temporalmente e risultano indispensabili per la corretta formazione delle strutture

5. DISCUSSIONE

Numerose evidenze sperimentali hanno messo in luce il coinvolgimento di alcune famiglie di geni codificanti fattori di trascrizione, fra cui soprattutto gli omeogeni, nella regolazione della differenziazione ematopoietica. (Magli et al., 1997; Magli, 1998). Nel nostro laboratorio abbiamo concentrato l’attenzione su Otx1, membro con Otx2, Otx3 e Crx della famiglia dei geni Otx, omologhi a Orthodenticle di Drosophila, che codificano fattori di trascrizione contenenti un omeodominio di

tipo bicoid. Questi geni durante lo sviluppo vengono regolati sia spazialmente che

temporalmente e risultano indispensabili per la corretta formazione delle strutture

cefaliche e di alcuni organi di senso. In particolare Otx1 sembra essere implicato

nella corticogenesi murina, essendo espresso a partire dallo stadio E8 a livello del

neuroectoderma rostrale, nello sviluppo degli organi di senso acustico e visivo e

della porzione anteriore della ghiandola pituitaria. Studi effettuati nel laboratorio

dove ho svolto il mio lavoro di tesi hanno mostrato l’espressione di questo

omeogene nei vari organi ematopoietici ed è stata evidenziata la sua attività

trascrizionale nel fegato fetale allo stadio E12, nel midollo osseo e nella milza

dell’adulto. Un’analisi più dettagliata di sottopopolazioni ematopoietiche ha

rivelato che Otx1, in particolare, è espresso in precursori pluripotenti, nei

progenitori eritroidi precoci (BFU-E) e tardivi (CFU-E) e, a livelli più bassi, in

eritrociti e megacariociti maturi (Levantini et al., 2003). Molte indicazioni sul

ruolo che Otx1 svolge nella produzione delle cellule del sangue sono state ricavate

dallo studio di una linea di topi in cui questo gene è stato funzionalmente

inattivato tramite ricombinazione omologa. Questi mutanti presentano una serie di

difetti a carico di diversi organi: si riscontra uno sviluppo anomalo della cortex

telencefalica dorsale, del mesencefalo e del cervelletto oltre a malformazioni a carico degli organi di senso, quali diminuzione dell’iride, assenza della ghiandola lacrimale e del processo ciliare nell’occhio, completa assenza del canale semicircolare laterale e dell’ampolla nell’orecchio interno (Acampora et al., 1996). Durante i primi quattro mesi di vita si osservano anche marcati squilibri nei livelli fisiologici di alcuni ormoni pituitari come GH, FSH, LH, che provocano una diminuzione della taglia, del peso corporeo e delle dimensioni di alcuni organi quali gonadi, milza e reni. Tuttavia, intorno ai quattro mesi d’età si ha un graduale recupero di tali anomalie, ad eccezione di quelle a carico delle ovaie che, assieme a quelle del sistema nervoso centrale e degli organi di senso, risultano permanenti (Acampora et al., 1998b). Nel nostro laboratorio abbiamo dimostrato che i topi Otx1

sono caratterizzati, in ambito ematopoietico, da un fenotipo anemico trapiantabile, non riconducibile a difetti del microambiente midollare, ma piuttosto ad anomalie intrinseche alle stesse cellule ematopoietiche. Inoltre a livello molecolare, abbiamo riscontrato un forte calo dell’espressione di Scl/Tal1, un gene essenziale alla differenziazione eritroide il cui pattern di espressione ricorda quello di Otx1. Infine, esperimenti di rescue funzionale in vivo hanno mostrato che l’overespressione di Scl è in grado di recuperare il fenotipo ematopoietico dei topi Otx1

individuando Scl quale target di Otx1 nell’eritropoiesi (Levantini et al., 2003).

