43
Capitolo 2
MATERIALI E METODI
2.1. Estrazione dell’RNA totale da cellule di lievito
Una quantità opportuna di pellet cellulare è stata processata per l’estrazione dell’RNA totale con il MasterPureTM Yeast RNA Purification Kit (Epicentre). In breve, la procedura comprende la rottura della parete cellulare mediante l’uso della proteinasi K diluita in un buffer di estrazione, quindi la separazione dell’RNA dalle proteine e dai residui cellulari.
Dopo queste fasi è stata eseguita un’incubazione a 37°C per 20 minuti con la DNasi, al fine di degradare il DNA genomico eventualmente rimasto. L’enzima è stato eliminato mediante centrifugazione a 4°C per 10 minuti a 10000g in un buffer per la precipitazione delle proteine, fornito dal kit, quindi il pellet di RNA è stato precipitato, lavato con etanolo al 70%, asciugato e risospeso in acqua nuclease-free (Ambion).
E’ stata eseguita poi una purificazione su colonna mediante l’Rneasy MinElute Cleanup Kit (Qiagen), al fine di eliminare il DNA degradato, quindi l’RNA è stato risospeso nuovamente in acqua nuclease-free (Ambion) e utilizzato per la fase successiva.
L’intera procedura è stata ripetuta sia per le cellule di lievito (S. cerevisiae, ceppo diploide RS112) transfettate con BRCA1 wild-type sia per quelle transfettate con le varianti Y179C, S1164I, A1789T, I1766S, M1775R.
2.2. Quantificazione e controllo di qualità dell’ RNA
L’ RNA estratto è stato sottoposto a lettura spettrofotometrica alle lunghezze d’onda 260 e 280 nm mediante il nanospettrofotometro Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Technologies). Per ogni campione il software ha ricavato la concentrazione di RNA (in ng/μl) in base all’assorbanza a 260 nm. Quindi un microgrammo di ciascun campione è stato caricato su un gel denaturante di agarosio-formaldeide (agarosio 1.2%, formaldeide 0.7%) preparato con acqua trattata con DEPC (dietilpirocarbonato, composto che inattiva le RNasi).
44 2.3. Esperimento microarray
2.3.1. Sintesi e marcatura delle sequenze target
Per questa fase è stato utilizzato il kit Amino-Allyl MessageAmpTM II aRNA amplification kit (Ambion) che prevede la retrotrascrizione dell’RNA totale mediante primer oligo-dT, la degradazione dell’RNA mediante l’RNasi H, la sintesi del secondo filamento di cDNA e l’amplificazione lineare del cDNA a doppio filamento così ottenuto secondo il metodo proposto da Eberwine (o trascrizione in vitro, Eberwine et al., 1992).
1 μg di ciascun campione è stato utilizzato per la sintesi del cDNA duplex quindi sottoposto ad un round di amplificazione in stufa a 37°C per 14 ore, in presenza dei nucleotidi ATP, CTP, GTP e UTP/amminoallil-UTP, questi ultimi in proporzione 2:1. Il gruppo amminoallile è necessario nella fase successiva di marcatura, in quanto è in grado di legare le molecole di fluorocromo (marcatura indiretta).
La concentrazione dell’RNA amplificato (aRNA) è stata misurata al Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Technologies), quindi 20 μg di ciascun campione sono stati essiccati e incubati con i fluorocromi Alexa647 e Alexa555 (Invitrogen). Ciascun campione è stato marcato in doppio, cioè 10 μg sono stati marcati con un fluorocromo e 10 μg con l’altro, per effettuare il dye-swap sui microarray.
Nella fig. 2.1 è riportata schematicamente la procedura seguita. 2.3.2. Quantificazione dell’efficienza di marcatura
Tramite misurazione al nanospettrofotometro Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Technologies) è stata misurata l’assorbanza di ciascun campione di RNA amplificato marcato a 260, a 555 e 647 nm e sono stati calcolati i nanogrammi di RNA, le picomoli di nucleotidi totali, le picomoli di fluorocromo e l’efficienza di marcatura, espressa come rapporto (R) tra le picomoli di nucleotidi totali e le picomoli di fluorocromo. Le formule utilizzate sono riportate di seguito (Bowtell D. and Sambrook J., 2003):
ng cDNA = (A260) x 35 x volume (µl)
pmoli nucleotidi = (A260 x volume (µl) x 37 x 1000) / 324 pmoli Alexa555 = (A555) x volume (µl) / 0,15
45 Figura 2.1. Sintesi e marcatura delle sequenze target per i microarray (Amino-Allyl MessageAmpTM II aRNA amplification kit-Instruction Manual-Ambion).
