non espresso 73250

xtr-miR-30c -2,71 -0,56 -4,45 72500

xtr-miR-10a -2,45 0,91 1,43 71500

xtr-miR-135 -0,45 2,82 -0,07 67750

xtr-miR-17-3p 9,31 Non espresso 3,56 67000

xtr-miR-16c -1,94 -0,52 Non espresso 66000

xtr-miR-19a -0,74 0,6 -0,93 62500

xtr-miR-96 -2,97 -0,54 1,1 60750

xtr-miR-100 Non espresso -1,6 4,44 59750

xtr-miR-31 -0,34 Non espresso Non espresso 59500

xtr-miR-338 0,15 0,29 0,52 58750

xtr-miR-200a 0,63 Non espresso 4,28 58250

xtr-miR-15b -2,68 0,51 1,52 58000

xtr-miR-9b* -2,64 0,01 Non espresso 57500

xtr-miR-182* -3,15 -1,3 -0,41 57250

xtr-miR-150 -1,81 Non espresso 4,09 56750

xtr-miR-26 0,52 -0,16 2,51 56250

xtr-miR-192 Non espresso 0,51 Non espresso 56000

xtr-miR-181a* -0,91 -2,85 Non espresso 55000

xtr-miR-137 Non espresso Non espresso 2,18 54750

xtr-miR-30d -1,78 Non espresso 4,24 53500

xtr-miR-205a -0,2 Non espresso 3,75 53250

xtr-miR-22* -0,35 Non espresso Non espresso 52250

xtr-miR-143 -1,61 -0,94 0,7 51500

xtr-miR-29b 9,56 -3,43 0,78 51250

xtr-miR-34a 1,32 Non espresso -0,35 50750

xtr-miR-20a* -2,91 Non espresso Non espresso 49750

xtr-miR-208 -1,49 -0,45 Non espresso 49500

xtr-miR-221 -0,77 -3,03 3,7 48500

xtr-miR-25 -0,15 2,31 2,91 48250

xtr-miR-1b -0,02 1,46 Non espresso 47000

xtr-miR-30a-3p 0,1 Non espresso 3,09 46750

xtr-miR-30a-5p -3,37 -1,13 -2,22 46250

xtr-miR-425-5p -1,57 Non espresso Non espresso 45500

(4)

xtr-miR-99 0,16 -4,26 3,07 45000

xtr-miR-365 0,1 4,23 3,04 44750

xtr-miR-19b -2,7 0,38 -0,16 44250

xtr-miR-140 -1,91 Non espresso -0,31 44000

xtr-miR-29d -2,51 Non espresso Non espresso 44000

xtr-miR-101a -1,79 8,62 1,5 43750

xtr-miR-205b -2,71 Non espresso Non espresso 43250

xtr-miR-449 Non espresso 2,65 Non espresso 43250

xtr-miR-148a -1,63 Non espresso 1,01 43250

xtr-miR-10c -0,24 Non espresso 1,43 43000

xtr-miR-428 -1,49 16,26 Non espresso 40750

xtr-miR-132 5,05 -1,62 3,72 40750

xtr-miR-30e 3,21 -4,14 0,55 40750

xtr-miR-33b 7,46 Non espresso Non espresso 39750

xtr-miR-212 -1,01 -1,74 2,15 39000

xtr-miR-187 -2,2 -3,16 2,65 38500

xtr-miR-196b -3,99 -4,6 Non espresso 37250

xtr-let-7f -1,4 -3,27 0,93 37000

xtr-miR-10b -2,38 Non espresso 3,56 37000

xtr-miR-216 -1,24 -3,65 4,5 36500

xtr-let-7g -3,49 Non espresso 1,4 36250

xtr-miR-196a -2,24 -4,05 1,4 35750

xtr-miR-126* -1,49 -3,52 3,19 35500

xtr-miR-142-3p -1,83 -0,99 1,92 34500

xtr-miR-202* -2,2 Non espresso Non espresso 32500

xtr-miR-29a-29c -0,51 -2,56 2,56 31750

xtr-miR-33a -1,38 Non espresso -1,52 31500

(5)

