MATERIALI E METODI
I prelievi ematici di 660 uomini e 429 donne di età compresa tra 1 anno e 91 anni (media ± S.E.M. = 61,43 ± 0,6795) sono stati collezionati nell’arco di 39 mesi (01.10.2008 – 31.12.2011). Questi prelievi provenivano da pazienti ricoverati in reparti di Rianimazione (n = 424), Medicina e Pneumologia (n = 402), Reparti Specialistici (Ginecologia, Pediatria, Neurologia, Nefrologia e Dialisi, Malattie Infettive) (n = 207), Chirurgia ed Ortopedia (n = 56).
Non sono state considerate le patologie di cui erano sofferenti questi soggetti in quanto non pertinenti a questa tesi che si propone semplicemente di correlare dati microbiologici con i valori di PCT indipendentemente dalle patologie.
2.1DETERMINAZIONE DELLA PCT
2.1.1 Materiali:
Prelievi ematici in provetta con gel separatore (Vacutainer)
Pozzetti per Enzyme Linked Fluorescent Assay (Brahms PCT, Biomerieux) Strumento VIDAS
2.1.2 Metodi:
Per la determinazione dei livelli di PCT è stato utilizzato un test immunoenzimatico a sandwich con lettura finale in fluorescenza (ELFA) effettuato su siero. La misurazione viene fatta dallo strumento VIDAS (Morin et al., 2006).
Dopo centrifugazione a 4000 rpm per 10 minuti, il siero del paziente viene trasferito nei pozzetti contenenti gli anticorpi di topo anti PCT umana sia adesi al fondo che liberi, questi ultimi marcati con fosfatasi alcalina. Dopo lavaggi per eliminare le molecole non legate, viene messo il substrato 4-metil-umbelliferil-fosfato che, tramite la fosfatasi alcalina, viene idrolizzato a 4-metil-umbelliferone liberando una fluorescenza che viene letta a 450 nm.
La fluorescenza è direttamente proporzionale alla concentrazione del campione che viene data direttamente dallo strumento sulla base di una curva di taratura. Secondo istruzioni della casa madre, ogni 28 giorni lo strumento viene calibrato con due calibratori forniti che devono essere usati in doppio e all’apertura di ogni nuova confezione di pozzetti vengono effettuati dei controlli con gli appositi campioni forniti dalla casa madre.
2.2COLTURE BATTERICHE
2.2.1 Materiali:
Sangue, punte di catetere venoso centrale (CVC) e versamenti cavitari Flaconi per emocoltura con terreno per Aerobi ed Anaerobi (Biomerieux)
Piastre petri con terreni per colture batteriche (Agar sangue (AS), sia semplice che addizionato di Colistina e Acido Nalidixico (CNA), Mc Conkey, Agar cioccolato (AC), Sale Mannite (SM), terreno cromogeno per Candida (CAN)) e terreni liquidi (BHI, Tioglicolato, flaconi selettivi/discriminativi per Aerobi ed Anaerobi) (Beckton Dickinson)
Strumento per emocolture (BactAlert, Biomerieux; Bactec, Becton Dickinson) Siringhe
2.2.1 Metodi
I campioni di sangue, di punte CVC e di versamenti cavitari degli stessi pazienti studiati per la determinazione dei valori di PCT sono stati seminati sui terreni appositi.
I campioni di sangue arrivano in laboratorio già nei flaconi prelevati dal reparto. Per ogni emocoltura si usano, secondo procedure standard, tre flaconi per Anaerobi e tre flaconi per Aerobi.
Per quanto riguarda le punte CVC, queste sono immerse in BHI (Brain Heart Infusion), vortexate, lasciate in termostato per mezz’ora e seminate su Agar sangue. Tutto è incubato in termostato a 37°C. Il giorno dopo viene fatta una seconda semina da BHI nel quale è immersa la punta CVC. Si distingue pertanto un risultato positivo da prima semina dove ha senso dare una carica ed un risultato positivo da seconda semina dove si da un risultato dopo arricchimento.