46 Le formule per il calcolo delle picomoli si ricavano dalla legge di “Lambert & Beer” secondo la quale l’assorbanza di una sostanza (A) è proporzionale alla sua concentrazione (C), allo spessore dello strato attraversato dalla luce (cammino ottico, l) e al coefficiente di estinzione molare (ελ): A = ελCl
2.3.3. Ibridazione sui microarray
Sono stati utilizzati i microarray “Yeast Oligo Microarray, 2 x 11K” (Agilent Technologies) composti ciascuno da due array identici, contenenti sonde per 6256 Open Reading Frame del ceppo S288C di S. cerevisiae.
La preparazione della miscela e l’ibridazione sono state condotte come suggerito dal manuale “Agilent 60-mer oligo microarray processing protocol, April 2004, version 2.0”. 0,25 μg di RNA amplificato marcato con Alexa555 e 0,25 μg di RNA amplificato marcato con Alexa647 sono stati miscelati tra loro, con i control target e con il buffer di frammentazione (Agilent In situ Hybridization kit-plus) quindi la miscela è stata incubata al buio a 60°C per 30 minuti in un termomixer. Successivamente è stato aggiunto il buffer di ibridazione (Agilent In situ Hybridization kit-plus) e la soluzione è stata ibridizzata sul vetrino all’interno della cameretta di ibridazione (Agilent Technologies, Fig. 2.3). L’incubazione è stata eseguita a 60°C per 17 ore in una stufa (Agilent Technologies, Fig. 2.2), tenendo i vetrini in costante movimento, quindi sono stati effettuati due lavaggi consecutivi:
o Il primo incubando gli array per 10 minuti in una soluzione di SSC 6x e TritonX-102 0,005% (Agilent In situ Hybridization kit-plus) a temperatura ambiente;
o Il secondo incubando gli array per 5 minuti in una soluzione di SSC 0,1x e Triton X-102 0,005% (Agilent In situ Hybridization kit-plus) a 4°C.
I vetrini sono stati asciugati con aria compressa e inseriti nello scanner per la lettura della fluorescenza.
2.3.4. Acquisizione mediante scanner e analisi statistica
L’ acquisizione dell’immagine è stata effettuata mediante lo scanner a doppio laser 4000B (Axon-Instruments) con il relativo software GenePix 4.0. La potenza e la risoluzione del laser sono state impostate rispettivamente a 100% e 5 μm e il valore di intensità di ciascun pixel è stato calcolato dalla media dei valori ottenuti da due scansioni consecutive. La posizione del fuoco è stata regolata in modo da rendere
47 minimo il disallineamento tra le immagini dei segnali verde e rosso su ciascuno spot e il voltaggio dei tubi fotomoltiplicatori è stato adattato in modo da non saturare il segnale e da bilanciare le intensità registrate nei due canali1.
L’immagine ottenuta è stata sottoposta a sottrazione del background e normalizzazione, quindi utilizzata per la selezione dei geni differenzialmente espressi mediante il pacchetto d’analisi LIMMA (“LInear Model of MicroArray data”).
Per ciascun gene è stato determinato il valore di M (log2 (Irosso/Iverde)) e la significatività statistica, espressa sia come valore B (B-statistic o fattore di Bayes), sia come p-value.
⇒
Figura 2.2. Rappresentazione schematica dei passaggi d’ibridazione (Agilent Technologies). Il vetrino, composto nel nostro caso da due array identici, è stato inserito su un supporto metallico (base della camera di ibridazione), quindi sulla sua superficie è stata caricata la miscela di ibridazione. A questo punto la camera di ibridazione è stata chiusa e inserita in una stufa apposita in cui la camera viene scaldata e fatta ruotare a velocità costante per favorire il processo di ibridazione.
1 Questa procedura si basa sull’assunzione che solo una piccola parte dei geni attivamente trascritti sia differenzialmente espressa tra due campioni a confronto.
48 2.3.5. Inserimento dei geni differenzialmente espressi in vie cellulari note
I geni individuati come differenzialmente espressi sono stati inseriti in vie metaboliche e di segnalazione mediante lo strumento Pathway explorer, disponibile on-line all’indirizzo https://pathwayexplorer.genome.tugraz.at/ oppure mediante ricerca bibliografica. In Tab 2.1 sono elencati i database (con gli indirizzi web relativi) utilizzati a questo scopo:
Database Breve descrizione Indirizzo web
PubMed Servizio messo a disposizione dalla U.S.
