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4.1.1 Attività ascorbato-ossidasica della GGT in sistemi acellulari 4.1 Ruolo della γ -glutamiltransferasi (GGT) nell’uptake cellulare dell’acido ascorbico 4. Risultati

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4. Risultati

4.1 Ruolo della γ-glutamiltransferasi (GGT) nell’uptake cellulare dell’acido ascorbico

4.1.1 Attività ascorbato-ossidasica della GGT in sistemi acellulari

L’attività ascorbato-ossidasica (AA-ossidasica) della GGT é stata inizialmente studiata in sistemi acellulari contenenti GGT purificata, glutatione (GSH) e glicil-glicina (Gly-Gly), accettore della reazione di transpeptidazione.

La Figura 4.1A mostra che l’ossidazione dell’AA è strettamente dipendente dalla presenza e dalla concentrazione di ioni ferro presenti nel mezzo di incubazione sottoforma di complessi di Fe3+ con ADP. L’aggiunta della GGT determina un aumento significativo (p < 0,001) dell’ossidazione dell’AA, pur rimanendo evidente una dipendenza dalla concentrazione di ferro presente nelle miscele di incubazione. In accordo con questi risultati, l’aggiunta di un forte chelante del ferro come la deferossamina mesilato è in grado di prevenire completamente l’ossidazione dell’AA, sia in presenza che in assenza di GGT (Figura 4.1B). L’aggiunte nel mezzo di incubazione del complesso serina/acido borico (SEB), inibitore competitivo della GGT, inibisce completamente l’idrolisi del GSH e riporta l’ossidazione dell’AA ai livelli del controllo (Figura 4.2 A e B).

Come mostrato in Tabella 4.1, l’ossidazione dell’AA viene significativamente inibita (p< 0,001) in presenza di sistemi antiossidanti come la superossido dismutasi (SOD), la catalasi (CAT) o una miscela dei due enzimi. L’aggiunta di mannitolo, uno

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scavenger del radicale ossidrile, non determina alcuna variazione nell’ossidazione

dell’AA, escludendo un ruolo di tale radicale nell’ossidazione dell’AA.

La possibilità che gli ioni ferro necessari per l’azione proossidante della GGT possano essere forniti da sorgenti fisiologiche di ferro è stata indagata utilizzando olo-transferrina umana o ferritina nelle miscele di incubazione. I risultati ottenuti mostrano che la GGT è in grado di promuovere l’ossidazione dell’AA sia in presenza di olo-transferrina (Figura 4.3A) che in presenza di ferritina (Figura 4.3B).

Globalmente i risultati ottenuti sembrano indicare che l’attività della GGT promuova l’ossidazione dell’AA mediante la formazione di specie reattive dell’ossigeno generate in presenza di metalli di transizione.

Poichè, come illustrato nella Introduzione, la cisteinil-glicina (Cys-Gly), prodotto dell’idrolisi del GSH mediata dalla GGT, é il principale responsabile dell’effetto pro-ossidante di questo enzima, abbiamo condotto esperimenti sostituendo la GGT con il suo prodotto, la Cys-Gly. I risultati ottenuti hanno messo in evidenza che la Cys-Gly è in grado di promuovere l’ossidazione dell’AA in modo del tutto simile a quanto osservato in presenza di GSH e GGT (p < 0,001) (Figura 4.4).

4.1.2 Effetto dell’attività proossidante della GGT sull’uptake di AA in cellule di melanoma

Studio su cloni cellulari con diversa attività di GGT

Sono state utilizzate due linee di cellule di melanoma umano, derivanti dalla stessa metastasi sottocutanea, ma con diversa attività di GGT: il clone Me665/2/60 (“clone

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60”) che presenta un’attività di GGT di circa 26 mU/mg di proteina e il clone Me665/2/21 (“clone 21”) che mostra un’attività di circa 0,2 mU/mg di proteina. Gli esperimenti condotti mostrano che la stimolazione dell’attività di GGT nel clone 60 determina, insieme con un forte aumento dell’idrolisi del GSH (Figura 4.5A), una significativa ossidazione dell’AA extracellulare (p < 0,001) (Figura 4.5B).

