3.1.EffettittAIAAtAtribtiftb tufcc cftS SS-S-tt RISULTATI

RISULTATI

3.1. EffettittAIAAtAtribtiftb tufcc cftS SS-S-tt

3.1.1. Inf fnnztb cczt tizctit

In precedenti ricerche è stato dimostrato che l’AICA riboside produce una riduzione signifcatiia di iitalitt cellulare tempo e dose dipendente (esii icheli et all 2220l Nel presente laioroi iniecei è stato indagatoi utilizzando AICA riboside ad una concentrazione di 1 m i se esiste un minimo interiallo di tempo al quale la iitalitt cellulare risulti signifcatiiamente compromessal (er are questo è stato utilizzato il saggio dell’ TT osmann 1983; Hanseni Nielsen et all 1989; Liui (eterson et all 1997; Liu and Schubert 19970l Questo metodo riiela la iitalitt cellulare grazie alla capacitt di riduzione del bromuro di 3- 4i5-dimetiltiazol- -il0- i5-di eniltetrazolio TT0 da parte delle cellule metabolicamente atiiel L’ TTi ridoto a sale di armazanoi iiene prima depositato a liiello intracellulare in orma di granuli blu che diientano più scuri e grandi col passare del tempo dopodiché tali granuli migrano ierso la membrana plasmatica sulla cui superfciei per esocitosii si depositano soto orma di cristalli “ad ago” colorati Liu and Schubert 19970l L’indice dell’aiienuta riduzione dell’ TT è proprio il colorel In atii la diierenza di tonalitt tra le colture sotoposte al tratamento con AICA riboside con i rispetiii controllii cioè cellule cresciute in assenza di essoi è spesso ben iisibile ad occhio nudo e quantifcata c on l a misurazione dell’assorbanza a 572 nml

Le cellule sono state incubate per 4i 8i 4 e 48 ore con AICA ribosidei dopodiché il terreno è stato rimosso e sostituito con terreno senza ribosidel Le colture di controllo sono state tratate a llo s tesso m odo e l a c apacitt d i r iduzione d ell’ TT è s tata misurata dopo 48 ore fgura 3l10l I risultati suggeriscono che AICA riboside deie essere presente continuamente o almeno per un tempo superiore a 4 ore per produrre una iariazione signifcatiia della iitalittl

Fig 3l1l Effeitifcclfbeibtntinfntztiftettit fAbtntuintAIAAtAtribtiftb cczt tizctit.t

La iitalitt cellulare è stata misurata usando il saggio dell’ TT dopo 48 ore dall’inizio dell’incubazione con AICA ribosidei come descrito in ateriali e etodil I dati media + SE i n = 30 sono espressi come percentuale di riduzione dell’ TT delle cellule cresciute in assenza di AICA riboside per gli stessi tempil La signifcatiiittà pp2l21l

t3.1.2.ttttttttAIAAtAtribtiftttni uftAtczbutitittutiiuAititu

Allo scopo di studiare il meccanismo apoptotico a monte della caspasi-3i abbiamo analizzato se l’incubazione con AICA riboside induce il rilascio di citocromo c al citosoll Questo eiento è una carateristica d ella i ia m itocondriale iedere Introduzione0l Le cellule sono state solubilizzate con digitonina in condizioni

sperimentali tali da minimizzare il danno alla membrana mitocondriale eiitando il rilascio di citocromo c nelle cellule di controllol

(er questo esperimento sono state seminate circa sei milioni di cellule SH-SY5Y in piastra da 12 cm di diametro iedere ateriali e etodi0 ed il giorno seguente sono state sotoposte a t ratamento c o n A I CA r i boside 1 m l . o po l ’ incubazionei i l contenuto citoplasmatico estrato è stato sotoposto a separazione eletro oretica ed al successiio immunoblot la membrana da questa ricaiata come descrito n ei ateriali e etodi0l .i tuti i tempi di tratamento considerati 7i 15 e 4 or e0 si osseria un’eiidente banda sulla lastra otografca alle 15 ore fgura 3l i particolare della lastra autoradiografca0 rispeto al controlloi il quale non ha subuto tratamento con AICA ribosidel (er quanto gli altri tempi di tratamento consideratii 7 e 4 orei non si osseria in maniera percetibile l a p resenza d i c itocromo c l L a f gural 3 l mostra un esperimento rappresentatiio della rileiazione di citocromo cl

Controllo AICAr 1 m 15h

Citocromo c

Figl 3l l AIAAtAtribtifteAi iuztAtczbutitittutiiuAititu. Immunobloting di estrati citosolici otenuti in colture incubate in presenza o assenza di AICA riboside per 15 orel isultati simili sono otenuti in 3 esperimenti indipendentil

