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Capitolo 4: Parte sperimentale
4.1 SOLVENTI E REAGENTI
Chinuramina diidrobromuro: prodotto commerciale (Sigma-Aldrich). (±)-Epinefrina cloroidrato: prodotto commerciale (Sigma-Aldrich). (-)-Epinefrina-(+)-bitartrato: prodotto commerciale (Sigma-Aldrich). KH2PO4: prodotto commerciale (Fluka).
K2HPO4: prodotto commerciale (Fluka).
Sodioazide: prodotto commerciale, 99,99% (Aldrich).
MAO-A: BD Gentest™ Supersomes™ Human Monoamine Oxidase A (MAO-A) 5mg/mL. IAM.PC: prodotto commerciale (Regis Chemical Co.).
(+)-Anfetamina: prodotto commerciale.
(+)-Efedrina e (-)-Efedrina: prodotti commerciali..
(+)-Pseudo-Efedrina e (-)-Pseudo-Efedrina: prodotti commerciali.
Bio-Rad Protein Assay (Reattivo di Bradford): prodotto commerciale (BioRad). Catecolo: prodotto commerciale (Aldrich).
Acido gliossilico: prodotto commerciale (Aldrich). Na2SO4: prodotto commerciale (J.T.Baker).
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4.2 MISURE ANALITICHE E CHIMICO-FISICHE
Le analisi HPLC sono state eseguite utilizzando un sistema costituito da una pompa Jasco PU-980, collegata ad un rivelatore UV/CD Jasco CD-1595 ed un rivelatore fluorimetrico Jasco 821-FP.
Le prove di attività enzimatica sono state eseguite utilizzando un sistema costituito da una pompa quaternaria Jasco PU-2089 Plus, un autocampionatore Jasco AS-2057 Plus, un termostato Jasco CO-2060 Plus, un rivelatore Diode Array Jasco MD-910 ed un rivelatore fluorimetrico 821-FP.
Gli spettri di dicroismo circolare (CD) sono stati registrati con uno spettropolarimetro Jasco J710.
Gli spettri UV sono stati registrati con uno spettrofotometro Lambda 9 utilizzando cellette di quarzo.
Le misure di pH sono state eseguite con un pHmetro HANNA PH TESTER CHECKER 1 EUROPEAN VERSION.
Per la determinazione dell’ossigeno disciolto in soluzione è stato utilizzato un’ossimetro portatile (Hanna instruments, modello HI 9142), opportunamente modificato per permettere la determinazione dell’ossigeno “on-line”.
Gli spettri 1H-NMR e 13C-NMR a 200MHz sono stati registrati con uno spettrometro Varian GEMINI 200; gli spettri 1H-NMR e 13C-NMR a 300MHZ sono stati registrati con uno spettrometro Varian UNITY 300.
Le misure di GC-MS sono state effettuate con uno strumento Saturn2000, ad impatto elettronico (EI), con una colonna Rxi 5ms, 30m, 0.25nmID, 0.25µM.
4.3 METODI CROMATOGRAFICI
4.3.1 Analisi della miscela chinuramina/4-idrossichinolina
La miscela chinuramina/4-idrosssichinolina è stata analizzata mediante HPLC, con una colonna cromatografica Luna (Luna 5u Silice 250x4.6mm, Phenomenex) utilizzando come fase mobile una miscela 70:30 di PBS (20mM, pH=7.5) e metanolo al flusso di 1mL/min. La quantificazione dei soluti è stata effettuata con un detector diode-array (dal quale sono state estratte le lunghezze d’onda λ=224nm, λ=230, λ=316nm) e con un rivelatore fluorimetrico (λex=314nm, λem=350nm). Ogni miscela è stata analizzata in duplicato.
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4.3.2 Analisi della miscela adrenalina/DOPEGAL
La miscela adrenalina/DOPEGAL è stata analizzata mediante HPLC, con una colonna cromatografica Luna (Luna 5u Silice 250x4.6mm, Phenomenex) utilizzando come fase mobile una miscela 95:5 di PBS (20mM, pH=7.5) e metanolo al flusso di 1mL/min. La quantificazione dei soluti è stata effettuata con un detector diode-array (dal quale sono state estratte le lunghezze d’onda λ=224nm, λ=280) e con un rivelatore fluorimetrico (λex=280nm, λem=310nm). Ogni miscela è stata analizzata in duplicato.
4.4 IMMOBILIZZAZIONE DELL’ENZIMA
L’IMER contenente MAO-A è stato preparato utilizzando una colonna Amersham Tricorn 5/50 (5x50mm).
