S APIENZA
UNIVERSITÀ DI ROMA
DOTTORATO DI RICERCA IN MEDICINA SPERIMENTALE
PRESENTAZIONE DEI CANDIDATI ALL’ESAME FINALE XXXI CICLO
Dott.ssa Alessandra Gallinaro
La Dott.ssa Alessandra Gallinaro durante il corso di Dottorato in Medicina Sperimentale, ha svolto la sua attività di ricerca presso i laboratori dell’Istituto Superiore di Sanità, Centro Nazionale per la Salute Globale, sotto la direzione del Prof. Andrea Cara.
Nel corso del Dottorato, la Dott.ssa Gallinaro si è occupata dello studio di Vettori Lentivirali Integrasi Difettivi (IDLV) quali vettori auto-inattivanti (self-inactivating, SIN), non replicanti e non integranti derivati dai Lentivirus capaci di trasdurre cellule non proliferanti con elevato profilo di sicurezza e pertanto considerati una piattaforma molto attraente sia per la terapia genica che per protocolli di vaccinazione. Al fine di ridurre notevolmente la probabilità che si verifichino eventi di ricombinazione e la formazione di virus competenti per la replicazione, il sistema di produzione degli IDLV prevede l’utilizzo di tre plasmidi: il transfer vector, che costituisce il genoma dell’IDLV e esprime il trasgene di interesse; il packaging plasmid, esprimente tutte le proteine strutturali ed enzimatiche virali ad eccezione dell’Envelope; l’Env- vector, codificante per la glicoproteina G dell’envelope del virus della stomatite vescicolare (VSV-G), per garantire un’elevata efficienza di trasduzione ed un più ampio spettro d’ospite.
Inoltre, il gene che codifica per la proteina Integrasi (IN) contiene una o più mutazioni puntiformi a livello del sito catalitico che rendono l’enzima non funzionale: il genoma del vettore non può integrarsi all’interno di quello della cellula target, limitando il rischio di mutagenesi inserzionale che potrebbe indurre l’attivazione di oncogeni. L’espressione del trasgene è garantita da forme di DNA circolari extracromosomiali, chiamate episomi o E-DNA, derivanti da DNA retrotrascritto non integrato, che sono trascrizionalmente attive (Cara e Reitz, 1997) e stabili in cellule non proliferanti come cellule muscolari, dendritiche (DC) e macrofagi.
In numerosi studi è stato dimostrato che gli IDLV possono indurre nei topi immunizzati una risposta immunitaria specifica e persistente in grado di proteggerli dal challenge con virus o linee cellulari tumorali (Coutant et al., 2008; Fontana et al., 2014; Grasso et al., 2012). Pertanto, gli IDLV rappresentano un promettente delivery system per formulazioni vaccinali, in particolare nel caso di infezioni, come quella dovuta al virus dell’immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1), per le quali i metodi tradizionali di vaccinazione sono pericolosi o si sono dimostrati inefficaci. Ad oggi, infatti, nonostante i miglioramenti nella terapia permettano di controllare la diffusione della pandemia dell’AIDS, lo sviluppo di un vaccino preventivo contro l’infezione da HIV-1 è ancora una priorità nel campo della salute globale. Per essere efficace il
vaccino contro HIV-1 dovrebbe essere in grado di indurre una potente e duratura risposta immunitaria sia umorale che cellulo-mediata verso le numerose varianti circolanti del virus.
Infatti, studi su primati non umani (NHP) e in individui long-term non progressor hanno dimostrato che gli anticorpi neutralizzanti (NAbs) contro la proteina virale Env sono necessari per prevenire l’infezione, mentre la risposta cellulo-mediata contro le proteine virali strutturali è essenziale per controllare la replicazione del virus e limitarne la diffusione (Moldt et al., 2012;
Janes et al., 2013). Inoltre, topi e macachi rhesus immunizzati con vettori lentivirali esprimenti i geni per le proteine env o gag hanno sviluppato una forte e specifica risposta immunitaria rilevabile fino ad un anno dall’inoculo (Buffa et al., 2006; Negri et al., 2016).