L’analisi della concentrazione intracellulare di AA, effettuata dopo 120 minuti di incubazione, mostra livelli di vitamina C nettamente più alti nelle cellule in cui l’attività di GGT è stata stimolata rispetto ai controlli non stimolati (p < 0,001). Questo effetto viene completamente prevenuto in presenza dell’inibitore non competitivo della GGT acivicina (AT125) (Figura 4.5C).

In analogia con quanto osservato nei sistemi acellulari, l’ossidazione dell’AA extracellulare è dipendente dalla presenza di ferro nel mezzo di incubazione ed è inibita dalla deferossamina mesilato. In assenza di ferro, anche l’aumento dei livelli intracellulari di vitamina C viene prevenuto (Tabella 4.2).

Contrariamente a quanto osservato per il clone 60, la stimolazione dell’attività di GGT nel clone 21 non determina variazioni significative del GSH extracellulare (Figura 4.6A) ed è possibile osservare solo minime variazioni relativamente all’ossidazione dell’AA extracellulare (Figura 4.6B) ed ai livelli di vitamina C intracellulari (Figura 4.6C).

Effetto dell’espressione della GGT sull’uptake dell’AA

Per meglio caratterizzare la relazione esistente tra l’attività di GGT e l’ossidazione dell’AA extracellulare, il clone 21 è stato transfettato transientemente con un vettore

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contenente il cDNA della GGT umana. La Figura 4.7 riporta i risultati ottenuti stimolando l’attività di GGT nei due subcloni così ottenuti, l’uno con alta attività di GGT (30 mU/mg di proteina) l’altro, il controllo (“sham-transfected”), con un’attività simile a quella del clone 21 (0,2 mU/mg di proteina). La transfezione conferisce al clone 21 la capacità di idrolizzare il GSH (Figura 4.7A) e di ossidare l’AA extracellulare (Figura 4.7B). Anche in questo caso, la stimolazione dell’attività dell’enzima nel subclone con alta attività di GGT determina un aumento significativo dei livelli intracellulari di vitamina C (p < 0,001) (Figura 4.7C).

Sistemi di trasporto coinvolti nell’uptake dell’AA mediato dalla GGT

I risultati ottenuti hanno messo in evidenza che l’ossidazione dell’AA extracellulare determinata dall’attività di GGT è accompagnata da un aumento dei livelli intracellulari di vitamina C. La vitamina C viene trasportata all’interno delle cellule mediante due distinti meccanismi: uno, sodio-dipendente, coinvolto nel trasporto dell’AA e l’altro, dipendente dai GLUT (trasportatori del glucosio), coinvolto nel trasporto facilitato del deidroascorbato (DHA), prodotto dell’ossidazione dell’AA (vedi Introduzione).

La stimolazione dell’attività di GGT in mezzi di incubazione poveri di sodio non comporta differenze significative né per quanto riguarda l’ossidazione dell’AA extracellulare né relativamente ai livelli intracellulari di vitamina C nel clone 60 (Tabella 4.3), escludendo pertanto il coinvolgimento dei meccansimi sodio-dipendenti.

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Al contrario, quando gli esperimenti venivano condotti in presenza di alte concentrazioni (5 g/l) di glucosio (inibitore competitivo del trasporto GLUT-mediato) si osservava una significativa diminuzione dei livelli intracellulari di AA sia prima che dopo la stimolazione della GGT, pur rimanendo non modificata l’ossidazione extracellulare di AA (Figura 4.8C e D). L’effetto é ancora più marcato in presenza di citocalasina B (inibitore non competitivo del trasporto GLUT-mediato) (Figura 4.8E e F).

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4.2 La traslocazione nucleare della GSTO1 come marker di progressione tumorale nell’Esofago di Barrett

4.2.1 Soggetti utilizzati nello studio

Lo studio é stato condotto in collaborazione con l’UO di Grastroenterolgia dell’AOUP.

Sono stati esaminati 46 pazienti, 33 uomini e 12 donne, con un’età media di 62,8 (+/-14). Di questi 44 presentavano Esofago di Barrett (EB), mentre 2 mostravano un adenocarcinoma conclamato. Tra i pazienti con EB, 22/44 non mostravano displasia, 7/44 mostravano diplasia di basso grado (DBG), 9/44 displasia di alto grado (DAG). Su 6/44 non é stato possibile fare diagnosi certa di displasia e pertanto sono stati classificati come "indeterminati per la displasia".

