LIETUVOS SVEIKATOS M

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS

LABORATORINĖS MEDICINOS BIOLOGIJA ANTROS PAKOPOS STUDIJOS

Darius Čereškevičius

UGT1A6 IR CYP2C9 GENŲ POLIMORFIZMŲ ĮTAKA VALPROATO METABOLIZMUI IR DOZEI

Baigiamasis magistro darbas

Darbo vadovas dr. Vacis Tatarūnas

2

TURINYS

ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 8

SANTRUMPOS ... 9

ĮVADAS ... 10

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 11

1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12

1.1. Valproato klinikinis panaudojimas ... 12

1.2. VPA farmakokinetika ... 12

1.3. VPA farmakodinamika ... 12

1.4. UGT izofermentai ... 13

1.5. UGT1A6 genetiniai pokyčiai... 13

1.6. Citochromai P450, CYP2C9 ekspresija ir funkcija ... 14

1.7. CYP2C9 genetiniai pokyčiai ... 14

1.8. VPA farmakogenetika. ... 15

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 17

2.1. Tyrimo planavimas ... 17

2.2. Tyrimo objektas ... 17

2.3. Tiriamųjų atranka ... 18

2.4. Valproinės rūgšties bei jos metabolitų nustatymas kraujo plazmoje ... 18

2.5. DNR išskyrimas ... 19

2.6. UGT1A6rs6759892, rs2070959, rs1105879 pokyčių nustatymas ... 20

2.7. CYP2C9 genotipavimas ... 22

2.8. Statistinė analizė ... 23

3. REZULTATAI ... 24

3.1. Tiriamųjų imties apibūdinimas priklausomai nuo lyties ir epilepsijos formos ... 24

3.2. Klinikinių, antropometrinių ir demografinių veiksnių įtaka VPA bei jos metabolitų koncentracijoms kraujo plazmoje ... 25

3.3. UGT1A6 rs6759892, rs2070959, rs1105879 pokyčių ir CYP2C9*2 ir *3 alelių dažnumas tirtųjų imtyje ... 29

3.4. UGT1A6 rs6759892, rs2070959, rs1105879 pokyčių įtakos VPA ir jos metabolitų koncentracijoms kraujo plazmoje analizės rezultatai ... 29

3.5. CYP2C9 pokyčių įtaka VPA ir jos metabolitų koncentracijoms kraujo plazmoje ... 33

4

SANTRAUKA

Darbo autorius: Darius Čereškevičius

Darbo pavadinimas: UGT1A6 ir CYP2C9 genų polimorfizmų įtaka valproato metabolizmui ir dozei

Valproinė rūgštis (VPA) yra vienas dažniausiai vartojamų prieš-epilepsinių vaistų pasaulyje. Šis preparatas yra ir vienas dažniausiai skiriamų vaistų vaikų epilepsijos gydymui. Terapinės VPA dozės skirtingiems pacientams yra nevienodos, o to priežastys šiuo metu nėra aiškios. Efektyvesniam valproinės rūgšties dozavimui taikomas vaisto koncentracijos kraujyje tyrimas, tačiau valproinės rūgšties terapinis poveikis ir šalutinių reiškinių rizika ne visuomet koreliuoja su kraujo plazmos VPA koncentracija.

Šio darbo tikslas ir uždaviniai buvo nustatyti klinikinių veiksnių ir genetinių pokyčių (bei šių pokyčių dažnumą) UGT1A6 ir CYP2C9 genuose bei VPA ir jos metabolitų koncentracijos kraujo plazmoje sąsajas su skiriamos valproinės rūgšties dozės dydžiu vaikams, sergantiems epilepsija. Tyrimo metu tirti n = 51 epilepsija sergantys vaikai (amžiaus mediana 9,5 metai, ribos nuo 3 iki 17 metų), gydyti valproine rūgštimi Lietuvos sveikatos moklsų universiteto ligoninės „Kauno Klinikos“, Neurologijos klinikoje. UGT1A6 pokyčiai nustatyti Sanger sekoskaitos metodu, CYP2C9 pokyčiai nustatyti tikro laiko PGR metodu. Valproinės rūgšties ir jos metabolitų koncentracijos nustatytos skysčių chromatografijos - masių spektrometrijos metodu.