Il mio lavoro di tesi si è quindi inserito in questo progetto di ricerca ed è stato

diretto a comprendere se Otx1 possa essere coinvolto nella differenziazione di

altri lineages emopoietici oltre a quello eritroide. Il mio studio, in particolare,

prende le mosse dall’osservazione, ottenuta ad un’analisi più approfondita del

pattern di espressione di Otx1 in ambito ematopoietico, che questo gene è attivo

trascrizionalmente non solo nei progenitori eritroidi e megacariocitari (CFU- EMeg), ma anche in quelli del lineage mielo-monocitario (CFU-GM), (Levantini et al., 2003).

Tenendo conto di questo, la prima domanda che mi sono posta è quale ruolo Otx1 possa avere nella regolazione delle cellule mielo-monocitarie. Un approccio sperimentale per comprendere la funzione di un gene è quello di studiare gli effetti della sua inattivazione e il confronto dei precursori mielo-monocitari di topi wild type e Otx1

attraverso saggi clonogenici ha messo in luce due diverse alterazioni. Una riguarda il numero totale dei precursori mieloidi (CFU-GM + CFU-G + CFU-M), che subisce una lieve ma significativa diminuzione rispetto ai wild type nei topi Otx1

di 1 mese (Fig.4.1a), tuttavia tale alterazione risulta transiente dal momento che nei topi a sette mesi non ho osservato differenze fra wild type e mutanti nulli (Fig.4.1b).

La seconda anomalia riscontrata nella mielopoiesi dei topi Otx1

riguarda le singole sottopopolazioni di precursori che mostrano uno squilibrio rispetto alla controparte normale (Fig.4.2). L’assenza di Otx1 induce uno sbilanciamento nel lineage mielo-monocitario che sembra favorire la differenziazione granulocitaria a

discapito di quella macrofagica e tale alterazione, a differenza della precedente, permane anche nei topi adulti, fornendo un supporto all’ipotesi che Otx1 intervenga anche nel controllo del lineage mielo-monocitario.

La successiva questione affrontata in questo studio riguarda la comprensione dei

meccanismi attraverso i quali il gene Otx1 regola la differenziazione mielo-

monocitaria. In primo luogo ho considerato Scl quale possibile target di Otx1. La

mia scelta si è indirizzata su questo gene per diversi motivi: 1) Il gene Scl è uno

dei regolatori che agiscono molto precocemente nella specificazione delle HSCs;

2) E’ fondamentale nella differenziazione ematopoietica dove sembra agire a più livelli della gerarchia, è infatti espresso ad alti livelli negli eritrociti e nei megacariociti e a livelli più bassi nei monociti e nei neutrofili; 3) Codifica un fattore di trascrizione di tipo basic helix-loop-helix che contiene nel proprio promotore una sequenza bicoid che viene legata da Otx1; 4) La sua espressione è de-regolata in assenza di Otx1; 5) La sua overespressione recupera il difetto eritroide determinato dalla perdita di funzione di Otx1 indicando che Scl è coinvolto nella cascata trascrizionale di Otx1 (Levantini et al., 2003).

Alla luce di tutte queste considerazioni ho valutato la possibilità che Otx1 interagisse con Scl anche nel determinare il commitment dei lineages mielo- monocitari. Per verificare tale ipotesi ho adottato la strategia del gain of function, utilizzando una linea di topi trangenici knock-out per Otx1 ed overesprimenti Scl.

L’analisi comparativa del midollo osseo di questi doppi mutanti, di topi wild type e Otx1

condotta attraverso saggi clonogenici ha rivelato che l’espressione costitutiva di Scl non recupera del tutto lo sbilanciamento a carico del lineage mielo-monocitario osservato nei knock-outs (Fig.4.3). Questi risultati sono in accordo col fatto che Scl riveste un ruolo di gran lunga meno rilevante nell’ambito mielo-monocitario rispetto a quello eritroide e suggeriscono che, verosimilmente, Otx1 regola la differenziazione mielo-monocitaria attivando una cascata

trascrizionale distinta o solo parzialmente sovrapponibile a quella interessata nella regolazione dell’eritropoiesi. Per dare una risposta a tale questione ho innanzitutto cercato di individuare una rosa di possibili geni target di Otx1, per poi andare ad analizzare le eventuali variazioni della loro espressione quando il gene

“regolatore”, Otx1, è ablato. Partendo dal presupposto che Otx1 è espresso in

cellule che si trovano ancora allo stato di precursori, i candidati da prendere in

considerazione avrebbero dovuto essere geni noti per la loro espressione nel sistema ematopoietico e specificamente richiesti per la differenziazione mielo- monocitaria. La loro azione avrebbe dovuto esplicarsi a valle di quella di Otx1, quindi eventualmente in cellule ad uno stadio differenziativo non troppo precoce.