B

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(10)

I

NDICE DELLE ILLUSTRAZIONI

● Fig. 1: Ciclo vitale di Xenopus laevis...11

● Fig. 2: Schema degli strati e dei tipi cellulari retinici...12

● Fig. 3: Occhio di X.laevis trasfettato con un vettore di espressione codificante RFP – proteina fluorescente rossa. Da F.Cremisi, dati non pubblicati...14

● Fig. 4: Multipotenza e ordine temporale nella genesi dei tipi cellulari retinici. G: cellula gangliare, H: orizzontale, A: amacrina, C: cono, R: bastoncello, B: bipolare, M: glia di Muller...15

● Fig. 5: Sommario dei fattori intrinseci coinvolti nello sviluppo retinico in M.musculus. Lo schema è in gran parte adattabile a X.laevisi, sebbene alcuni fattori abbiano una funzione differente (ad esempio otx2, che in Xenopus contribuisce a formare cellule bipolari e non fotorecettori)...20

● Fig. 6: Trascrizione e traduzione dei geni otx5b, vsx1 e otx2, implicati nel differenziamento verso fotorecettori (otx5b) e cellule bipolari (vsx1, otx2). Il segnale rosso corrisponde al mRNA rilevato per ibridazione in-situ, il verde alle proteine rilevate tramite anticorpi policlonali specifici. Si nota come la proteina compaia solo agli stadi corrispondenti alle ondate di differenziamento verso i suddetti tipi cellulari (illustrazioni in alto), mentre il mRNA è sempre presente, inizialmente in modo uniforme e in seguito limitatamente all'ONL (otx5b) e all'INL (vsx1, otx2)...23

● Fig. 7: Espressione della proteina in retine di X.laevis trattate con ciclopamina. Il segnale in rosso si riferisce all'espressione proteica rivelata tramite anticorpo specifico, mentre in blu si ha la colorazione nucleare con hoechst. Si nota come il trattamento con ciclopamina, che allunga il ciclo cellulare dei progenitori retinici, anticipi la de-repressione traduzionale di otx2 (che appare già a st. 35) e aumenti il numero di cellule otx2-positive...25

● Fig. 8: Schema della via di processamento dei microRNA...30

● Fig. 9: Morfologia esterna di embrioni di Xenopus Laevis a vari stadi...33

● Fig. 10: Schema molecolare di un nucleotide LNA. ...36

● Fig. 11: Schema della reazione di retro-trascrizione e PCR per miRNA. E' qui indicato il metodo utilizzato dai kit Qiagen e SBI sopra descritti...41

● Fig. 12: Schema del modello proposto per la regolazione dei geni chiave del destino differenziativo retinico da parte del ciclo cellulare. HUA: trattamento in IdrossiUrea-Afidicolina , CYC: trattamento con ciclopamina. I picchi indicano la fase S del ciclo, la linea rossa l'andamento della concentrazione di inibitore nel tempo. I gomitoli indicano la traduzione di proteine ad omeodominio...49

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● Fig. 15: Risultati del filtraggio sui dati ottenuti dallo screening: in scala dal rosso al verde il

rapporto logaritmico rispetto alla linea di base (wt42), dal bianco al blu l'intensità totale logaritmica, calcolata sulla base della somma dei valori medi di fluorescenza dei 4 replicati interni di ogni feature nell'array wt42/wt33. Sono indicati i 25 miRNA più espressi. Gli asterischi indicano i miRNA che hanno superato il primo filtraggio, mentre i 4 miRNA individuati a termine dell'analisi in silico sono indicati in grassetto. Mir-124 e mir-183 sono marcatori di sviluppo neurale (v.testo). U6snRNA1-2 sono stati utilizzati come calibratori per normalizzare i dati...53