Vyresni ir vyriškos lyties tiriamieji turėjo didesnes valproinės rūgšties gliukuronido koncentracijas kraujo plazmoje. Tirti UGT1A6 ir CYP2C9 pokyčiai neturėjo įtakos valproinės rūgšties ir jos metabolitų koncentracijoms kraujo plazmoje.

5

SUMMARY

Author: Darius Čereškevičius

Title: UGT1A6 ir CYP2C9 genų polimorfizmų įtaka valproato metabolizmui ir dozei

Valproic acid (VPA) is one of the most widely used antiepileptic drugs in the world. It is also one of the most frequently used to treat epilepsy in children. Valproic acid dosages required to achieve therapeutic effect vary among patients. Therapeutic drug monitoring is usually used to monitor valproic acids plasma levels, however, therapeutic effect and the risk of side effects show a poor correlation with the concentration of valproic acid.

The aim of this study was to determine the effect of clinical factors, genetic variations in UGT1A6 and CYP2C9 genes (and their frequencies) and valproic acid and it`s metabolite concentrations on the therapeutic dosage of valproic acid in children with epilepsy. In total n = 51 children (age median 9.5, range from 3 to 17 years of age) who were prescribed treatment with valproic acid in the Department of Neurology of the Hospital of Lithuanian University of Health Sciences „Kauno Klinikos“, were included in this study. Sanger sequencing was performed to determine genetic variations in UGT1A6. Real time PCR was used to determine genetic variations in CYP2C9. Patient blood plasma concentrations of valproic acid and it`s metabolites were determined with liquid chromatography - mass spectrometry.

Results: Older patients and male patients had higher concentrations of valproic acid-glucuronide. Genetic changes in UGT1A6 and CYP2C9 had no effect on plasma levels of valproic acid and it`s metabolites.

6

PADĖKA

7

INTERESŲ KONFLIKTAS

8

ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

9

SANTRUMPOS

VPA – valproinė rūgštis

AED – antiepilepsiniai vaistai (angl. anitiepileptic drugs) TE – Tris-EDTA

ESI – elektropurkštuvinė jonizacija (ang. electrospray ionization)

GABA –gama-aminosviestinė rūgštis (angl. gamma-Amminobutyric acid) VPAG – valproinės rūgšties gliukuronidas (angl. VPA-glucuronide) HDAC– histonų deacitilazė (angl. histone deacetylase)

10

ĮVADAS

Valproinė rūgštis (VPA) yra vienas iš dažniausiai vartojamų prieš epilepsinių vaistų pasaulyje dėl savo efektyvumo ir pigumo. VPA dažnai skiriama vaikams, sergantiems epilepsija. Pastaruoju metu VPA pradėta naudoti bipolinio sutrikimo gydymui. Naujausių tyrimų metu nustatyta, kad VPA inhibuoja histonų deacetilazes. Grindžiant šia savybe, VPA tyrinėjama kaip priešvėžinis preparatas, galintis skatinti apoptozę inicijuojančių genų raišką.

Terapinės VPA dydis labai skiriasi tarp pacientų. Dėl galimo šalutinio poveikio reguliariai atliekamas VPA koncentracijos kraujo plazmoje nustatymas. Tačiau, terapinis VPA efektyvumas ir šalutinių poveikių rizika blogai koreliuoja su VPA koncentracija kraujo plazmoje. Vienas iš šalutinių VPA poveikių yra hepatotoksiškumas ir šis šalutinis veiksnys dažniau pasireiškia vaikams.

Galimas skirtingo VPA efektyvumo individualiems ligoniams paaiškinimas – genetiniai pokyčiai (variantai), darantys įtaką, VPA metabolizmui. Mokslinėje literatūroje pateikiama informacija apie VPA metabolizmą, pernašą ir pačių receptorių genų polimorfizmą, kuris gali lemti VPA efektyvumą. Taip pat, svarbūs ir kiti veiksniai, kurie gali reikšmingai keisti VPA efektą. Skiriant VPA yra svarbus ligonio amžius, jo kūno masė, organų, dalyvaujančių vaisto metabolizme, būklė (kepenys, inkstai). Taigi, skiriant šį vaistą, vien tik įvertinti genetinius veiksnius, nepakanka. Mokslinėje literatųroje pateikiami prieštaringi duomenys apie VPA efektyvumo ir genetinių bei negenetinių veiksnių sąsajas.

