IL MODELLO DI MICHAELIS E MENTEN
Le altre ipotesi:
a) Nella reazione si raggiunge lo STATO STAZIONARIO
a1) la velocità di formazione di ES è eguale alla velocità del suo consumo
[ES] è costante nel tempo
L’ipotesi centrale:
la formazione del complesso ES
E + S ES E + P
b) La reazione di formazione del complesso ES è reversibile
E + S ES
K+1E + P
K-1
c) La reazione di formazione del prodotto è praticamente irreversibile ed è la più lenta del processo …..
c1) ….. e quindi
E + S
ES E + P
kcat Kcat << K-1v = K
cat[ES]
IL MODELLO DI MICHAELIS E MENTEN
La reazione di formazione del prodotto è praticamente irreversibile ed è la più lenta del processo …..
v = K
cat[ES]
Lo STATO STAZIONARIO ([ES] è costante nel tempo) implica che la velocità di formazione di ES è eguale alla velocità del suo consumo Formazione del complesso ES
E + S ES
K+1vf = velocità di formazione del complesso ES = k
+1[E] [S]
Degradazione del complesso ES
ES E + S
K-1
vd = velocità di degradazione del complesso ES = k
-1[ES] + kcat[ES]
ES E + P
Kcat
Allo STATO STAZIONARIO
vf = vd k
+1[E] [S] = (k-1 + kcat) [ES]
IL MODELLO DI MICHAELIS E MENTEN
Allo STATO STAZIONARIO
vf = vd k
+1[E] [S] = (k-1 + kcat) [ES]
Quindi [ES] [E] [S] = k+1 (k-1 + kcat) k+1 [ES] = [E] [S] (k-1 + kcat) Ma …. Etot = [E] + [ES] [E] = Etot - [ES]
e quindi
[ES] = (Etot - [ES]) [S]
(k-1 + kcat) k+1 [ES] = (k-1 + kcat) k+1Etot [S] (k-1 + kcat) - k+1 [ ES] [S] [ES] = (k-1 + kcat) k+1Etot [S] (k-1 + kcat) + k+1 [ ES] [S] [ES]
(
1 = (k-1 + kcat) k+1Etot [S] (k-1 + kcat) + k+1 [S])
[ES](
= (k-1 + kcat) k+1Etot [S] (k-1 + kcat) (k-1 + kcat)+k+1 [S])
IL MODELLO DI MICHAELIS E MENTEN [ES]
(
= (k-1 + kcat) k+1Etot [S] (k-1 + kcat) (k-1 + kcat)+k+1 [S])
[ES] = (k-1 + kcat) k+1Etot [S] (k-1 + kcat) (k-1 + kcat)+k+1 [S] = k+1Etot [S] (k-1 + kcat)+k+1 [S]Dividendo numeratore e denominatore per k+1 e semplificando:
[ES] = k+1Etot [S]/k+1 (k-1 + kcat)+k+1 [S] k+1 k+1 = Etot [S] (k-1 + kcat) + [S] K+1
Se ora indichiamo (k-1 + kcat)/k+1 = KM:
[ES]= Etot [S] KM + [S]
e ricordando che v = Kcat [ES]
v = kcat Etot [S] KM + [S]
IL MODELLO DI MICHAELIS E MENTEN
Quindi il modello teorico di Michaelis e Menten prevede che la variazione della velocità di reazione in funzione della concentrazione del substrato ([S]) segua la legge descritta dalla funzione:
v = kcat Etot [S] KM + [S]
Questa funzione è un’iperbole equilatera che descrive perfettamente la curva sperimentale:
IL MODELLO DI MICHAELIS E MENTEN (il significato di Vmax)
Inoltre, è possibile dare un significato fisico ai parametri dell’equazione di Michaelis e Menten.
v = kcat Etot [S] KM + [S]
Poiché è l’asintoto a cui tende la curva, che è la massima velocità della reazione, allora:
Vmax = kcat Etot
lim v [S] →∞ lim v [S] →∞ = lim [S] →∞ kcat Etot [S] KM + [S] =~ kcat Etot
Quando la concentrazione di substrato diventa molto alta (tende all’infinito) …
kcat Etot [S]
IL MODELLO DI MICHAELIS E MENTEN (il significato di KM)
Ancora, vediamo cosa accade nell’equazione di Michaelis e Menten quando la velocità v è la metà della velocità massima (Vmax/2):
v = Vmax [S] KM + [S]
Vmax/2 = Vmax [S]
KM + [S]
Quando v = Vmax/2 allora KM = [S]
1/2 = [S]
KM + [S]
2 [S]
KM + [S] = KM = [S]
KM è quindi numericamente eguale al valore della concentrazione di substrato alla quale si misura la metà della velocità massima
KM misura l’affinità dell’enzima per il substrato Più piccola è la KM maggiore è l’affinità
IL CALCOLO DEI PARAMETRI DELL’EQUAZIONE MICHAELIS E MENTEN KM E Vmax
[S] v
Per determinare KM e Vmax occorre: 1. Determinare il valore di v a ciascuna
concentrazione di S
Vmax ??