Alla luce di questi dati, l’attività di ricerca svolta dalla Dott.ssa Gallinaro nel corso di questo dottorato di ricerca ha avuto lo scopo di sviluppare IDLV ad alto profilo di sicurezza e validare il loro utilizzo come sistema per la veicolazione di nuove e innovative formulazioni vaccinali basate sullo sviluppo razionale degli antigeni di HIV-1. Nell’ambito di questo proggetto, la Dott.ssa Gallinaro ha pertanto selezionato due antigeni: HIVACAT T-cell Immunogen (HTI) per indurre una risposta cellulo-mediata contro le proteine strutturali di HIV-1 e ConSOSL.UFO (Uncleaved pre- Fusion Optimized gp140 trimers) per elicitare la produzione di broadly neutralizing antibodies (bNAbs) diretti contro la proteina Env. HTI è una sequenza di 529 aminoacidi che contiene 16 regioni all’interno dei geni gag, pol, vif e nef relativamente conservate e identificate come target delle cellule T in pazienti HIV-positivi con bassa carica virale (Mothe et al., 2015). ConSOSL.UFO, invece, è una sequenza consensus del gene Env del gruppo M (Liao et al., 2006) modificata per mimare la struttura nativa dei trimeri di Env, aumentandone la stabilità, e caratterizzata da una maggiore esposizione degli epitopi in grado di indurre la produzione di bNAbs (Aldon et al., 2018).
Per la produzione di IDLV basati su HIV-1 e sul virus dell’immunodeficienza di scimmia (SIV), la Dott.ssa Gallinaro ha clonato l’open reading frame (ORF) del gene HTI nei plasmidi transfer, usati per la produzione di IDLV-HTI tramite la trasfezione di cellule packaging 293T. La quantità di IDLV-HTI recuperata era 10 volte inferiore rispetto all’IDLV esprimente la green fluorescent protein (GFP), usata come controllo. Questa interferenza di HTI nella produzione degli IDLV è dovuta alla presenza al suo interno di una forma mutata di Gag che impedisce la formazione e il rilascio delle particelle del vettore (Cara et al., 1998). Inoltre, l’assenza del sito di miristilazione nella proteina Gag codificata da HTI, causa il suo accumulo all’interno delle cellule trasfettate, in cui, tramite il dominio di oligomerizzazione, sequestra il Gag wild-type prodotto dal plasmide packaging, come dimostrato dall’osservazione al microscopio confocale di cellule 293T trasfettate con plasmidi di fusione in cui HTI e i geni per la proteina Gag wild type di HIV-1 o SIV sono fusi rispettivamente alla proteina fluorescente mCherry o GFP (rispettivamente pHTImCherry e pGagGFP). Dalle immagini ottenute dalla Dott.ssa Gallinaro hanno chiarito che la proteina wtGag localizza a livello della membrana plasmatica e HTI nel citoplasma; tuttavia quando le cellule sono co-trasfettate con pHTImCherry e pGagGFP, Gag e HTI colocalizzano all’interno del citosol, indicando che la proteina HTI è in grado di trattenere nel citoplasma la proteina Gag impedendone la localizzazione sulla membrana cellulare. Inoltre, la produzione di LV-GFP in presenza di dosi decrescenti del plasmide esprimente l’HTI ha mostrato un aumento dell’efficienza di trasduzione degli LV-GFP, raggiungendo valori più alti quando il rapporto molare tra HTI e wtGag era pari a 0.4. Pertanto, al fine di contrastare l’effetto di trans-dominanza negativa di HTI e produrre maggiori quantità di IDLV-HTI, la Dott.ssa Gallinaro ha proceduto a modificare il protocollo di produzione degli IDLV-HTI, diminuendo la dose di transfer vector esprimente HTI e aumentando quella del packaging plasmid che esprime la proteina Gag wild type. La quantità di IDLV-HTI recuperata era da 5 a 7 volte maggiore per gli IDLV basati su SIV e HIV-1, rispettivamente, sufficiente per eseguire un protocollo di immunizzazione in vivo nei topi BALB/c. Topi immunizzati con IDLV-GFP e topi naive sono stati usati rispettivamente come controllo. A quattro settimane dall’immunizzazione, la risposta