National Library of Medicine mediante il quale è possibile accedere ad un gran numero di articoli di ricerca biologica e biomedica. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/q uery.fcgi?DB=pubmed MIPS-CYGD (Munich information center for protein sequences-Comprehensive Yeast Genome Database Fornisce informazioni di vario tipo sulle proteine
di S. cerevisiae, compresa la presenza di omologhi in altri organismi. http://mips.gsf.de/genre/proj/yeast/ SGD (Saccharomyce s Genome Database) Raccoglie informazioni di genetica e biologia molecolare del lievito
S. cerevisiae. http://www.yeastgenome.org/Submit Contents.shtml iHOP (Information Hyperlinked Over Protein)
Dato un gene o una proteina e un organismo, fornisce il
collegamento per articoli di vario tipo presenti su PubMed.
http://www.ihop-net.org/UniPub/iHOP/
Tabella 2.1. Strumenti Web utilizzati per ricavare informazioni sui geni differenzialmente espressi individuati dai microarray.
2.4. RT-PCR real time con SYBR GREEN
Come marcante è stato utilizzato il SYBR Green, molecola che si lega in maniera aspecifica al DNA a doppio filamento, formando un complesso (dsDNA-SYBRGreen) che emette luce verde (λmax= 522nm) quando eccitato da una luce blu (λmax= 498nm).
49 2.4.1. Disegno dei primer
Per ogni gene selezionato è stata disegnata una coppia di primer mediante il software Beacon Designer 4.0 (Premier Biosoft. International, Fig. 2.4). La sequenza nucleotidica dei trascritti è stata ricavata dal database SGD (“Saccaromyces Genome Database”, http://db.yeastgenome.org/cgi-bin/seqTools).
Per il disegno sono stati adottati i seguenti parametri: ♦ Lunghezza dell’ amplicone: 100-250 bp;
♦ Lunghezza dei primer: 18-24 bp;
♦ Temperatura di Melting (Tm): 55±2°C o 58±2°C
♦ ΔG max (cross-dimeri al 3’)= -2 kcal/mol; ΔG max (self-dimeri al 3’)= -2 kcal/mol; ΔG (hairpin al 3’)= -1 Kcal/mol.
Tra le varie coppie di primer proposte dal software la scelta è stata fatta in base:
♦ Alla presenza e alla stabilità delle strutture secondarie dei primer, in particolare al 3’ (dimeri e hairpin). Sono stati preferiti i primer che non formano strutture secondarie o che formano strutture con un’energia libera di attivazione (ΔG) bassa (in valore assoluto). Sono state evitate in particolar modo strutture secondarie al 3’ dei primer dato che queste possono fungere da innesco per la DNA polimerasi e quindi possono produrre un segnale aspecifico nella PCR real time con SYBR green.
♦ Alla percentuale in GC. Sono stati accettati valori compresi tra 35-60%. Le coppie di primer sono state analizzate ulteriormente in silico per individuare:
♦ Appaiamenti aspecifici al 3’. Per questa fase è stato utilizzato il programma di BLASTN fornito da SGD (http://seq.yeastgenome.org/cgi-bin/blast-sgd.pl), mediante il quale ciascun primer è stato analizzato contro tutte le Open Reading Frame (ORF) presenti nel database. Il cut-off è stato impostato al minimo (30), come consigliato dal programma per oligonucleotidi più corti di 30 bp.
♦ Strutture secondarie dell’amplicone in corrispondenza delle zone di annealing dei primer. La struttura secondaria dell’amplicone è stata determinata mediante lo strumento DNA mfold ( http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/cgi-bin/dna-form1.cgi, Zucker, 2003) specificando la temperatura e le concentrazioni di Na+ e Mg2+ (rispettivamente di 50 mM e 2,5 mM).
50 I geni selezionati per la validazione sono tutti a singolo esone, per cui non è stato possibile disegnare i primer su esoni diversi. L’eventuale amplificazione del DNA contaminante è stata perciò valutata mediante il “noRT” 2.
Infine le coppie di primer sono state disegnate, quando possibile, in una regione sul trascritto vicina a quella riconosciuta dalla sonda microarray, in modo da uniformare al massimo le due metodiche. E’ stata infatti osservata una minor concordanza tra le due tecnologie quando i primer per la PCR e le sonde dei microarray sono disegnate su regioni distanti, rispetto a quando sono disegnate in zone vicine (Etienne et al., 2004; Dallas et al., 2005).