3.1.3. AIAAtAtribtifteAii uftcltiAictbttifcczteAiuzbezbtSt9

La procaspasi-9 iiene atiiata i ia p roteolisi n ell’ a poptosomai c omposto d al citocromo c e dal atore i nducente l ’apoptosi 1 i p rocaspasi-9 e d AT( iedere Introduzione0l Una iolta maturai la caspasi 9 atiia la caspasi 3 e la successiia cascata di eienti apoptoticil Allo scopo di chiarire se AICA riboside produce atiiazione di caspasi-9i le cellule sono state incubate per diiersi tempi e gli estrati sono stati sotoposti a immunobloting con un anticorpo che riconosce la procaspasi 9l stata eiidenziata cosui la presenza di due bande una corrispondente alla procaspasi ed un’altra che migra di piùi mostrata nella fgura 3l3l Il peso molecolare apparente di quest’ultimai probabilmente la orma atiia della caspasi-9i calcolato in unzione della distanza percorsa gel eletro oretico rispeto ad uno standard di pesi molecolari notii risulta essere di 9 k.al Un peso molecolare simile è stato precedentemente riscontrato da altri autori in cellule di neuroblastoma SH-SY5Y cGinnisi Gnegy et all 2230l

AICA r 1 m Contrl 15 h 4 h 3 h

Caspasi 9

Figl 3l3l AIAAtAtribtifteAi iuztczttzi Azntinftifccztuzbezbtt9. tTratamenti con 1 m di AICA riboside producono la maturazione e quindi atiiazione di caspasi 9 da cui prosegue la successione di eienti apoptoticil La fgura m ostra u n i mmunoblot r appresentatiio d i 3 esperimenti indipendentil

3.2. EffettitttfieiAttnztb ccftufcc cftittnf Airczbiitz.

3.2.1. Aet zntinftittAAMP.

Allo scopo di chiarire se l’eieto a p optotico d i A I CA r i boside s i a c o rrelato c o n l’atiiazione d i A (Pi è s tata u tilizzata una s ostanza c he è i n g rado d i i ndurre l’atiiazione di A (P in alcune cellule Pe asi Cai et all 2240 ma non in altre ubini agliola et all 2250l La met ormina è un biguanide requentemente utilizzato nel tratamento armacologico del diabete di tipo II Hardie 1998; usii Hirshman et all 22 0l In questo laioroi è stato indagato se met ormina sia in grado di aumentare l’atiiitt di A (P in cellule di neuroblastomal

L’atiiazione della A (P è stata iisualizzata come aumento di intensitt della banda a 64 k.a rileiata mediante un anticorpo anti- os oA (Pl Il tratamento con AICA riboside 1 m produce un aumento progressiio di intensitt di questa banda tra 3 e 5 ore e tale risultato è rileiabile anche con tratamento per 5 ore di 5 m di met ormina fgura 3l30l

(-A (P

64 k.a

Fig 3l4l AIAAtAtribtiftfttfieiAttnzteAii uinitzet zntinftittAAMP.tTratamento con 1 m di AICA riboside o 5 m di met ormina proiocano l’atiiazione di A (Pl La fgura mostra un immunoblot rappresentatiio di 3 esperimenti indipendentil

3.2.2.ttttEffettitttfieiAttnztb cczt tizctittufcc czAf

Allo scopo di sapere se met ormina sia in grado di indurre morte cellularei le cellule SH-SY5Y sono state tratate con gli atiiatori della A (P e rileiata la capacitt di riduzione dell’ TTl Entrambi le sostanza riducono le iitalitt ma l’eieto di AICA riboside è maggiore di quello di met orminal Concentrazioni minori di 5 m di met ormina non hanno eieto s ulla c apacitt d i r iduzione d e ll’ TTl C ome s i p up osseriare dalla fgura 3l4i la iitalitt delle cellule SH-SY5Y è ridota al 666151 dopo 7 ore di tratamento con met ormina 5 m e ridota al 38691 con AICA riboside 1 m l L’incubazione protrata per 96 ore fgura 3l50i dimostra che la riduzione della iitalitt prosegue nel tempoi in ati s i o sseria u na d iminuzione a l 16121 c on met ormina e 15681 con AICA riboside rispeto alle cellule coltiiate in assenza di tali composti per lo stesso periodo di tempol

Figl 3l5l Effeit tizctittzta2tiAf.tLa iitalitt delle cellule SH-SY5Y è stata misurata con il metodo dell’ TT come descrito in ateriali e etodi0i dopo 7 ore di tratamento con AICA riboside AICAr0 o met ormina met 0l I dati sono espressi come media 6 SE l pp2i21l

Fig 3l6l Effeit tizctittzta2tiAf.tLa iitalitt delle cellule SH-SY5Y è stata misurata con il metodo dell’ TT come descrito in ateriali e etodi0i dopo 7 ore di tratamento con AICA riboside AICAr0 o met ormina met 0l I dati sono espressi come media 6 SE l pp2i21l