cellulo-mediata indotta da HTI è stata valutata tramite test ELISPOT sugli splenociti, usando un pannello di dieci pools di peptidi che ricoprono la sequenza di HTI e i peptidi immunodominanti di Gag di HIV-1 e GFP. I risultati hanno permesso di dimostrare alla Dott.ssa Gallinaro che gli IDLV basati su SIV rappresentano una piattaforma vaccinale più adeguata rispetto agli IDLV basati su HIV-1 per indurre una risposta immunitaria specifica nei confronti di trasgeni esprimenti le proteine strutturali di HIV-1. In particolare, entrambi i vettori IDLV-HTI hanno indotto una risposta nei confronti dei pool peptidici che ricoprono la regione della p24, della Proteasi (PR) e della Trascrittasi Inversa (RT). I topi immunizzati con IDLV-GFP basato su HIV- 1 presentavano, oltre ad una risposta GFP-specifica, anche una risposta nei confronti della p24 e della RT. Questa risposta è data dalla presenza di epitopi cross-reattivi nelle proteine strutturali che formano la particella del vettore basato su HIV-1. Al contrario, nelle cellule derivate da topi immunizzati con IDLV-GFP basato su SIV era presente solo la risposta nei confronti della GFP, in quanto l’omologia di sequenza tra la proteina Gag di HIV-1 e quella di SIV è pari al 53% e non sono presenti epitopi cross-reattivi con la sequenza HTI. Inoltre, gli IDLV basati su HIV-1, esprimenti sia HTI che GFP, hanno indotto una forte e specifica risposta cellulo-mediata nei confronti del peptide immunodominante di Gag. Il pool 6, che ricopre la regione dell’HTI e corrisponde alla PR di HIV-1, è stato riconosciuto solo nel contesto dell’immunizzazione con IDLV-HTI e non con IDLV-GFP e rappresenta, pertanto, la risposta più
specifica nei confronti di HTI.
Al fine di valutare gli IDLV come piattaforma vaccinale per l’induzione di anticorpi neutralizzanti, la Dott.ssa Gallinaro ha successivamente selezionato due antigeni ConSOSL.UFO:
UFO.664 che produce trimeri di Env solubili e UFO.750 per l’espressione di Env trimerici legati alla membrana plasmatica. Le sequenze di UFO.664 e UFO.750 sono state clonate nei plasmidi transfer basati su SIV e la loro espressione è stata valutata tramite Western Blot (WB) su cellule trasfettate. Inoltre, le cellule trasfettate con UFO.664 e UFO.750 sono state marcate con l’anticorpo anti-Env (2G12), analizzate tramite citofluorimetria e osservate al microscopio confocale. I risultati hanno confermato che in seguito a marcatura di membrana è rilevabile solamente UFO.750, mentre per visualizzare UFO.664 è necessaria la permeabilizzazione della membrana e la marcatura intracellulare con il 2G12. Per valutare se UFO.750 sia presente sulla membrana cellulare nella conformazione trimerica, cellule 293T trasfettate con pGAE-UFO.750 sono state marcate con gli anticorpi PGT145 e PGDM1400 che riconoscono in maniera specifica la struttura quaternaria dei trimeri di Env. Come controllo negativo, la dottoressa ha utilizzato un plasmide esprimente la proteina ConSgp160, da cui UFO deriva, ma che non è stata ingegnerizzata per produrre trimeri stabili. L’analisi al citofluorimetro e l’osservazione al microscopio confocale hanno mostrato che entrambi gli anticorpi utilizzati sono in grado di legare UFO.750, confermando che UFO.750 produce trimeri di Env stabilmente legati alla membrana plasmatica. Al contrario, nessun segnale è stato rilevato nel caso di cellule trasfettate con