Vmax/2
KM
L’ACCURATEZZA DI QUESTO PROCEDIMENTO E’ BASSA: OCCORRE TROVARE METODOLOGIE ALTERNATIVE
3. Determinare il valore di Vmax (individuare l’asintoto della curva);
4. Determinare il valore di KM a partire dal valore di Vmax/2
2. Tracciare la “corretta” iperbole a partire dai punti sperimentali;
IL CALCOLO DEI PARAMETRI DELL’EQUAZIONE MICHAELIS E MENTEN KM E Vmax v = Vmax [S] KM + [S] 1/v = Vmax [S] KM + [S] 1/v = Vmax KM [S] 1 [S] Vmax [S] + 1/v = Vmax KM [S] 1 1 Vmax + L’equazione di Linewever-Burk o dei “doppi reciproci” L’equazione di Linewever-Burk è solo una delle possibili linearizzazioni
dell’equazione di Michaelis e Menten
L’ATTIVITA’ DEGLI ENZIMI E’ INFLUENZATA DA
DIVERSI FATTORI
1. Temperatura
2. Forza ionica del mezzo in cui avviene la reazione
3. pH
L’ATTIVITA’ DEGLI ENZIMI E’ INFLUENZATA DA DIVERSI FATTORI L’effetto del pH
L’effetto del pH dipende dalla sua influenza sullo stato di ionizzazione sui gruppi che partecipano al processo catalitico
Il pH può influenzare lo stato di ionizzazione di
gruppi che intervengono nella fase di trasformazione del substrato in prodotto
(effetto sulla kcat)
o in quella del legame del substrato (effetto sul KM)
L’ATTIVITA’ DEGLI ENZIMI E’ INFLUENZATA DA DIVERSI FATTORI L’interazione con molecole piccole – l’inibizione
[I]1 [I]2
[I]3
[I]4
L’ATTIVITA’ DEGLI ENZIMI E’ INFLUENZATA DA DIVERSI FATTORI Diversi modelli di inibizione
L’ATTIVITA’ DEGLI ENZIMI E’ INFLUENZATA DA DIVERSI FATTORI L’interazione con molecole piccole – GLI ENZIMI ALLOSTERICI
GLI ENZIMI ALLOSTERICI SONO CARATTERIZZATI DA UNA CURVA DELLA VELOCITA’ DI REAZIONE IN FUNZIONE DELLA [S]
Modello sequenziale
dell’allosterismo
(Koshland, Nemethy, Filmer
)
La variazione conformazionale può essere provocata o dal substrato stesso (effetti omotropici) o da molecole diverse dal substrato, che si legano in un altro sito (effetti eterotropici)
Modello simmetrico
dell’allosterismo
(Monod, Wyman,
Changeux)
La variazione conformazionale può essere provocata o dal substrato stesso (effetti omotropici) o da
molecole diverse dal substrato, che si legano in un altro sito (effetti
eterotropici)
Via biosintetica delle pirimidine
La regolazione da feedback e il controllo allosterico
Km = (k2+k-1)/k1
Km ≈ k-1/k1
Km ≈ k-1/k1
UNA MAPPA DEL METABOLISMO
UNA MAPPA SEMPLIFICATA DEL METABOLISMO COME SI CONTROLLA IL FLUSSO DEI METABOLITI?? ATTRAVERSO LA REGOLAZIONE DEGLI ENZIMI
L’ATTIVITA’ DEGLI ENZIMI DEVE ESSERE REGOLATA IN MODO CHE SIANO ATTIVI AL MOMENTO GIUSTO E NEL POSTO GIUSTO
STRATEGIE DI REGOLAZIONE Controllo allosterico
Forme multiple delle proteine enzimatiche Modificazione covalente delle proteine enzimatiche
Attivazione proteolitica
La regolazione da feedback e il controllo allosterico
La ATCasi è un enzima allosterico Il CTP (prodotto terminale della via metabolica) è un inibitore allosterico della ATCasi