11

DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Darbo tikslas: Nustatyti klinikinių veiksnių ir genetinių pokyčių: UGT1A6 c.19T>G (rs6759892),c.541A>G (rs2070959),c.552A>C (rs1105879),CYP2C9*2 alelio (rs1799853), ir CYP2C9*3 alelio (rs1057910)bei VPA ir jos metabolitų koncentracijos kraujo plazmoje sąsajas su skiriamos VPA dozės dydžiu vaikams, sergantiems epilepsija.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti klinikinių veiksnių įtaką VPA ir jos metabolitų koncentracijoms kraujo plazmoje.

2. Nustatyti UGT1A6 c.19T>G (rs6759892), c.541A>G (rs2070959) ir c.552A>C (rs1105879) bei CYP2C9*2, CYP2C9*3 pokyčius bei jų dažnumą epilepsija sergantiems pacientams.

12

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1. Valproato klinikinis panaudojimas

Valproinė rūgštis (VPA) yra vienas plačiausiai naudojamų prieš epilepsinių vaistų pasaulyje. Jis turi platų veikimo spektrą ir yra naudojamas kelių skirtingų epilepsijos formų gydyme. VPA taip pat naudojamas bipolinio sutrikimo, neuropatinio skausmo, migrenos gydyme [1]. Dėl VPA savybės inhibuoti histonų deacitilazę, atliekami tyrimai su VPA kaip adjuvantiniu preparatu gydant vėžį, žmogaus imunodeficito virusą bei kai kurias neurodegeneratyvines ligas [2], [3]. Klinikinių tyrimų metu nustatyta, kad VPA veikia panašiai kaip etosuksimidas (gydant absanso priepuolius) ar karbamazepinas, fenitoinas ir fenobabrbitalis (gydant generalizuotus toninius-kloninius ar dalinius priepuolius) [4]. Remiantis tyrimais, VPA yra laikomas kaip pirmo pasirinkimo vaistas daugelio formų idiopatinių ar simptomatinių generalzuotų epilepsijų gydymui [5].

1.2. VPA farmakokinetika

VPA absorbuojamas gastrointesninaliniame trakte (bioprieinamumas ≥80 proc.) [6]. Kraujo plazmoje didžioji dalis VPA yra susijungusi su baltymais (87-95 proc.), todėl VPA turi lėtą klirensą (6-20 ml/h/kg) [6], [7]. Vaikų, iki 10 metų amžiaus, VPA klirensas yra apie 50 proc. didesnis nei suaugusiųjų, vaikų, vyresniųnei 10 metų, VPA klirensas yra panašus į suaugusiųjų [8]. Mažiau nei 3 proc. nepakitusio VPA pašalinama su šlapimu [6]. VPA metabolizuojamas kepenyse veikiant šioms trims sistemoms: gliukuronidacijai (apie 50 proc. dozės), β-oksidacijai mitochondrijose (apie 40 proc. dozės) ir citochromų P450 medijuojamai oksidacijai (apie 10 proc. dozės) [6], [7].

VPA gliukuroniduoja UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT1A8, UGT1A9, UGT1A10 bei UGT2B7, tačiau didžiausią dalį gliukuronidacijos atlieka UGT1A6 bei UGT2B7 [6], [7]. VPA oksiduoja CYP2C9, CYP2A6 ir CYP2B6 iki 4-ene-VPA metabolito bei neaktyvių metabolitų 3-OH-VPA, 4-OH-VPA ir 5-OH-VPA [6], [7].

1.3. VPA farmakodinamika

13 [10]. GABA-erginės funkcijos sutrikimai stebėti gyvūnams sergantiems epilepsija [10] Žmoguje nustatyti mažesni kiekiai GABA, sutrikęs GABA jungimasis prie GABAA receptorių bei mažesni

GABA kiekiai cerebrospinaliniame skystyje [10].

VPA mažina N-metil-D-aspartato medijuojamą neuronų sužadinimą bei blokuoja Na2+

kanalus, Ca2+ _{kanalus (nuo įtampos priklausomus CACNA1C L, D, F, N ir L tipų) ir nuo įtampos}

priklausomus K2+ kanalus [9].