4.2.2 Caratterizzazione dell’anticorpo

La specificità dell’anticorpo contro la GSTO1 ricombinante é stata valutata tramite Immunoblotting utilizzando campioni di utero e testicolo umani. E’ noto infatti che nell’utero viene espressa prevalentemente la GSTO1, mentre nel testicolo quasi esclusivamente la GSTO2 (Board et al., 2000).

Come si vede nella Figura 4.9A, nel campione di utero si osserva un’intensa banda immunoreattiva con un peso molecolare intorno a 31KDa, corrispondente a quello della proteina purificata, mentre nel testicolo si osserva solo una tenue banda. Questo

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dato dimostra pertanto una leggera cross-reattività del nostro anticorpo anti-GSTO1 con la proteina GSTO2, confermando i dati ottenuti da E.M. Schmuck et al. (2005). Sempre in Figura 4.9B si osserva che l’anticorpo anti-GSTO1 rivela una banda di 31

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4.2.3 Indagine immunoistochimica su biopsie

In tutti i preparati l’anticorpo diretto contro la GSTO1 evidenzia una immunoreattività più intensa nelle cellule epiteliali ed una molto sfumata nelle strutture mesenchimali. L’intensità della colorazione non risulta significativamente diversa nei vari gradi della patologia. Al contrario la distribuzione della colorazione all’interno delle cellule epiteliali appare diversa nei vari livelli di progressione della patologia.

Nei 22 casi senza displasia, 13 mostravano localizzazione citoplasmatica, 5 colorazione diffusa e solo 4 prevalente colorazione nucleare (Figura 4.10 A).

Al contrario tutti i casi con chiara displasia, sia di basso grado (7 casi) (Figura 4.10 B) sia di alto grado (9 casi) (Figura 4.10 C), mostravano una localizzazione prevalentemente nucleare della GSTO.

La prevalenza della localizzazione nucleare tra i casi senza displasia e quelli con diplasia é significativamente diversa (p< 0,0001).

Dei 6 casi non definiti per la displasia, 2 mostravano colorazione nucleare, 2 citosolica e 2 diffusa.

Dei 2 casi di adenocarcinoma, uno mostrava prevalente localizzazione nucleare, mentre l’altro mostrava prevalente localizzazione nucleare nelle aree più differenziate e diffusa in quelle meno differenziate.

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4.2.4 Analisi RT-PCR su biopsia

L’indagine immunoistochimica per la localizzazione della GSTO a livello della mucosa metaplastica di Barrett è stata effettuata con un anticorpo prodotto nel nostro laboratorio tramite immunizzazione di conigli New Zealand con la GSTO1 umana ricombinante. Data l’omologia di struttura, l’anticorpo mostra una leggera interazione anche con la GSTO2, forma che però é particolarmente espressa solo a livello del testicolo.

L’esame con RT-PCR di un frammento di biopsia ha confermato che la GSTO1 é la forma prevalentemente espressa nella mucosa di Barrett (Figura 4.11).

4.2.5 Trattamento con shock termico di cellule umane

Al fine di verificare se anche la GSTO1 delle cellule umane conserva le caratteristiche di “shock protein” evidenziate nell’omologa proteina del topo, abbiamo condotto esperimenti di shock termico su cellule HeLa, sottoponendole alla temperatura di 44°C per vari tempi. La traslocazione nucleare della GSTO1, evidenziata tramite Immunoblotting (Figura 4.12C) inizia alla fine della prima ora di incubazione e raggiunge un massimo alla terza ora. La traslocazione nucleare della GSTO1 é stata confermata anche tramite esperimenti di immunofluorescenza. La Figura 4.12A mostra l’immagine negativa dei nuclei nelle cellule controllo e la prevalente localizzazione nucleare dopo shock termico (Figura 4.12A).

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4.3 Meccanismi di espressione delle GSTO in linee cellulari umane

4.3.1 Ruolo del TNF-α nell’espressione delle GSTO

4.3.1.1 Risultati dell’analisi tramite Immunoblotting

Il ruolo del TNF-α è stato studiato sulla linea cellulare di melanoma umano Me665/2/21.

Sono stati effettuati esperimenti preliminari al fine di determinare la densità cellulare e la concentrazione di TNF-α ottimali. Come si può osservare in Figura 4.13, il trattamento con TNF-α in cellule seminate alla densità di 4,8x103 cellule/cm2 causa un aumento della banda immunoreattiva relativa alla GSTO che è già massimo alla dose di 10 ng/ml.