Infine, per questa scelta ho tenuto conto dei recenti progressi che l’analisi di sequenze regolatorie ha consentito di compiere nella determinazione del ruolo di molti fattori di trascrizione mieloide: ad esempio, i promotori dei tre recettori dei fattori di crescita mieloidi (G-CSF-R, M-CSF-R, GM-CSF-R), hanno un’organizzazione molto simile e contengono tutti siti di legame per due fattori di trascrizione particolarmente coinvolti nella differenziazione mielo-monocitaria, PU.1 e C/EBP α . (Tenen et al., 1997)

Fig. 5.1 Struttura dei promotori umani per i recettori dei fattori di crescita mieloidi: Sono mostrati i siti di legame per PU.1, C/EBP α e AML1; il sito di inizio della trascrizione è designato dalla freccia orizzontale.(Tratto da Tenen et al.,1997)

Diversi ricercatori hanno focalizzato la loro attenzione su PU.1 quale master regulator dello sviluppo mieloide (Scott et al., 1994; Voso et al., 1994). Questo

gene sembra agire a più stadi del processo differenziativo e presenta un pattern di

espressione caratteristico: è poco espresso nelle staminali ematopoietiche, viene

specificamente up-regolato nei progenitori multipotenti dove media il commitment

verso il lineage mieloide, fino ad essere espresso ad alti livelli nei monociti, nei

neutrofili e nei linfociti B. La sua inattivazione, è letale allo stadio embrionale

E16 per la mancanza di qualsiasi tipo di cellula del sangue, inclusi i monociti, i

neutrofili e i linfociti B (Scott et al.,1994; McKercher et al., 1996); la sua espressione forzata induce il commitment mieloide in linee cellulari multipotenti (Nerlov e Graf, 1998; McIvor et al., 2003); inoltre, sembra che diversi livelli di espressione di questo gene dirigano distinti destini cellulari: alte concentrazioni di PU.1 promuovono la differenziazione macrofagica mentre basse concentrazioni

quella dei linfociti B (DeKoter e Singh, 2000). Analizzando la regione che regola la trascrizione di PU.1 abbiamo notato la presenza di un sito bicoid, sequenza che può essere riconosciuta dall’omeodominio di Otx1.

L’altro gene che ho preso in considerazione è C/EBP α, un fattore di trascrizione indispensabile per la differenziazione degli adipociti e in ambito ematopoietico dei neutrofili (Zhang et al., 1997).

Sulla base di tali considerazioni sono passata allo studio di questi geni.

Nell’analisi da me svolta, ho confrontato prima di tutto l’espressione di PU.1 e

C/EBP α nel midollo osseo di topi wild type e Otx1

e successivamente in pools

di colonie GM, che rappresentano una popolazione maggiormente arricchita in

cellule committed verso la filiera mieloide rispetto al midollo intero. Nei midolli

ho evidenziato una diminuzione dell’espressione di PU.1 nei topi Otx1

rispetto

ai wild type (Fig 4.4). Tale risultato è in accordo con diversi studi condotti in vivo

e in vitro che dimostrano che la down-regolazione di PU.1 determina un aumento

della granulopoiesi e una concomitante diminuzione del lineage monocitario e

macrofagico (Rosenbauer et al., 2004; Dahl et al., 2003). Ad esempio, saggi di

differenziazione in vitro hanno evidenziato che le ES PU.1

sono incapaci di

produrre macrofagi e hanno permesso di individuare come principali targets

dell’azione di PU.1 il recettore per il fattore di crescita M-CSF e il marcatore

terminale CD11b. (Henkel et al., 1996; Olson et al., 1995). Studi analoghi

condotti su ES PU.1

e PU.1

da Dahl e collaboratori hanno rivelato che la percentuale di colonie granulocitarie generate dalle cellule ES PU.1