VPA veikia ir kaip histonų deacitilazių (HDAC) inhibitorius [11].Inhibuodama Ia, Ib ir IIa klasių HDAC [10]. VPA skatina, prieš tai HDAC nuslopintų, genų ekspresiją [10]. Dėlšios VPA savybės ji yra tyrinėjama kaip prieš-vėžinis preparatas [10], [11].

1.4. UGT izofermentai

UDP-gliukuronil transferazės (UGT) tai prie membranų prisitvirtinusių fermentų šeima, katalizuojanti gliukuronidacijos reakcijas [12]. UGT dalyvauja II fazes biotransformacinėse reakcijose kartu su sulfo transferazėmis, N-acetil transferazėmis, gliutiono S-transferazėmis ir metil transferazėmis [12]. Žmoguje UGT izofermentai dalyauja apie 40-70 proc. visų vartojamų vaistų metabolizme [12]. UGT daugiausiai ekspresuojami kepenyse, tačiau ir gastrointestinalinėje sistemoje, inkstuose, smegenyse, kasoje, placentoje ir nosies epitelyje [12].

UGT1A1, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A5, UGT1A6, UGT2B7 ir UGT2B7 ekspresija didėja su amžiumi vaikuose [13]. Vaikuose UGT1A6 pasiekia didžiauisią funkciją ties 14 mėnesiu [14]. Tačiau, taip pat, stebimas didelis UGT1A6 ir UGT2B17 aktyvumo padidėjimas paauglystės metu [13].Šis funkcijos padidėjimas galimas dėl kintančio hormoninio fono ir ksenobiotikų poveikio [15]. Vyruose stebimas didesnis UGT aktyvumas nei moteryse [16].

1.5. UGT1A6 genetiniai pokyčiai

UGT1A genų kompleksas yra apie 200 kb dydžio, 2q37 chromosomos lokuse ir susideda iš 9 aktyvių ir 4 neaktyvių pirmųjų egzonų (A1, A2P (neaktyvus), A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11P (neaktyvus), A12P (neaktyvus) ir A13P (neaktyvus) bei keturių bendrų egzonų [17]. Vienas iš 9 aktyvių egzonų bei keturi bendri egzonai gali būti naudojami transkripcijai [17]. UGT1A N terminalinis domenas, kurį koduoja pirmas egzonas, apsprendžia UGT1A specifiškumą substratui [17].

14 aprašyti bent 4 UGT1A6 aleliai: UGT1A6*1, UGT1A6*2, UGT1A6*3 ir UGT1A6*4. UGT1A6*1 alelis apibūdinamas kaip laukinio tipo, kuris koduoja įprasto aktyvumo UGT1A6 [18]. UGT1A6*2 alelį apsprendžia rs6759892, rs2070959, rs1105879 pokyčiai, kurie lemia didesnį UGT1A6 aktyvumą [19], [20].

1.6. Citochromai P450, CYP2C9 ekspresija ir funkcija

Citochromai P450 (CYP) medijuoja I fazės ksenobiotikų metabolizmą, katalizuodami kai kurių vaistų ir kitų lipofilinių ksenobiotikų oksidaciją [21], [22]. Žmoguje CYP1, CYP2 ir CYP3 šeimų fermentai dalyvauja vaistų metabolizme [30]. Kartu šie fermentai dalyvauja apie 80 proc. vaistų metabolizme [23]. CYP daugiausiai ekspresuojami kepenyse, tačiau, taip pat, ekspresuojami ir plonosios žarnos epitelyje [23].

CYP2C9 metabolizuoja silpnai rūgštines medžiagas, įskaitant ir: varfariną, fenitoiną, VPA, kandesartaną, lozartaną, glibenklamidą, tobultamidą, arachidono rūgštį, daugumą nesteroidinių prieš uždegiminių vaistų ir kaikuriuos steroidus [22].

Yra dideli skirtumai CYP ekspresijoje tarp lyčių, moteryse stebima didesnė CYP7A1, CYP3A7, CYP3A4 ekspresija, tačiau ne CYP2C9 [24]. Naujagimiuose CYP2C9 ekspresija siekia 1-2 proc. suaugusiųjų lygio, tačiau iki 5 mėnesio pasiekia suaugusiųjų lygį [25].