● Fig. 16: risultati dello studio funzionale di perdita di funzione effettuato in vivo su embrioni

di X.laevis. In scala dal rosso al blu è indicata la percentuale media di ogni tipo cellulare sul totale delle cellule neurali lipofettate con GFP, utilizzata come tracciante della trasfezione dei decoys specifici per i singoli miRNA o per una miscela equimolare di mir-214, mir-129, mir-155 e mir-222 (mir-mix). La linea mir-ctr si riferisce alle percentuali osservate in seguito alla lipofezione di un mirna scrambled (a sequenza casuale) di controllo, privo di effetti sul differenziamento retinico...55

● Fig. 17: Ricerca di siti bersaglio dei 18 miRNA individuati dallo screening tramite

microarray. A: siti bersaglio individuati al primo passaggio (score>105, ΔG<18000), in B viene mostrata la sequenza relativa. C: seconda analisi condotta sui 4 miRNA scelti come candidati, sulla base della prima analisi e dello studio funzionale, per individuare con

maggiore permissività eventuali siti bersaglio, parametri: score>100, ΔG<15000...56

● Fig. 18: Schema dei siti bersaglio dei 4 miRNA individuati dallo screening sui 3'UTR dei

geni otx2 e vsx1. I numeri indicano la posizione del primo nucleotide della sequenza

bersaglio sul 3'UTR, a partire dall'estremità 5'. La sequenza dell'UTR è indicata in basso...57

● Fig.e 19: Esempio di grafico di melting incompatibile con l'amplificazione di una singola

specie. In ascissa le temperature, in ordinata la derivata seconda della fluorescenza assoluta dovuta all'intercalante SYBR green e proporzionale alla quantità di dsDNA (vedi metodi). 59

● Fig. 20: Schema di uno degli ampliconi risultanti dalla reazione di qRT-PCR. In giallo è

indicata la sequenza bersaglio da individuare, corrispondente al primer forward, in azzurro il linker poli-T, in verde la sequenza tag universale...61

● Fig. 21: Analisi dell'espressione dei miRNA candidati emersi dallo screening tramite

microarray attraverso RT-PCR quantitativa real-time. I dati sono forniti in termine di espressione logaritmica (log ratio) relativa rispetto al livello rilevato nei campioni di RNA estratti da embrioni wt a st.42. Le barre di errore indicano la S.E.M calcolata sui replicati interni di ogni campione. Gli asterischi indicano il risultato del T. test a due code e varianza singola eseguito su ogni colonna dell'istogramma. *=p<0,05, **=p<0.01, ***=p<0.001. Si noti come l'andamento rifletta quello indicato in fig.4. Mir-124 è mostrato come controllo, in quanto marcatore di sviluppo neurale...62

● Fig. 22: Ibridazione in situ su sezioni trasversali di occhi di X.laevis ottenute da animali a

st.33 e st.42. La seconda riga presenta il dettaglio della CMZ della foto immediatamente superiore. Le parentesi nella prima riga indicano la posizione della CMZ. In rosso compare l'espressione dei miRNA, in blu la contro-colorazione nucleare effettuata con hoechst. Si nota come per i quattro miRNA sotto studio l'espressione complessiva a st.33 sia nettamente maggiore di quella a st.42. Si nota anche come nelle retine sviluppate i quattro miRNA siano

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concentrati soprattutto nella CMZ con un gradiente più o meno netto verso il centro della retina. Mir-124 presenta un pattern del tutto complementare, sia a st.33 che a st.42...63

● Fig. 23: Immunoistochimica eseguita su sezioni trasversali di occhi a st.42 con anticorpi

policlonali contro otx2/vsx1. La seconda riga indica il dettaglio della CMZ della foto

immediatamente superiore. Si noti come le cellule bipolari esprimenti i due marcatori non si trovino mai all'interno della CMZ ...63