Seminando 9,6x103 cellule/cm2 (Figura 4.14) la quantità della GSTO è notevole in tutti i campioni ed è imputabile all’effetto della densità cellulare come verrà descritto successivamente. In tali condizioni non si osservano differenze tra cellule controllo e cellule trattate con TNF-α.

Nelle Figure 4.15 e 4.16 è riportata l’analisi densitometrica effettuata sulle bande immunoreattive di 2 esperimenti analoghi a quelli riportati nelle Figure 4.13 e 4.14 rispettivamente . I valori sono stati corretti tramite rapporto con l’actina.

Come mostrato in Figura 4.15 il maggior aumento dell’espressione della GSTO si ha con 10 ng/ml di TNF-α. A tale dose l’intensità relativa della banda immunoreattiva aumenta di circa 4 volte rispetto al campione controllo.

La Figura 4.16 conferma i dati osservati nella Figura 4.14: la densità ottica relativa della banda della GSTO è in condizioni basali è superiore rispetto a quella che si

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osserva seminando le cellule alla densità di 4,8x103cellule/cm2. Il trattamento con TNF-α non apporta ulteriori aumenti a nessuna delle dosi usate.

/cm2. Il trattamento con TNF-α non apporta ulteriori aumenti a nessuna delle dosi usate.

Sulla base di questi risultati preliminari i successivi esperimenti sono stati condotti seminando 4,8x103/cm2e trattando con TNF-α alla dose di 10 ng/ml per 16 ore. Sulla base di questi risultati preliminari i successivi esperimenti sono stati condotti seminando 4,8x103/cm2e trattando con TNF-α alla dose di 10 ng/ml per 16 ore. In Figura 4.17 è possibile osservare il risultato di un tipico esperimento di induzione della GSTO operato dal TNF-α. Nella Figura 4.18 è riportata la media ± S.D. dell’analisi densitometrica delle bande immunoreattive di 4 esperimenti analoghi a quello riportato in Figura 4.17.

In Figura 4.17 è possibile osservare il risultato di un tipico esperimento di induzione della GSTO operato dal TNF-α. Nella Figura 4.18 è riportata la media ± S.D. dell’analisi densitometrica delle bande immunoreattive di 4 esperimenti analoghi a quello riportato in Figura 4.17.

4.3.1.2 Risultati dell’analisi tramite RT-PCR 4.3.1.2 Risultati dell’analisi tramite RT-PCR

Poiché, come riportato nella sezione 4.2.2, l’attuale anticorpo nei confronti della GSTO1 riconosce, sia pur debolmente, anche la GSTO2, non è possibile discriminare quale forma sia interessata nell’aumento dell’espressione evidenziato tramite Immunoblotting.

Per identificare se l’aumento della banda immunoreattiva sia ascrivibile alla GSTO1 o alla GSTO2 è stata effettuata l’RT-PCR con due coppie di primer specifici per le due forme. Ovviamente tale metodo non può valutare eventuali effetti sulla sintesi e sul turnover proteico che potrebbero in parte rendere ragione dell’aumento quantitativo delle GSTO osservata.

In Figura 4.19 possiamo osservare l’elettroforesi su gel d’agarosio dei prodotti dell’RT-PCR che indica che il trattamento con il TNF-α induce l’aumento dell’mRNA della GSTO1 mentre quello della GSTO2 rimane invariato.

Nella Figura 4.20 è riportata la media dell’analisi densitometrica delle bande relative agli mRNA delle due forme della GSTO ottenute da 2 esperimenti analoghi a quello

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riportato in Figura 4.19 .Tale analisi mostra un aumento di circa 3 volte dell’mRNA relativo alla GSTO1, mentre quello relativo alla GSTO2 rimane invariato.

4.3.1.3 Attivazione trascrizionale di NFKb valutata tramite Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).

L’EMSA, effettuato sul nucleosol delle cellule di melanoma umano del clone 21 trattate con TNF-α, mostra che l’attivazione di NFkB è già evidente dopo 15 min di trattamento (Figura 4.21, corsia 2) e aumenta ulteriormente dopo 1 ora (Figura 4.21, corsia 3).

