6. DISCUSSIONE E CONCLUSIONI
Nelle piante, la regolazione della trascrizione è mediata da un grande numero di fattori di trascrizione, oltre 1500 conosciuti, che controllano l’espressione di decine o centinaia di geni bersaglio in varie cascate, talvolta interconnesse. L’interazione tra i fattori di trascrizione e i geni che essi devono regolare avviene mediante il riconoscimento da parte dei primi di sequenze specifiche, dette motivi regolatori, a cui si legano. Nelle piante e in altri eucarioti superiori i motivi regolatori sono, in genere, localizzati nelle regioni non codificanti a monte dei geni, ma sono stati descritti anche negli introni e nelle regioni 5’/3’UTR, oltre che nelle regioni intergeniche a valle. Inoltre i motivi regolatori possono essere organizzati nei così detti cis-regulatory modules ciascuno dei quali definisce la cooperazione di diversi fattori di trascrizione (Vandepoele et al., 2006; Babu et al., 2004). Non tutti i motivi presenti sono tuttavia elementi funzionali attivi simultaneamente, l’interazione tra i fattori di trascrizione e i relativi siti di legame dipende dai casi specifici. Solo in questo modo sono determinati i tempi e la localizzazione dell’attività trascrizionale, per assicurare uno specifico pattern spazio-temporale (Vandepoele et al., 2006).
Una particolare attenzione è stata quindi rivolta alla ricerca di indicazioni che potessero suggerire possibili interazioni tra HaL1L ed altri fattori di trascrizione poiché la scoperta di motivi regolatori e la loro organizzazione nella sequenza nucleotidica di HaL1L è un importante primo passo per capire la sua regolazione.
Un interessante motivo, presente nella regione fiancheggiante al 5’ l’HaL1L e nell’introne, è WUSATA, che rappresenta la sequenza target per i fattore di trascrizione WUSCHEL (WUS) (Mayer et al., 1998). WUS è espresso nel centro di organizzazione dell'apice meristematico, ma è supposto essere decisivo anche nel programma embriogenico, inducendo la transizione da
stato vegetativo ad embriogenico e/o mantenendo l'identità delle cellule staminali embrionali.
In particolare, la sovraespressione di WUS porta alla repressione di LEC1, gene coinvolto nella maturazione dell’embrione promuovendo la differenziazione delle cellule embrionali negli stadi tardivi dello sviluppo. In A. thaliana, il fattore LEC1 forma con L1L il gruppo di peptidi di tipo LEC della famiglia delle proteine HAP3, che legano il motivo nucleotidico CCAAT. Non è ancora del tutto definita la differenza funzionale tra LEC1 e L1L durante lo sviluppo dell’embrione. Infatti, sebbene L1L e LEC1 normalmente mostrino funzioni non del tutto sovrapponibili durante l’embriogenesi delle piante, possono sostituirsi l’uno con l’altro quando espressi ectopicamente (Kwong et al., 2003). Attualmente, la sola evidenza per l’interazione tra WUS e altri geni è la presenza della sequenza di legame per questo gene nell’introne di AGAMOUS, un gene di identità degli organi fiorali (Lohmann et al., 2001). E’ stato proposto un “feedback loop” negativo che coinvolge WUS, il gene di identità del meristema fiorale LEAFY (LFY), BELLRINGER (BLR) e AGAMOUS, che si instaura nel meristema fiorale ed è responsabile per la soppressione di questo. La repressione della trascrizione costituisce probabilmente una strategia regolatrice fondamentale nello sviluppo sia delle piante che degli animali (Zwicker e Muller 1997), ed è qui interessante ricordare che il motivo di legame per il fattore BLR è stato individuato nella regione del promotore distale di HaL1L, indicando che anche questo gene possa far parte del suddetto “feedback loop” negativo.