pConSgp160. Successivamente, sono stati prodotti gli IDLV-UFO.664 e IDLV- UFO.750 basati su SIV. Utilizzare gli IDLV derivati da SIV si è reso necessario per il loro successivo uso in un protocollo di immunizzazione dei primati non umani (NHP), in quanto hanno mostrato una maggiore capacità di trasdurre le cellule primarie di scimmia data la presenza di fattori di restrizione specie-specifici, tra cui la proteina Vpx che inibisce l’effetto anti-virale della proteina cellulare SAMHD1. Il WB delle preparazioni purificate di IDLV- UFO.664 e IDLV-UFO.750 ha dimostrato che l’IDLV-UFO.750 è pseudotipizzato, evidenziando UFO.750 sulla superficie della particella del vettore. Per confrontare la risposta immunitaria indotta dall’IDLV esprimente un Env di membrana rispetto all’IDLV che esprime trimeri solubili, la Dott.ssa Gallinaro ha immunizzato gruppi di 5 topi BALB/c con dosi crescenti di entrambi gli IDLV. In tutti i gruppi, i titoli degli anticorpi erano rilevabili fino ad un anno dall’immunizzazione. La vaccinazione con IDLV-UFO.750 ha indotto titoli anticorpali più alti rispetto all’immunizzazione con IDLV- UFO.664, indipendentemente dalla dose ricevuta. Ciò è
dovuto alla presenza di UFO.750 sulla particella dell’IDLV, che agendo come una virus-like particle (VLP) induce anticorpi specifici anti-UFO prima di IDLV- UFO.664, il quale esprime il trasgene solo dopo l’ingresso nelle cellule target e la trascrizione del genoma. Sulla base di questi dati, sono stati selezionati l’IDLV-UFO.750 per l’immunizzazione di cinque macachi cinomolghi (Macaca fascicularis) con lo scopo di valutare l’induzione di anticorpi neutralizzanti. In tutti gli animali, la vaccinazione ha indotto anticorpi specifici anti-Env che hanno raggiunto un picco tra le 2 e le 6 settimane post-inoculo. I titoli anticorpali hanno subito un leggero declino dalla seconda settimana (picco medio) alla trentasettesima post-inoculo, suggerendo che una singola immunizzazione con IDLV-UFO.750 ha indotto una risposta umorale persistente. Per aumentare ulteriormente la produzione di anticorpi, gli animali sono stati vaccinati nuovamente con lo stesso vettore, utilizzando una strategia di “VSV.G exchange”:
l’IDLV-UFO.750 usato per la seconda immunizzazione è stato pseudotipizzato con una proteina VSV.G proveniente da un serotipo diverso (Cocal) rispetto a quella usata per pseudotipizzare l’IDLV- UFO.750 utilizzato per il prime (Indiana). L’uso di questa strategia permette di evitare che anticorpi anti- VSV.G indotti dalla prima immunizzazione possano neutralizzare il vettore usato per la seconda vaccinazione. Il boost ha determinato in tutti gli animali vaccinati un aumento del titolo anticorpale. Dopo un picco della risposta a due settimane post-boost, i livelli di anticorpi anti-UFO sono lentamente diminuiti mostrando valori più alti rispetto a quelli presenti prima del boost. Inoltre, la risposta umorale era ancora presente dopo un anno dalla prima vaccinazione in tutti gli animali. Test di neutralizzazione sui sieri dei macachi immunizzati, hanno rilevato la presenza di anticorpi neutralizzanti (NAbs) nei confronti del virus MW965.26, appartenente al clade C e classificato come tier 1, solo dopo il boost, sottolineando che la quantità totale di anticorpi correli con l’induzione di NAbs. Tuttavia, non sono stati rilevati NAbs nei confronti del virus autologo ConS, classificato come tier 2, suggerendo come i miglioramenti apportati agli antigeni UFO, non siano sufficienti per l’induzione di anticorpi neutralizzanti nei confronti di un pannello più ampio di sottotipi di HIV1.
