Riassunto
Riassunto
Studi condotti sulle proprietà molecolari del virus dell’immunodeficienza felina (FIV) e sulla storia naturale dell’infezione nel suo ospite, il gatto domestico, rappresentano un buon modello per chiarire i meccanismi patogenetici indotti dal virus dell’immunodeficienza umana (HIV) e sviluppare approcci terapeutici e vaccinali per la cura della sindrome da immunodeficienza acquisita.
Recentemente, tra le diverse strategie vaccinali sperimentate, particolarmente promettenti si sono dimostrati i vaccini attenuati costituiti da virus deleti di uno o più geni virali non essenziali alla replicazione ma importanti per patogenicità. In FIV, il gene accessorio ORF-A è essenziale per la replicazione del virus nei linfociti. Al contrario, FIV mantiene la capacità replicativa nei macrofagi anche dopo delezione di questo gene. Cloni molecolari FIV deleti in ORF-A e inoculati in vivo hanno dimostrato ridotta patogenicità e, quando sperimentati come vaccini, hanno conferito protezione parziale dalla sfida con un ceppo FIV virulento. Allo scopo di migliorarne le proprietà vaccinali sono state progettate delle modificazioni genomiche per potenziare l’immunogenicità dei cloni molecolari deleti in ORF-A.
La tesi ha come scopo la produzione di cloni molecolari FIV deleti in ORF-A e contenenti mutazioni nel gene env, codificante per le glicoproteine virali di superficie. Durante la fase replicativa virale le proteine Env dei lentivirus sono esposte sulla superficie della cellula infetta da dove, mediante endocitosi, vengono in parte convogliate in vescicole citoplasmatiche e degradate. E’ stato quindi ipotizzato che un blocco a livello dell’endocitosi potrebbe consentire una maggiore espressione di Env sulla superficie delle cellule infette e sui virioni maturi, aumentando l’immunogenicità dei mutanti ORF-A.
I
Riassunto
L’endocitosi avviene grazie alla presenza di una sequenza segnale localizzata nella porzione intracitoplasmatica di Env, conservata tra tutti i lentivirus e contenente, tra gli altri, gli aminoacidi glicina e tirosina. Per verificare quest’ipotesi abbiamo utilizzato due cloni molecolari: Δ00, contenente il gene ORF-A funzionale, e Δ23 esprimente una proteina ORF-A tronca. Entrambi i cloni Δ00 e Δ23 sono stati mutati nella sequenza-segnale per l’endocitosi di Env; una mutazione consiste nella delezione dei codoni che codificano per gli aminoacidi glicina e tirosina, l’altra consiste nella loro sostituzione rispettivamente con alanina ed isoleucina. In questo modo abbiamo ottenuto quattro cloni molecolari replicazione-competenti: Δ00XX (doppia delezione), Δ00AI (con alanina ed isoleucina), Δ23XX e Δ23AI. Su questi cloni e sui ceppi di controllo con env non modificato abbiamo valutato dinamica del processo di endocitosi e localizzazione della glicoproteina Env nelle cellule infette rispetto ai cloni di controllo.
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