Nella regione a monte del gene HaL1L, sono presenti anche altri interessanti motivi che sottintendono l’influenza degli ormoni sulla sua espressione. Sono stati infatti individuati:
i) ARFAT, ARF (Auxin Response Factor): TTGTCTC sul filamento (-) a + 12. Gli ARF sono fattori di trascrizione che si legano a sequenze TGTCTC di
promotori di geni che rispondono all’auxina e possono funzionare come repressori od attivatori trascrizionali (Tiwari et al., 2003).
ii) ABRETAEM (ABA responsive element): GGACACGTGGCA, sul filamento (-), a -80. Le variazioni nel livello dell’ABA e il disseccamento dell’embrione prima dell’entrata in dormienza sono due aspetti fondamentali del processo di maturazione del seme (Gutierrez et al., 2007). L’ABA ha un effetto positivo sulla sintesi delle sostanze di riserva attraverso l’attivazione di LEC1 e FUS3 e a sua volta, la trascrizione di FUS3 stimola la sintesi di ABA e reprime la biosintesi di GA.
L’espressione dei geni LEC è limitata soprattutto all’embriogenesi, dalla fase morfogenetica a quella di maturazione. Molte sono le evidenze che i geni LEC, insieme ad un altro fattore di trascrizione, ABI3 (Giraudat et al., 1992), siano i principali regolatori della fase di maturazione (Harada, 2001; Gutierrez, et al., 2007; Santos Mendoza, et al., 2008). Ad esempio embrioni con mutazioni che determinano la perdita di funzionalità dei geni LEC, sono intolleranti alla essicazione ed hanno problemi nell’accumulo delle sostanze di riserva. Queste osservazioni sostengono l’ipotesi che i LEC siano responsabili, direttamente o indirettamente, dell’attivazione dei geni che codificano le proteine di riserva ed altre macromolecole necessarie per la tolleranza all’essicazione e per il nutrimento dei semi (Harada et al., 2001; Ikeda-Iwai, 2006). Questo effetto è, almeno in parte, influenzato dal fine bilanciamento del rapporto ABA/GA. Al tempo stesso, i geni LEC aiutano a stabilire e rispondere all’alto rapporto ABA/GA che caratterizza la fase di maturazione dell’embriogenesi (Braybrook e Harada, 2008). E’ stato inoltre ipotizzato che i rapporti reciproci di ABA e GA, creino le condizioni fisiologiche per l’induzione alla competenza cellulare verso un nuovo destino grazie ad un meccanismo di regolazione che include i geni LEC (Kikuchi et al., 2006; Braybrook e Harada, 2008).
Le auxine sembrano, inoltre, essere un segnale pressoché universale per l’induzione dell’embriogenesi somatica anche se il meccanismo
molecolare coinvolto è ancora da definire. In fasi precoci dell’embriogenesi zigotica, una distribuzione ineguale delle auxine stabilisce la polarità dell’embrione (Weijers e Jürgens, 2005), ed è possibile che processi simili si verifichino anche nell’embriogenesi somatica. In accordo con questa idea, inibitori del trasporto dell’auxina sopprimono l’embriogenesi somatica (Cooke et al, 1993; Choi et al., 2001), sebbene in embrioni di Arabidopsis sia stato suggerito che un ruolo primario dell’auxina in questa fase sia la stimolazione della formazione del callo (Raghavan, 2004).
L’induzione dell’embriogenesi somatica e l’espressione dei geni LEC sono strettamente correlati, infatti, la loro espressione ectopica è sufficiente a modificare il destino di cellule di tessuti vegetativi o riproduttivi che assumono caratteristiche embriogeniche anche in assenza di auxine esogene o trattamenti stressanti, usualmente utilizzate in vitro per ristabilire la totipotenza embriogenica (Lotan et al., 1998; Stone et al., 2001, 2008; Kwong et al., 2003; Kagaya et al., 2005a, 2005b; Santos Mendoza et al., 2005; Baud et al, 2007). E’ probabile che il fabbisogno auxinico del sistema sia coperto dal positivo effetto che LEC2 ha sull’attivazione dei geni della biosintesi ormonale quali YUCCA2 (YUC2) e YUC4 (Stone et al., 2008). In molte specie, fra cui alcune del genere Helianthus, il concomitante accumulo di auxina e trascritti dei geni LEC a livello di specifici domini cellulari è tra i più precoci segnali associati all’induzione degli embrioni somatici, (Thomas et al., 2002; Fambrini et al., 2006; Braybrook e Harada 2008; Chiappetta et al., 2009).