1.7. CYP2C9 genetiniai pokyčiai

CYP2 genų šeimą sudaro 16 genų, kurie išsidėstę grupėmis skirtingose chromosomose [29]. Trys didžiausios grupės: CYP2ABFGST (išsidėsčiusi 19q13.2 lokuse ir jame yra CYP2A6 ir CYP2B6), CYP2C9 (išsidėsčiusi 10q23.33 lokuse ir jai priklauso CYP2C8, CYP2C9, ir CYP2C19) bei CYP2D (išsidėsčiusi 22q13.1-2 lokuse ir jai priklauso CYP2D6) [29]. CYP2C9 yra apie 51 kb dydžio ir yra labiausiai ekspresuojamas genas CYP2C grupėje [22].

Iš viso yra žinoma 60 CYP2C9 alelių [26]. Du dažniausi, sumažėjusią funkciją lemiantys, aleliai europiečių populiacijoje yra *2 ir *3 [22]. CYP2C9*2 alelis lemia apie 30 proc. mažesnę fermento funkciją, o *3 alelis 90 proc. mažesnę funkciją [27]. CYP2C9*2 ir *3 lemia vieno nukleotido

pokyčiai: NM_000771.3(CYP2C9)c.430C>T (p.Arg144Cys) ir

15 1.8. VPA farmakogenetika.

Per pastaruosius keturis metus atlikta daug tyrimų susijusių su VPA farmakogenetika. Dauguma jų tyrė UGT1A6 pokyčių įtaką VPA metabolizmui, tačiau kitų darbų metu tirti ir UGT1A3, UGT2B7, GRIN2B, CYP2C9, CYP2A6, CYP2D6 bei CYP2C19.

Hung et. al.tyrė n = 162 epilepsija sergančius pacientus, gydomus VPA monoterapija ir pasiekusius stabilią traukulių kontrolę. Tirti 6 genų pokyčiai [29]. Tyrėjai nustatė, kad UGT1A6 pokyčių rs6759892, rs2070959 ir rs1105879 nešiotojams reikėjo didesnių VPA dozių nei laukinį tipą turintiems tiriamiesiems [29]. Be to, nustatytas GRIND2B rs890 pokytis kaip galintis turėti įtaką VPA dozei.

Weixing et. al. atlikto tyrimą su n = 111, epilepsija sergančių vaikų, iš kurių 31 turėjo atsparumą gydymui VPA. Tyrėjai nustatė, kad rs28898617 pokytis yra statistiškai reikšmingai susijęs su didesne kraujo plazmos VPA koncentracija (β koeficientas = 5,31, 95% pasikliautinumo intervalas = 0,78-9,83, p = 0,024) [30].

Chatzistefanidis et. al., tyrė UGT1A6 rs6759892, rs2070959, rs1105879 ir UGT2B7 rs7439366 pokyčių įtaką VPA kraujo plazmos koncentracijai n = 134 tiriamuosiuse (iš jų n = 58 vaikai). Tyrėjai nenustatė tirtų pokyčių įtakos VPA plazmos koncentracijai [31].

Shen et. al. tyrė n = 97, epilepsija sergančius ir VPA monoterapija gydomus, pacientus. Tyrėjai vertino UGT1A3 pokyčių (A17G, T31C, G81A, C133T, T140C ir A477G), UGT1A6 rs2070959, rs1105879 ir UGT2B7 pokyčių (G211T ir A268G) įtaką VPA dozavimui. Gauti tyrimo rezultatai parodė, kad UGT1A3 A17G ir C133T pokyčiai susiję su mažesne VPA koncentracija kraujo plazmoje. Taip pat nustatyta, kad tiriamieji turintys laukinio tipo UGT1A6 ar heterozigotinį rs2070959 pokytį, turėjo didesnes VPA koncentracijas kraujo plazmoje [32].

Algharably et. al. atliko tyrimą su n = 50 epilepsija sergančių vaikų, gydytų VPA monoterapija. UGT1A6 rs2070959, rs1105879 pokyčių nešiotojai turėjo mažesnes santykines VPA koncentracijas palyginus su laukinį genotipą turinčiais tiriamaisiais [33].