● Fig. 24: Ibridazione in situ su sezioni trasversali di occhi di X.laevis ottenute da animali a

st.42. La sonda utilizzata è formata da un oligonucleotide modificato LNA a sequenza casuale, e non è specifica per alcun miRNA noto. In rosso è indicato il segnale di

ibridazione, in blu la contro-colorazione nucleare ottenuta con hoechst...64

● Fig. 25: Schema della strategia utilizzata per l'analisi della specificità di legame dei miRNA

candidati sui geni otx2 e vsx1...67

● Fig. 26: Saggio di efficienza e curva di concentrazione della trasfezione di sensori/miRNA

cellule HeLa. In ascissa le miscele trasfettate (vedi tab.2), in ordinata il rapporto tra la fluorescenza verde GFP e quella rossa RFP (utilizzata cone calibratore). Gli asterischi si riferiscono al test T a singola coda e singola varianza: ***=p<0.001, *=p<0,05...70

● Fig. 27: Saggio di specificità per guadagno di funzione sul gene vsx1 in cellule HEK293. In

ascissa le miscele trasfettate (vedi tab.2), in ordinata il rapporto tra la fluorescenza verde GFP e quella rossa RFP (utilizzata cone calibratore). Gli asterischi si riferiscono al test T a singola coda e singola varianza: *=p<0,05, **=p<0.01...70

● Fig. 28: Saggio di specificità per guadagno di funzione sul gene vsx1 in cellule HEK293. In

ascissa le miscele trasfettate (vedi tab.2), in ordinata il rapporto tra la fluorescenza verde GFP e quella rossa RFP (utilizzata cone calibratore). Gli asterischi si riferiscono al test T a singola coda e singola varianza: *=p<0,05, **=p<0.01...71

● Fig. 29: Saggio di specificità per perdita di funzione sul gene vsx1 in cellule HEK293. In

ascissa le miscele trasfettate (vedi tab.2), in ordinata il rapporto tra la fluorescenza verde GFP e quella rossa RFP (utilizzata cone calibratore). Gli asterischi si riferiscono al test T a singola coda e singola varianza: =p<0,05, <=non rilevante...71

● Fig. 30: Saggio di specificità per guadagno (fig.17) e perdita (fig. 18) di funzione sul gene

otx2 in cellule HeLA. In ascissa le miscele trasfettate (vedi tab.2), in ordinata il rapporto tra la fluorescenza verde GFP e quella rossa RFP.. Gli asterischi si riferiscono al test T a singola coda e singola varianza: *=p<0,05, **=p<0.01, ***=p<0.001...72

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F

ORMULE DELLE SOLUZIONI CITATE MMR 10X

Soluzione fisiologica per il mantenimento degli embrioni. Soluzione da autoclavare prima dell’uso

pH 7.8

Diluizione d’uso (rispetto alla soluzione qui riportata) 1:100. (0,1 X)

NaCL 0,1 M KCl 2 mM MgSO4 1 mM CaCl2 2 mM HEPES phH 7.8 5 mM EDTA 0,1 mM PBS 10X

Soluzione fisiologica per il mantenimento delle sezioni pH 7,4

Soluzione da autoclavare prima dell’uso

Diluizione d’uso (rispetto alla soluzione qui riportata) 1:10. (1 X)

NaCl 8 g/l KCl 0,2 g/l Na2HPO4ּ16H2O 1,44 g/l KH2PO4 0,24 g/l Soluzione di de-gelificazione DTT 3,2 mM Tris-HCl pH 8.0 0,2 M

Tampone sodio-sodio citrato (SSC) 20X

Tampone di lavaggio per ibridazione di RNA

Soluzione da autoclavare o microfiltrare prima dell'uso Diluizione d'uso variabile da 1:4 (5X) a 1:100 (0,2X)

Na citrato 0,3 M

NaCl 3 M

Tampone Tris-EDTA (TE)

Soluzione lievemente basica di mantenimento per DNA, l'EDTA è un chelante di ioni divalenti positivi che agisce da inibitore delle nucleasi

pH 7,5

Tris-HCl pH 7,5 10 mM