3.2.3. AfieiAttnzttni uftzeieiibtttntufcc cftS

SS-S-Allo scopo di chiarire se la riduzione della iitalitt corrisponde ad un aumento di apoptosi le cellule sono stato fssate e colorate con Hoechst 33 58l La colorazione delle cellule con questo marcatore nucleare fuorescente permete di indiiiduare le cellule apoptotiche sulla base di alcuni criteri mor ologici nucleari come la condensazione e la rammentazione del nucleo e la ormazione dei carateristici corpi apoptoticil Nelle fgure 3l7 7 h0 e 3l8 96h0 sono stati comparati colture di controllo e tratate con AICA riboside o met orminal I nuclei delle cellule non tratate p resentano u na fuorescenza o mogenea m entre l e c olture t ratate p e r 7 o r e c o n A I CA r i boside mostrano una diminuzione della densitt cellularei una riduzione del iolume nucleare e la presenza di corpi apoptoticil Nelle cellule tratate con met ormina si osseria una diminuzione della densitt cellulare ed un numero minore di nuclei apoptotici rispeto

a quelli osseriati nelle colture con AICA ribosidel Il numero di nuclei apoptotici aumenta dopo tratamenti di 96 ore con met orminal Nel caso dell’AICA riboside tale aumento non è eiidente perché si produce il distacco delle cellule apoptotiche che iengono perse durante i processi di colorazione e fssazionel

.

AICAr 1 m

et ormina

5 m

Controllo

Figl 3l7l EffeitzeieiiituitittAIAAtAtribtiftfttfieiAttnztzta2tiAf. Le cellule sono state incubate in presenza o assenza di 1 m AICA riboside e 5 m met orminai fssate e colorate con Hoechstl Le recce indicano alcuni dei nuclei apoptoticil A destrai particolari a maggior ingrandimentol La fgura mostra immagini rappresentatiie di almeno 3 esperimenti condoti in duplicatol

.

et ormina

5 m

AICAr 1 m

Controllo

Figl 3l8l EffeitzeieiiituitittAIAAtAtribtiftfttfieiAttnztzt9 tiAf. Le cellule sono state

incubate in presenza o assenza di 1 m AICA riboside e 5 m met orminai fssate e colorate con Hoechstl Le recce indicano alcuni dei nuclei apoptoticil A destrai particolari a maggior ingrandimentol La fgura mostra immagini rappresentatiie di almeno 3 esperimenti condoti in duplicatol

3.2. EffettittuiteibiitAtb cczt tizctittifccftufcc cftittS SS-S-.

(er chiarire la possibile correlazione tra A (P e morte cellulare è stato usato il composto C ad una concentrazione che in alcune cellule inibisce la A (P Zhoui yers et all 221; Pe asi Cai et all 2240l Il tratamento con composto C 5 proioca la diminuzione della iitalitt cellulare al 86111 git dopo 4 ore di tratamento ed alle 48 ore la iitalitt scende al 76 1 fgura 3l90l A concentrazione 1 la iitalitt scende al 6 661 dopo 4 orel Concentrazioni più basse 2i5 0 non sono tossiche a 4 ore ma lo sono a 48 ore di tratamento quando la iitalitt è ridota a 746121 delle cellule controllo fgure 3 l12 e 3 l110l I l t ratamento s i multaneo c o n A I CA r i boside e composto C produce eieti a d ditiii s u lla r i duzione d e lla i i talitt f n o al l a

et ormina

5 m

concentrazione di 1 l Quando i ialori sono molto bassi 5 48 ore0 il saggio dell’ TT non permete di misurare diierenze di iitalitt fgura 3l110l

Figl 3l9l EffeitifteititefnifniftifctuiteibiitAtb cczt tizctit..tLe cellule sono state tratate per tempi diiersi con composto C e la iitalitt è stata misurata con il metodo dell’ TT come descrito in ateriali e etodi0i alle 48 orel I dati sono espressi come media 6 SE e sono signifcatiii con pp2i221l

Figl 3l12lEffeitiibftitefnifniftifctuiteibiitAtb cczt tizctit.tLe cellule sono state tratate

per 4 ore con diierse concentrazioni di composto C e la iitalitt è stata misurata con il metodo dell’ TT come descrito in ateriali e etodi0l I dati sono espressi come media 6 SE l pp2i221i pp2i25l

Figl3l12ltEffeitifctiAzeztfniituin AIAAtAtribtiftftuiteibiitAtb ccft tizctit. Le cellule sono state tratate per 48 ore in presenza o assenza di diierse concentrazioni di composto C CC0 e 1 m AICA ribosidel I dati sono espressi come media 6 SE l