Ho et. al. tyrė in-vitro CYP2C9*2 ir CYP2C9*3 alelių įtaką VPA biotransformacijai į jos toksišką metabolitą 4-ene-VPA bei neaktyvius metabolitus 4-OH-VPA ir 5-OH-VPA. Heterozigotiniai CYP2C9*2 ar CYP2C9*3 aleliai lėmė 29 proc. lėtesnę VPA biotransformaciją į 4-ene-VPA, 28 proc. lėtesnę biotransformaciją į 4-OH-VPA ir 31 proc. lėtesnę biotransformaciją į 5-OH-VPA [21]. Homozigotiniai CYP2C9*2 ir CYP2C9*3 aleliai lėmė lėtesnę VPA biotransformaciją, į 4-ene-VPA, 4-OH-VPA ir 5-OH-VPA, 61 proc., 73 proc., ir 58 proc. atitinkamai [34].

17

2. TYRIMO METODIKA IR METODAI

2.1. Tyrimo planavimas

Planuojant tyrimą, 2015 metais, buvo įvertintas temos aktualumas analizuojant esamą literatūrą 2015 metais apie AED ir atliktus farmakogenetinius tyrimus susijusius su AED. Nuspręsta tirti VPA dėl šio vaisto vartojimo dažnumo, nepilnų ar prieštaringų duomenų apie genotipo įtaką vaisto metabolizmui bei dozavimui. Surinkta informacija aptarta su baigiamojo magistrinio darbo vadovu, konsultantu ir papildyta ar patikslinta pagal pateiktas rekomendacijas. Įvertinus esamas technines galimybes bei finansinius išteklius, buvo pasirinkti tinkamiausi šie tyrimo metodai: masių spektrometrija - VPA ir jos metabolitų nustatymui, tikro laiko PGR, Sanger sekoskaita genotipo tyrimams. Pasirinktos, komercinės silikagelio kolonėlės, skirtos, rūgštinių medžiagų ekstrakcijai iš kraujo plazmos, modifikuotas ir pritaikytas ekstrakcijos metodas VPA tyrimams. Tyrimams pritaikytas masių spektrometrijos metodas, kuris naudotas ankstesnių darbų su rūgštiniai dariniais, metu. Genotipo tyrimams pasirinkti komerciškai prieinami „TaqMan“ zondai bei metodika

(CYP2C9*2 ir *3 alelių ištyrimui). Sukurti pradmenys, bei protokolai UGT1A6 ištyrimui Sanger sekoskaitos metodu naudojantis „Primer3“ [36], „Oligo Analyzer“, „BLAT“ [37], „BLAST“ [38] programomis ir „Ensembl“ [39], „UCSC Genome Browser“ [40], „NCBI Refseq“ [41] duomenų bazėmis.

2.2. Tyrimo objektas

Tiriamąją grupę sudarė n = 51 vaikas sergantis epilepsija ir gydomas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės „Kauno Klinikų“, Neurologijos klinikoje.

18 2.3. Tiriamųjų atranka

Visiems tiriamiesiems buvo skiriamas gydymas VPA ilgiau nei 4 savaites ir skiriama terapinė dozė nesikeitė per pastarąsiais 4 savaites. Tiriamieji buvo nesirgę kepenų ligomis ir nevartojo vaistų, kurie paveiktų VPA klirensą ar metabolizmą, išskyrus kitus antiepilepsinius

vaistus. Pacientų kraujo mėginiai, informavus ir gavus sutikimą iš tiriamųjų tėvų ar globėjų, surinkti 2015-2017 metais.

2.4. Valproinės rūgšties bei jos metabolitų nustatymas kraujo plazmoje

Tyrimui naudota be trombocitė kraujo plazma. 200 µl kraujo plazmos sumaišyta su 10 µl vidinio standarto mišiniu (valproatas-d4 ir valproato-gliukuronidas-d6, 200 µg/ml). Mėginio ir vidinio standarto mišinys atskiestas iki 3 ml su 25 proc. acetonitrilu.

„Oasis Max“ (Waters, JAV) kolonėlės naudotos kietafazei ekstrakcijai. Kolonėlės kondicionuotos naudojant 3 ml acetonitrilo ir 3 ml 25 proc. acetonitrilo. Po kondicionavimo į kolonėlę perkelta 3 ml paruošto mėginio. Mėginių valymui naudota 3 ml 25 proc. acetonitrilo ir 3 ml acetonitrilo. Eliucijai naudota 1,3 ml acetonitrilo su 1 proc. skruzdžių rūgšties. Eliuatas

išgarintas po azoto srautu 50 °C temperatūroje. Rekonstitucijai naudota 50 µl metanolio ir 50 µl acetonitrilo.