249.7 mg di IAM.PC sono stati pesati e lasciati in agitazione per 6h e 30min in 2.5 mL di tampone fosfato1 (PBS). La sospensione così ottenuta è stata utilizzata per impaccare la colonna. Nella colonna impaccata è stato quindi fatto circolare PBS per circa 45 min ad una velocità di flusso di 0.5 mL/min. Dopo i lavaggi 100µL di una sospensione di MAO-A (5mg/mL) sono stati disciolti in 2.4mL di PBS.
La soluzione è stata lasciata ricircolare nella colonna per 24 ore a flusso 0.1 mL/min. L’eluente dell’IMER è stato raccolto e la quantità di enzima residuo nella soluzione è stata determinata utilizzando un saggio per la determinazione delle proteine (saggio di Bradfor, BIORAD); successivamente è stato fatto circolare PBS e sono state raccolte 4 frazioni di lavaggio da 1mL, per la determinazione della percentuale di enzima assorbito. La resa di immobilizzazione è stata del 66.5%, corrispondente a 1.22µg di enzima per mg di IAM.PC.
4.4.1 Determinazione dell’attività catalitica dell’enzima non immobilizzato
Per la determinazione dei parametri cinetici dell’enzima non supportato sono state eseguite le prove riportate di seguito. I parametri cinetici sono stati determinati usando opportuni software2 di analisi, per l’applicazione di un approccio standard tipo Michaelis-Menten.
1 Dove non specificato diversamente 50mM e pH=7.5
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4.4.1.1 Substrato: chinuramina
Studio dell’andamento cinetico
Le prove sono state effettuate in fiale da 2mL utilizzando chinuramina (250µM, se non diversamente specificato) come substrato in PBS (100mM, pH=7,4) ed una concentrazione di enzima di 2µg/mL per un volume totale di soluzione di 200µL. Le varie prove sono state incubate a 37°C per tempi diversi. Le reazioni sono state interrotte aggiungendo 75µL di NaOH 2M e 25µL di HClO4 al 70%. Dopo centrifugazione a 5000 rpm, il surnatante è stato analizzato mediante HPLC ed è stata determinata la conversione del substrato.
Determinazione delle costanti cinetiche
Le prove sono state effettuate in fiale da 2mL utilizzando chinuramina a varie concentrazioni come substrato in PBS (100mM, pH=7,4) ed una concentrazione di enzima di 2 µg/mL per un volume totale di soluzione di 200µL. Le varie prove sono state incubate a 37°C per 30min. Le reazioni sono state interrotte aggiungendo 75µL di NaOH 2M e 25µL di HClO4 al 70%. Dopo centrifugazione a 5000 rpm, il surnatante è stato analizzato mediante analisi HPLC ed è stata determinata la conversione del substrato. I valori delle velocità sono stati normalizzati per 1µg di enzima.
4.4.1.2 Substrato: adrenalina
Studio dell’andamento cinetico
Le prove sono state effettuate in fiale da 2mL utilizzando l’adrenalina come substrato (250µM se non diversamente specificato; come substrato racemo è stato utilizzato il cloridrato, come substrato enantiopuro il sale bitartrato) in PBS (100mM, pH=7,4) contenente NaHSO3 (5mM) come stabilizzante per il DOPEGAL ed una concentrazione di enzima di 2 µg/mL, per un volume totale di soluzione di 200µL.
Le prove sono state incubate a 37°C per tempi diversi. Le reazioni sono state interrotte aggiungendo 75µL di NaOH 2M e 25µL di HClO4 al 70%. Dopo centrifugazione, il surnatante è stato analizzato mediante HPLC ed è stata determinata la conversione del substrato.
Determinazione delle costanti cinetiche
Le prove sono state effettuate in fiale da 2mL utilizzando l’adrenalina come substrato a varie concentrazioni (come substrato racemo è stato utilizzato il cloridrato, come substrato
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enantiopuro il sale bitartrato) in PBS (100mM, pH=7,4) contenente NaHSO3 (5mM) come stabilizzante per il DOPEGAL ed una concentrazione di enzima di 2 µg/mL, per un volume totale di soluzione di 200µL.
Le prove sono state incubate a 37°C per 30min. Le reazioni sono state interrotte aggiungendo con 75µL di NaOH 2M e 25µL di HClO4 al 70%. Dopo centrifugazione, il surnatante è stato analizzato mediante HPLC ed è stata determinata la conversione del substrato.