Ciò potrebbe dipendere dalla presenza di trascritti alternativi (Dallas et al., 2005) o da altre cause, tra cui la probabilità che la porzione al 5’ dell’RNA messaggero sia meno rappresentata rispetto alla porzione 3’ per un difetto nella retrotrascrizione (la trascrittasi inversa non è in grado di procedere oltre una certa lunghezza) o per la presenza di degradazione parziale, che potrebbe interessare in maniera diversa le due estremità (Beelman et al., 1995; Newson et al., 2003).
2.4.2. Verifica del funzionamento dei primer e ottimizzazione delle condizioni di reazione
2.4.2.1. Retrotrascrizione
L’RNA è stato retrotrascritto utilizzando il QuantiTect Reverse Transcription kit (Qiagen). Il protocollo prevede una prima fase di eliminazione del DNA genomico seguita dalla retrotrascrizione dell’RNA a 42°C per 30 min mediante una combinazione di oligo-dT e random primer. Il cDNA ottenuto è stato aliquotato e conservato a -20°C fino al suo utilizzo.
2
noRT: controllo prodotto durante la reazione di retrotrascrizione in cui l’RNA viene incubato in assenza della trascrittasi inversa. Se il campione originale è contaminato da DNA genomico l’amplificazione del noRT (che non contiene cDNA) in PCR produce un segnale dovuto esclusivamente alla presenza del DNA genomico.
51 2.4.2.2. PCR “fredda”
Miscela di reazione per un campione:
Perpetual Taq DNA polimerasi 0,5 U 2,5U/μl (Vivantis)
AmpliBuffer 10X (Vivantis) 1x MgCl2 (50mM) 2,5mM dNTPs mix (10mM ciascuno) 200 μM primer 200 μM cDNA o H2O nei controlli negativi 2 μl
Protocollo di amplificazione:
1. Attivazione dell’enzima (hot start): 95°C, 2 minuti 2. 30 cicli di
• Denaturazione: 94°C, 20 secondi;
• Annealing: 58°C, 30 secondi;
• Estensione: 72°C, 20 secondi;
3. Estensione finale: 72°C, 7 minuti
Le sequenze dei primer utilizzati sono riportate in Tab. 2.2.
2.4.2.3. Ottimizzazione delle condizioni di reazione per la PCR real time
Per le reazioni di PCR real time è stata utilizzata la Brilliant®SYBR® GreenQPCR Master Mix (Stratagene), contenente una Taq DNA polimerasi hot-start, i nucleotidi, il SYBR green e il Mg2+ (2,5mM). A questa sono stati aggiunti la fluoresceina (Bio-Rad) alla concentrazione finale di 20nm, per normalizzare la fluorescenza nei diversi pozzetti della piastra durante la PCR e l’uracil-DNA glicosilasi (UNG, Fermentas) nella quantità di 50U su 2,5ml di Master-Mix 2X, per decontaminare i campioni da amplificati precedenti eventualmente presenti nella zona di lavoro.
Protocollo per l’attivazione dell’UNG (Fermentas): 95°C, 2 min.
Protocollo per l’attivazione della Taq DNA polimerasi (Stratagene): 95°C, 8 min. e 30 sec.
52 Tabella 2.2. Sequenze dei primer (F=forward; R=reverse)
2.4.2.3.1. Curve di diluizione e di denaturazione Protocollo A: 3 step 40 cicli: • Denaturazione: 95°C, 30 sec • Annealing: 58°C, 1 min • Estensione: 72°C, 1 min Protocollo B: 2 step 40 cicli: • Denaturazione: 95°C, 30 sec
• Annealing ed Estensione: 58°C, 1 min
PRIMER SEQUENZA RNR1 F 5’ CGAACCAGTCACTTCCAATATG 3’ RNR1 R 5’ TCATCCCAAATACCTAAATCAACC 3’ HHF2 F 5’ GCTAGAAGAGGTGGTGTCAAG 3’ HHF2 R 5’ GTTCAGTGTAAGTAACAGAGTCC 3’ POL30 F 5’ ACCCTGTCATTGCCATCTTC 3’ POL30 R 5’ TTAGCTCCGAACGTCAAGTC 3’ ADE1 F 5’ CCAAGGCTGAACAAGGTGAAC 3’ ADE1 R 5’ TTAGTGTCTGCGATGATGATGC 3’ PGK1 F 5’ TCACTCTTCTATGGTCGGTTTCG 3’ PGK1 R 5’ AATGGTCTGGTTGGGTTCTCC 3’ PDA1 F 5’ TTGCTAAGGACTGGTGTCTATC 3’ PDA1 R 5’ AATCTCGTCTCTAGTTCTGTAGG 3’ ORC5 F 5’ AAGGTAAGGCGGAGAGTGG 3’ ORC5 R 5’ CGTGAATATCGCTGAAGTAATCG 3’
53 Protocollo di denaturazione 1. denaturazione: 95°C, 1 min 2. rinaturazione: 55°C, 1 min 3. 80 cicli: • 55°C, 10 sec; • 56°C, 10 sec; • 57°C, 10 sec; • ... 2.4.3. PCR real time 2.4.3.1. Fase sperimentale
1 μg di ciascun campione dello stesso RNA utilizzato per i microarray è stato retrotrascritto. Per l’amplificazione è stata utilizzata una concentrazione di cDNA pari a 1/25 di quella ottenuta con la retrotrascrizione, che rappresenta la condizione intermedia nella curva di diluizione. Ciascuna coppia di primer è stata utilizzata alla concentrazione e con il protocollo di corsa stabiliti nella fase di ottimizzazione.