4.3.1.4 Risultati del pretrattamento con partenolide sull’attivazione di NFKb e sulla espressione di GSTO1

Come noto dai dati in letteratura (Delhalle et al., 2004) il partenolide inibisce l’attivazione di NFkB. In Figura 4.22 si può osservare che il pretrattamento con partenolide alla concentrazione di 5μM per 2 ore inibisce l’attivazione di NFkB (valutato tramite EMSA) operata dal successivo trattamento con il TNF-α alla dose di 10 ng/ml per 1 ora, confermando così i dati della letteratura.

La Figura 4.23 mostra i risultati del pretrattamento con partenolide sulla sovraespressione della GSTO indotta dal TNF-α, valutata mediante Immunoblotting. Il pretrattamento con partenolide abolisce completamente l’incremento quantitativo della GSTO prodotto dal trattamento con TNF-α.

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4.3.2 Effetto dell’aumento della densità cellulare sulla espressione della GSTO

4.3.2.1 Effetto dell’aumento della densità cellulare nel tempo

Risultati dell’analisi tramite Immunoblotting

Lo studio é stato condotto inizialmente sul clone Me665/2/21 (clone 21). La Figura 4.24 mostra come l’aumento della densità cellulare nel tempo si accompagni a livelli di GSTO progressivamente crescenti.

Nella Figura 4.25 è riportata la media dell’analisi densitometrica delle bande immunoreattive ottenute in 2 esperimenti analoghi a quello riportato in Figura 4.24. Come si può vedere dopo 72 ore di incubazione si osserva un aumento della densità ottica relativa della GSTO di circa 3 volte che si mantiene pressoché inalterato alle 96 ore.

Il risultato é stato confermato anche su altre linee cellulari (Me665/2/60 e HeLa), come mostrato in Figura 4.26.

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Risultati dell’analisi tramite RT-PCR

Per verificare se l’aumento della banda immunoreattiva della GSTO osservato nei precedenti esperimenti (Figura 4.24) fosse ascrivibile alla GSTO1 o alla GSTO2, è stata effettuata l’RT-PCR con due coppie di primer specifici.

In Figura 4.27 possiamo osservare i risultati dell’elettroforesi su gel d’agarosio dei prodotti dell’RT-PCR effettuata sul clone 21. Si osserva un chiaro incremento del mRNA di entrambe le forme, anche se risulta maggiore quello a carico di GSTO1.

4.3.2.2 Effetto della semina a diverse densità

Risultati dell’analisi tramite Immunoblotting

Al fine di accertare che l’effetto osservato sia conseguenza dell’aumentata densità cellulare e non del tempo di incubazione, l’esperimento è stato ripetuto seminando le cellule del clone 21 a diversa densità (4,8x103cellule/cm2 e 38,4x103cellule/cm2) e raccogliendo i campioni dopo lo stesso tempo di incubazione (24 ore).

Il risultato, mostrato in Figura 4.28, evidenzia chiaramente che la sovraespressione della GSTO è dovuta all’aumento della densità cellulare e non al tempo di incubazione.

Risultati analoghi sono stati osservati anche con le linee Me665/2/60 e HeLa (Figura 4.29).

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Risultati dell’analisi tramite RT-PCR

In Figura 4.30 possiamo osservare i risultati dell’elettroforesi su gel d’agarosio dei prodotti dell’RT-PCR effettuata sul clone 21 che indica come l’incremento riguardi lo mRNA di entrambe le forme, anche se in maggior misura quello della GSTO1.

4.3.2.3 Effetto della densità cellulare sulla espressione delle GSTO in linee cellulari umane in sospensione

L’effetto della densità cellulare sulla espressione delle GSTO é stato indagato su alcune linee cellulari la cui modalità di crescita è in sospensione: le U937, le Jurkat e le Kg1A. Tale modello sperimentale ci rende possibile valutare l’effetto sulla espressione delle GSTO legato al solo aumento della densità cellulare e non al contatto cellula-cellula e/o cellula-substrato.

Analogamente a quanto fatto con le precedenti linee cellulari che crescono aderenti al substrato, le U937, le Kg1A e le Jurkat sono state seminate ad una densità pari a 4,8x103 cellule/cm2 e raccolte a 24 e 96 ore dalla semina. In altri esperimenti le cellule sono state seminate alla densità di 4,8x103 e di 38,4x103 cellule/ cm2 e raccolte dopo 24 ore.