La individuazione dei motivi ARFAT, ARF e ABRETAEM nel promotore di HaL1L costituiscono la prima evidenza di una interazione molecolare tra ABA ed auxina con i geni di tipo LEC. Nell’introne e nella regione al 3’ di HaL1L sono presenti, tra gli altri, anche dei motivi SUCROSE BOX, AAATTCATAAAATAAAAG. Il tipo di interazione fra zuccheri e geni LEC è ancora oscura. E’ stato proposto che in A. thaliana oltre all’auxina il ruolo di
LEC1 nel promuovere un destino cellulare embriogenico richieda saccarosio che, insieme ai regolatori di crescita, attiverebbe la divisione cellulare (Casson e Lindsey, 2006). L’assenza di saccarosio nel mezzo di coltura conduce infatti ad una completa perdita di penetranza del mutante turnip (trp) di Arabidopsis (un mutante gain-of-function di LEC1). Il fatto che l’auxina incrementi la penetranza della mutazione trp anche in assenza di saccarosio ha fatto tuttavia ipotizzare che i due effettori possano agire sull’espressione fenotipica di trp attraverso due distinti meccanismi. La complessità di queste interazioni è supportata dalla recente dimostrazione che LEC1 e L1L di Arabidopsis sono in grado di attivare il promotore di SUCROSE SYNTHASE 2 SUS2 in combinazione con una sub unità YC, NF-YC2, in presenza di ABA, attraverso l’interazione con elementi ABRE (Yamamoto et al., 2009). Questa attivazione risulta specifica per LEC1 e L1L, ed è inibita dall’espressione della sub unità NF-YA (Yamamoto et al., 2009). CONCLUSIONI
Il lavoro svolto in questa tesi costituisce una indispensabile e sostanziale base di partenza per iniziare uno studio funzionale del gene LEC1-LIKE in H. annuus.
In particolare, le analisi condotte mediante RT-PCR semiquantitative forniscono informazioni sulla localizzazione, rispetto ai diversi organi, e sui tempi della trascrizione di HaL1L. Questa risulta avvenire nell’embrione dove raggiunge un picco massimo a 5 giorni dall’impollinazione per poi decrescere, fino a non essere praticamente più rilevabile a 28 giorni.
Lo “screening” della libreria genomica di H. annuus ha permesso l’identificazione di 20 cloni i cui inserti BAC di DNA genomico dovrebbero contenere sequenze nucleotidiche codificanti membri della famiglia delle sub-unità B, alla quale appartiene lo stesso HaL1L, del fattore eterotrimerico NF-Y. Identificare i peptidi costituenti la famiglia è di fondamentale
importanza. Infatti, sebbene il fattore di trascrizione NF-Y sia stato ritenuto a lungo un trimero non inducibile, la sua funzionalità, pur rimanendo invariate le quantità degli mRNA per le sub-unità che lo costituiscono, sembra essere in realtà modulata da meccanismi post-trascrizionali. In A. thaliana, per tutte e tre le classi di sub-unità, esistono peptidi ubiquitari o tessuto specifici, ma non sono note le combinazioni con cui si associano i diversi elementi. Per la corretta interpretazione dell’espressione del gene HaL1L, è pertanto indispensabile un’indagine per decifrare gli schemi di assemblaggio delle sub-unità nei trimeri funzionali.
Il sequenziamento del BAC contenente l’HaL1L ha permesso di estendere la ricerca dei motivi di interazione con fattori di trascrizione che possono essere implicati nel complesso meccanismo di regolazione della sua trascrizione. Un dato interessante, ricavato da questa indagine, riguarda il ruolo degli ormoni, ABA e GA, nella regolazione dell’HaL1L. Viene, infatti, qui fornita la prima evidenza di una interazione molecolare tra questi fattori. Infine, tramite le tecniche della 5’ e 3’ RACE e RAGE, sono state ottenute informazioni sulla sequenza di un peptide omologo del fattore di trascrizione WUS il cui motivo di interazione è stato identificato sia nella regione al 5’ che nell’introne di HaL1L. WUS è un fattore cruciale nel centro di organizzazione dell’apice meistematico per il quale sono supposte interazioni con diversi altri fattori, ma evidenze stanno emergendo che lo indicano come decisivo anche nel programma embriogenico. Un progetto per la verifica della reale interazione HaL1L/WUS sarà iniziato e si svolgerà su diverse strategie sperimentali quali l’EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) e la Chip (Chromatin immunoprecipitation).