Le sequenze dei primer utilizzati sono riportate in Tab. 2.2. 2.4.3.2. Analisi dei dati
2.4.3.2.1. Valutazione della stabilità dei geni housekeeping
La stabilità dei geni housekeeping nei due campioni a confronto (BRCA1 wild-type e ciascuna delle cinque varianti missenso) è stata valutata utilizzando il metodo proposto da Vandesompele (Vandesompele et al., 2002).
Definizione di E (errore di normalizzazione con un singolo “housekeeping”)
Dati n geni housekeeping e m campioni, sia aij l’espressione del gene j nel campione i
misurata dalla PCR real time. Per ogni coppia di campioni p e q e per ogni combinazione di geni j e k , E si definisce nel seguente modo:
∀ j,k ∈ [1,n], ∀ p,q ∈ [1,m], j≠k e p≠q
apj aqk
Rjkpq
= x
(2.1) apk aqj54 se R<1, allora E=R-1, altrimenti E=R.
E rappresenta l’errore che si commette sul fold-change utilizzando un solo gene tra j e k come normalizzatore. Il valore E è stato determinato per ogni coppia di campioni p, q, cioè per ogni combinazione BRCA1wt/mutazione.
Definizione di M (misura di stabilità del gene housekeeping)
Per ogni combinazione di due geni housekeeping j, k si calcola il logaritmo in base 2 dei rapporti apj /apk (nel nostro caso p rappresenta il campione wild-type) e aqj /aqk (nel nostro
caso q rappresenta una delle cinque mutazioni). Quindi per ogni coppia wild- type/mutazione viene determinata la deviazione standard tra questi due valori (Vjk), definita variazione a coppia o “pairwise variation”, dal momento che viene calcolata considerando i geni a due a due.
Il valore M dell’housekeeping j è definito come la media aritmetica delle variazioni a coppia:
n
∑
VjkMj= k=1 (2.2) n-1
Più è piccolo il valore Mj, maggiore è la stabilità del gene j.
Il valore di M è stato calcolato sia per i geni housekeeping PGK1, PDA1 e ORC5 (n=3), sia per i geni bersaglio, considerati uno per volta insieme ai tre housekeeping (n=4), in ciascuna combinazione p/q.
2.4.3.2.2. Calcolo del fold-change
Ciascuna mutazione è stata considerata separatemente ed è stato calcolato il fold-change di ciascun gene rispetto al campione wild-type, mediante la formula di Pfaffl (Pfaffl et al., 2001) indicata di seguito (c=BRCA1 wild-type; m= mutazione):
(E
target)
(Ctc- Ctm)
Fold-change =
(2.3)55 Il denominatore o fattore di normalizzazione per ciascuna combinazione p/q è stato determinato calcolando la media geometrica (mgeom, Vandesompele et al., 2002) dei valori di (EΔCt) dei due housekeeping (HK) più stabili, secondo la formula:
mgeom=((E
HK1)
(Ctc- Ctm)x (E
HK2)
(Ctc- Ctm))
(1/2) (2.4)Se l’efficienza di amplificazione è del 100%, il valore di E è pari a 2 e la reazione è descritta dall’equazione (1.2).
Un’efficienza maggiore o minore indica che il numero di molecole aumenta di un numero maggiore o minore di due volte per ciclo per cui l’equazione diventa:
X(n)= X(no) x an (2.5)
In cui “a” può assumere valori minori o maggiori di 2. Ad esempio, se l’efficienza dei primer è del 96%, a diventa uguale a 1,96, mentre se l’efficienza è di 105% a è pari a 2,05, cioè il valore di a è dato dal valore di efficienza percentuale espresso come frazione di 1 sommato al valore uno. “a” rappresenta quindi il valore di E utilizzato nelle formule (2.3) e (2.4).