Come si può osservare in Figura 4.31 e in Figura 4.32, la sovraespressione delle GSTO (valutata in base all’Immunoblotting) al crescere della densità cellulare si osserva anche in linee cellulari che crescono in sospensione ed é quindi indipendente dall’adesione al substrato e dalle connessioni cellula-cellula.

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4.3.2.4 Ruolo del ciclo cellulare nella modulazione dell’espressione delle GSTO da parte della densità cellulare

E’ stata valutata l’ipotesi di una relazione tra l’aumento della densità cellulare, l’aumento dell’espressione delle GSTO e il ciclo cellulare: in particolare si é voluto verificare se la sovraespressione delle GSTO coincidesse con uno spostamento delle cellule verso la fase G0/G1 al crescere della densità cellulare.

Gli esperimenti sono stati condotti sulla linea cellulare Me665/2/21. La distribuzione delle cellule nelle varie fasi del ciclo cellulare é stata valutata tramite FACS con trattamento delle cellule con ioduro di propidio.

La Tabella 4.33 mostra che all’aumentare della densità cellulare, nell’ambito delle nostre condizioni sperimentali, non si osservano variazioni significative nella distribuzione delle cellule nelle varie fasi del ciclo.

4.3.2.5 Ruolo dell’ ipossia nella modulazione dell’espressione delle GSTO da parte della densità cellulare

E’ stato descritto in letteratura il fenomeno dell’ipossia pericellulare nelle colture cellulari, ossia una ipossia locale che si viene a creare tra cellule adiacenti all’aumentare della densità cellulare in condizioni di coltura in normossia (Tokuda et

al., 2000). Questa ipossia pericellulare é in grado di promuovere fenomeni di

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Per mimare l’ipossia abbiamo utilizzato il cobalto cloruro (CoCl2), una sostanza che competendo con il Fe2+ per il legame al sensore di O2, riproduce uno stato simile a quello dell’ipossia cronica pur in presenza di livelli normali di O2,

La Figura 4.34 mostra che il trattamento di cellule a bassa densità con varie dosi di CoCl2 non é in grado di indurre l’espressione delle GSTO.

L’eventuale ruolo dell’ipossia pericellulare é stato ulteriormente valutato mantenendo cellule a alta densità in agitazione per 24 ore: questo trattamento, che impedisce il formarsi di un’ipossia pericellulare, non evita la sovraespressione delle GSTO densità-dipendente (Figura 4.35).

4.3.2.6 Ruolo di fattori diffusibile nella modulazione dell’espressione delle GSTO da parte della densità cellulare

Sono stati allestiti esperimenti con l’uso di piastre da co-coltura in cui abbiamo seminato le stesse cellule ma a due densità diverse (alta e bassa) in due distinti settori separati da una membrana millipore. Lo scopo era quello di valutare se le cellule ad alta densità producessero un fattore diffusibile, in grado di indurre l’espressione delle GSTO nelle cellule a bassa densità. Il risultato negativo dell’esperimento (Figura 4.36) non depone a favore della presenza di un fattore diffusibile. Non si può escludere tuttavia che il fenomeno sia dovuto a fattori molto labili che possa agire solo quando le cellule sono a stretto contatto come nell’alta densità.

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4.3.2.7 Ruolo delle specie attive dell’ossigeno (ROS) nell’espressione delle GSTO da parte della densità cellulare

Poiché gli esperimenti descritti nella precedente sezione non possono escludere il ruolo di fattori diffusibili molto labili, abbiamo voluto valutare l’eventuale ruolo di specie attive dell’ossigeno (ROS) nella sovraespressione delle GSTO. Data l’emivita estremamente breve dei ROS, un loro effetto verisimilmente si può esplicare solo quando le cellule sono a stretto contatto, come nell’alta densità. Abbiamo pertanto deciso di valutare l’effetto di sistemi antiossidanti sull’espressione densità-dipendente delle GSTO. Attualmente sono stati condotti esperimenti preliminari utilizzando la superossido dismutasi come sistema antiossidante. Come si può vedere in Figura 4.37, il trattamento di cellule ad alta densità con SOD blocca la sovraespressione densità dipendente delle GSTO, riportando l’espressione ai valori nelle colture a bassa densità.

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