4.4.2 Determinazione dell’attività catalitica dell’enzima immobilizzato
La determinazione dell’attività catalitica dell’enzima immobilizzato è stata eseguita valutando la quantità di 4-idrossichinolina formata da una quantità nota di chinuramina iniettata nell’IMER, utilizzando come eluente tampone fosfato 50mM a pH=7.5 e variando il flusso di lavoro da 0.1mL/min a 0.4mL/min e quindi il tempo di contatto da 1.8min a 0.45min.
La temperatura dell’IMER è stata mantenuta a 37°C mediante un forno per colonne. Sono state preparate soluzioni a concentrazione nota di chinuramina (0.1mM, 0.5mM e 1mM) in tampone fosfato. L’attività enzimatica è stata quindi valutata effettuando iniezioni da 100µL delle soluzioni di substrato in duplicato a flusso 0,1mL/min, per un tempo di contatto di 1.8 min.
I parametri cinetici sono stati determinati utilizzando opportuni software di analisi, per l’applicazione di un approccio standard tipo Michaelis-Menten. I valori delle velocità sono stati normalizzati per 1µg di enzima.
4.5 PROVE DI INIBIZIONE
4.5.1 Prove di inibizione “on-line”
Gli effetti dei vari inibitori sull’attività enzimatica dell’enzima immobilizzato sono stati studiati secondo la seguente procedura: sono state preparate delle soluzioni a concentrazione costante di chinuramina (100µM) contenenti delle concentrazioni variabili di inibitore. 100µL di ogni soluzione sono stati iniettati in duplicato nell’IMER utilizzando come eluente tampone fosfato 50mM a pH=7.5.
I parametri cinetici sono stati individuati analizzando il segnale di fluorescenza in uscita dall’IMER (dipendente dalla sola concentrazione della 4-idrossichinolina) ed analizzando l’eluato tramite analisi HPLC.
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Per ogni substrato sono state costruite le curve di inibizione (attività vs concentrazione dell’inibitore). I parametri cinetici sono stati determinati usando opportuni software di analisi, per l’applicazione di un approccio standard tipo Michaelis-Menten.
4.5.2 Prove di inibizione “in batch”
L’inibizione con (D)-anfetamina è stata provata anche “in batch”. Il saggio è stato effettuato in eppendorf da 2mL utilizzando chinuramina 250µM, MAO-A 2µg/mL, PBS 50mM, pH=7.5 ed una concentrazione di anfetamina variabile, per un volume totale di soluzione di 200µL. Le prove sono state incubate a 37°C per 30min. Le reazioni sono state interrotte aggiungendo con 75µL di NaOH 2M e 25µL di HClO4 al 70%. Dopo centrifugazione, il surnatante è stato analizzato mediante HPLC ed è stata determinata la conversione del substrato.
4.6 ANALISI DEL CONSUMO DELL’OSSIGENO
Il consumo dell’ossigeno è stato seguito “on-line" aggiungendo in coda al sistema HPLC un sistema per la determinazione dell’ossigeno disciolto in soluzione.
È stato utilizzato un ossimetro portatile (Hanna instruments, modello HI 9142), strumento normalmente utilizzato per la determinazione dell’ossigeno disciolto per processi non in continuo, opportunamente adattato per permettere la misura in continuo; all’elettrodo è stato applicato un tappo a tenuta (schema 2.3), tramite il quale l’uscita del sistema HPLC veniva direttamente mandata sulla membrana dell’elettrodo; sul tappo era inoltre presente uno scarico per permettere il deflusso della soluzione.
La taratura dello strumento è stata effettuata tramite una soluzione acquosa satura di O2 ed una completamente disareata.
4.7 ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DELL’EUGENOLO
L’eugenolo è stato estratto dai chiodi di garofano tramite un’estrazione in corrente di vapore. 2g di chiodi di garofano sono stati macinati e messi in un Claisen insieme a 10mL di acqua. Il distillato è stato estratto con 3 porzioni di etere etilico da 5mL e seccato su Na2SO4 anidro. La miscela ottenuta è stata analizzata tramite 1H-NMR e GC-MS; quest’ultima tecnica ha evidenziato la presenza nella soluzione del derivato acetilato dell’eugenolo (77.5% eugenolo, 22.5% acetato).
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L’eugenolo è stato purificato tramite distillazione a pressione ridotta (P=16mmHg, T=156-158°C). Il distillato è stato quindi analizzato tramite GC-MS.
1H-NMR, CDCl
3, 300MHz: δ 3.34 (d, J=6.6 Hz, 2 H), 3.90 (s, 3 H), 5.11 (m, 2 H), 5.53 (s, 1 H), 5.98 (m, 1 H), 6.81 (m, 3 H).