Nell’insieme, i risultati ottenuti da questa ricerca di dottorato hanno permesso alla Dott.ssa Gallinaro di dimostrare che gli IDLV rappresentano un’efficace piattaforma per la veicolazione di antigeni razionalmente disegnati, inducendo una risposta immunitaria cellulo-mediata o anticorpale specifica e persistente. In particolare, l’IDLV basato su SIV è un appropriato candidato per la valutazione di risposte specifiche nei confronti di antigeni strutturali di HIV-1 e per lo studio di strategie di vaccinazione in primati non umani (NHP).
PUBBLICAZIONI 2015-2018
Gallinaro A, Borghi M, Bona R, et al. Integrase Defective Lentiviral Vector as a Vaccine Platform for Delivering Influenza Antigens. Frontier in Immunology 2018; 9:171.
Abstracts, Posters e Oral Communications:
- Gallinaro A, Borghi M, Baroncelli S, et al. Integrase Defective Lentiviral Vectors (IDLVs) as HIV-1 vaccine Platform for induction of anti-Env Abs, 3rd EAVI2020 Annual Meeting, Madrid, 18-19 Ottobre 2018 (Abstract e Poster).
- Gallinaro A, Borghi M, Baroncelli S, et al. Integrase Defective Lentiviral Vectors (IDLVs) as HIV-1 vaccine delivery platform, 5th Course on animal models and vaccination, EAVI2020, Parigi, 08-11 Aprile 2018 (Abstract e Oral Communication).
- Gallinaro A, Borghi M, Bona R, et al. Development of an IDLV-based vaccine against HIV- 1/AIDS, 8th BeMM Symposium, Biology and Molecular Medicine PhD School, Roma, 20 Novembre 2017 (Poster e Poster Teaser).
- Gallinaro A, Borghi M, Baroncelli S, et al. Development and use of Integrase Defective Lentiviral Vector (IDLVs) as HIV-1 vaccine delivery system for bNAbs induction. 4th course on HIV immunology and vaccines and 2nd EAVI2020 Annual meeting, Barcelona, 05-08 Novembre 2017 (Abstract e Oral Communication).
- Gallinaro A, Bona R, Borghi M, et al. Development of an IDLV-based vaccine against HIV- 1/AIDS. 2nd course on HIV immunology and vaccines and 1st EAVI2020 Annual meeting, Barcelona, 10-11 Novembre 2016 (Poster, Abstract e Oral Communication).
- Morante V, Borghi M, Gallinaro A, et al. Use of integrase-defective lentiviral vectors for cancer immunotherapy. 2nd course on HIV immunology and vaccines and 1st EAVI2020 Annual meeting, Barcellona, 10-11 Novembre 2016 (Poster e Abstract).
- Michelini Z, Fontana J, Gallinaro A, et al. Integrase-defective Lentiviral Vectors for immunization and antibody delivery against influenza. Options IX for the Control of Influenza, Chicago, 24-28 Agosto 2016 (Poster).
- Gallinaro A, Michelini Z, Bona R, et al. Long-term persistence of integrase defective lentiviral vector (IDLV) vectored HIV-1 ENV for induction of protective antiviral antibodies.
Conferenza “Stati Generali della Ricerca Sanitaria”, Roma 27-28 Aprile 2016 (Poster).
- Gallinaro A, Bona R, Borghi M, et al. Development of an IDLV-based vaccine against HIV- 1/AIDS. 1st course on HIV immunology and vaccines, EAV2020, Stoccolma, 23-23 Aprile 2016 (Oral Communication).
Il Collegio dei Docenti giudica l’attività scientifico-formativa della Dott. Alessandra Gallinaro in modo positivo, in base alla frequenza e all’attività di ricerca complessivamente svolta. Esprime parere favorevole alla presentazione di una tesi di Dottorato dal titolo:
Integrase Defective Lentiviral Vector as a Vaccine Platform for Delivering HIV-1 Antigens
Il Segretario Il Coordinatore
Prof.ssa Tina Garofalo Prof. Maurizio Sorice