I versamenti cavitari vengono seminati su Agar cioccolato, sale mannite, McConkey e terreno Cromogeno per Candida, oltre che su flaconi aerobi ed anaerobi. Se questi si positivizzano, si fa una semina su Agar Sangue, Agar cioccolato, Mc Conkey e BHI. Anche qui, quindi, si distingue un risultato da prima semina, per cui si fornisce una carica, da un risultato da flaconi per cui si parla di arricchimento.
Sia nel caso delle punte CVC che nel caso dei versamenti cavitari, se si ha il risultato da prima semina, si semina comunque la seconda per avere una conferma o vedere se c’è qualche altro microrganismo che con la prima semina non era rilevabile perché in scarsa quantità.
Quando dalle colture batteriche sono stati isolati due microrganismi, questi sono stati considerati come se fossero germi isolati separatamente e inseriti come gli altri nell’analisi dei dati.
2.3ANALISI DEI DATI
2.3.1 Materiali
The Graph Pad Prism 5.1 Software per Vista
2.3.1 Metodi
I dati ottenuti non sono risultati essere distribuiti normalmente, pertanto abbiamo settato analisi di tipo non parametrico.
2.3.1 Correlazioni
I valori sono espressi come media ± SEM.
I valori di PCT sono stati correlati con l’età tramite la correlazione di Spearman. Per non incappare in bias dovute alle numerose variabili, le correlazioni sono state fatte sia globalmente, sia separando i pazienti in due sottogruppi: con colture batteriche positive e con colture batteriche negative.
2.3.2 Confronti
I valori di PCT tra i soggetti con colture positive e quelli con colture negative, le differenze o somiglianze tra i valori di PCT e i sessi sono stati confrontati con test di Mann-Whitney.
I confronti tra i reparti di provenienza e i distretti corporei sono invece state valutate tramite un confronto con il test di Kruskal-Wallis seguito dal post test di Dunns.
I reparti di provenienza sono stati raggruppati insieme in gruppi significativi: Rianimazione (R), Medicina e Pneumologia (M), Chirurgia ed
Ortopedia (CO) e Reparti Specialistici (RS). Questi ultimi comprendono Ginecologia, Pediatria, Neurologia, Malattie Infettive e Nefrologia e Dialisi.
Sono stati eseguiti ancora tests di Kruskal-Wallis seguiti dal post test di Dunns tra valori di PCT e germe isolato, rispettiva carica e proprietà tintoriale sia globalmente che per ogni genere di analisi colturale (Emocoltura, punte CVC e versamenti cavitari). Anche le cariche, i germi isolati e le proprietà tintoriali sono state raggruppati in categorie. Queste sono: due per le proprietà tintoriali (batteri Gram positivi (GP) e batteri Gram negativi (GN)), quattro per le cariche (arricchimenti (V), bassa carica (L), media carica (M) e alta carica (H)) e 6 per i germi isolati (Staphylococcus aureus (SA), Stafilococchi Coagulasi Negativi e Micrococchi (Scn), Streptococchi in generale ed Enterococchi (SE), Acinetobacter spp, Proteus spp e Pseudomonas spp (APP), Enterobacteriaceae (ECS), Miceti lievitosimili (MLs)).
All’interno del gruppo “Emocolture” le cariche sono state definite come numero di flaconi positivi su un totale di sei, definendo il seguente schema:
Carica “A” = Zero flaconi positivi
Carica “B” = 1 flacone positivo, 5 flaconi negativi Carica “C” = 2 flaconi positivi, 4 flaconi negativi Carica “D” = 3 flaconi positivi, 3 flaconi negativi Carica “E” = 4 flaconi positivi, 2 flaconi negativi Carica “F” = 5 flaconi positivi, 1 flacone negativo Carica “G” = Tutti flaconi positivi