è all’incirca 14 volte più elevata rispetto a quella prodotta dalle ES PU.1

, viceversa la percentuale di colonie macrofagiche PU.1

risulta essere solo un terzo di quelle PU.1

(Dahl et al., 2003). Queste considerazioni rafforzano quindi l’ipotesi che PU.1 possa essere un target dell’omeoproteina Otx1, anche se certamente non rappresentano una prova conclusiva. La presenza del sito bicoid nella regione regolatrice di PU.1 potrebbe essere un indizio del fatto che questo gene sia un target diretto, possibilità che potrà in futuro essere vagliata utilizzando saggi EMSA e saggi di transattivazione volti a verificare l’esistenza di una possibile interazione fisica tra l’omeoproteina Otx1 e il suo sito bersaglio, e a stabilire se tale interazione sia in grado di influenzare la trascrizione del gene bersaglio. E’ importante osservare comunque che l’assenza del gene Otx1 nei topi mutanti omozigoti non comporta una completa inattivazione di PU.1, ma solo una riduzione della sua espressione dell’ordine del 60%, indicando quindi che il controllo della trascrizione di PU.1 non dipende esclusivamente da Otx1, ma anche da altri geni, come ci si può aspettare date le numerose interazioni di PU.1 già sperimentalmente dimostrate (Nagulapalli et al., 1995), come ad esempio quelle con C/EBP α e c-Myb.

L’analisi dell’espressione di C/EBP α ha invece prodotto dei risultati variabili,

suggerendo che l’attività del gene non sia grandemente influenzata

dall’inattivazione di Otx1. Questo dato sembrerebbe apparentemente in contrasto

col fatto che C/EBP α è espresso ad alti livelli durante la differenziazione

granulocitaria, mentre viene down-regolato nello sviluppo dei macrofagi e degli

eritrociti (Tenen et al., 1997).Tuttavia si spiega tenendo presente che

C/EBP α può inibire la capacità di PU.1 di attivare la propria trascrizione e che alte concentrazioni di PU.1 sono generalmente richieste per contrastare questo tipo di inibizione e dirigere la differenziazione cellulare verso i macrofagi.(Reddy et al., 2002). PU.1 infatti interviene prima di C/EBP α ed è down-regolato in seguito all’inattivazione di Otx1, ne consegue che questo tipo di regolazione da

parte di C/EBP α non risulta più necessario per favorire la differenziazione granulocitaria. D’altro canto Rosenbauer et al. hanno dimostrato che livelli diversi di espressione di PU.1 hanno effetti diversi sul lineage mielo-monocitario e che una diminuzione dell’attività trascrizionale a partire dal 60-70% provoca un notevole aumento della granulopoiesi, indipendentemente dai livelli di C/EBP α. Pertanto la riduzione dei livelli di espressione di PU.1 che ho riscontrato nelle cellule midollari dei topi Otx1

sembra sufficiente a spiegare lo sbilanciamento del rapporto fra precursori granulocitari e progenitori macrofagici.

A livello delle colonie non è stato possibile stabilire nessuna correlazione fra

l’espressione dei due geni candidati e l’effetto osservato a livello cellulare,

verosimilmente perché queste rappresentano uno stadio differenziativo già troppo

avanzato, a livello del quale i due fattori di trascrizione in esame hanno già

condizionato il destino delle varie popolazioni cellulari. Pertanto al fine di

studiare in maniera più diretta la variazione dell’espressione di fattori di

trascrizione mieloidi-specifici nel commitment dei precursori mielo-monocitari

sarà necessario selezionare attraverso citofluorimetria di flusso (FACS)

popolazioni di progenitori e indurne la differenziazione con G-CSF, M-CSF o

GM-CSF.