Valproinės rūgšties bei jos metabolitų nustatymui kraujo plazmoje naudotas „Acquity H-class UPLC“ sistema (Waters, JAV) ir trigubo kvadrupolio tandeminis masių spektrometras (Xevo TQD, Waters, USA) su elektropurkštuvine jonizacija (ESI). Analizei naudotos „Acquity UPLC BEH C18“ kolonėlės (100 x 2.1 mm 1.7 µm). Analizei naudota 40 °C kolonėlės temperatūra. Gradientinė eliucija atlikta su mobilia faze susidedančia iš 0,1 proc aceto rūgšties vandens tirpalo (A tirpiklis) ir acetonitrilo (B tirpiklis), tėkmės greitis nustatytas ties 0,5 ml/min. Bendras analizės laikas 10 min, taikytas tirpiklių A ir B santykių profilis: iki 1 min – 75 proc., 8 min iki 8,5 min – 5 proc., nuo 8,5 min – 75 proc. Neigiamai ESI naudoti nustatymai: kapiliaro įtampa 2,5 kV, šaltinio temperatūra – 150 °C, išskaidymo temperatūra – 600 °C, išskaidymo dujų tėkmė – 1000l/h, kūgio tėkmė – 20l/h. Sandūros energija bei kūgio įtampa pritaikyta kiekvienam junginiui atskirai, 1 lentelė.

1.Lentelė. Sandūros energija, kūgio įtampa bei MRM tranzicijos.

Junginys Kūgio įtampa (V) Sandūros energija MRM tranzicija

VPA 30 10 30 10 143.1→143.1

VPA-d4 30 10 147.1→147.1

19

VPA-glcr-d6 40 30 334.2→158.2

3-OH-VPA 40 20 159.2→101.2

5-OH-VPA 40 20 159.2→113.2

VPA, VPA gliukuronidas, 3-OH-VPA, 5-OH-VPA irdeuterizuoti VPA bei VPA

gliukuronidovidiniaistandartaiidentifikuotipagal, jųmasėsirkrūvionulemtą, detekcijoslaiką (1 pav.) VPA irjosmetabolitaikiekybiškaiįvertintipagaljųirvidiniųstandartųkreiviųplotosantykį (1 pav.)

1.Pav. VPA bei jos metabolitų kraujo plazmoje nustatymo masių spektrograma.

2.5. DNR išskyrimas

DNR išskirta iš periferinio kraujo leukocitų naudojant „DNA Blood Mini Kit“ (Qiagen) DNR išskyrimo rinkinius. Darbo eiga:

1. Kraujo ėminiai centrifuguojami 15 min 1000 g.

2. Plazma perkeliama į atskirą centrifuginio tipo mėgintuvėlį.

3. 200 µl leukocitų perkeliama į centrifuginio tipo mėgintuvėlį ir sumaišoma su 20 µl proteazės.

4. Į mėgintuvėlį pridedama 200 µl buferio „AL“, 15 s sumaišoma sūkuriniu maišytuvu, ir inkubuojama 10 min 56 °C temperatūroje.

5. Mėginys trumpai nucentrifuguojamas ir į jį pridedama 200 µl 96 proc. etanolio, 15 s sumaišoma su sūkuriniu maišytuvu ir trumpai nucentrifuguojama.

6. Mišinys perkeliamas į silikagelio kolonėlę su 2 ml surinkimo mėgintuvėliu ir centrifuguojamas 1 min 6000 g.

7. Silikagelio kolonėlė perkeliama į naują 2 ml surinkimo mėgintuvėlį, į kolonėlę įpilama 500 µl „AW1“ buferio ir centifruguojama 1 min 6000 g.

20 9. Silikagelio kolonėlė perkeliama į naują 2 ml surinkimo mėgintuvėlį ir centifruguojama

1 min 20000 g.

10. Silikagelio kolonėlė perkeliama į naują 2 ml surinkimo mėgintuvėlį, į kolonėlę įpilama 200 µl „AE“ buferio, inkubuojama kambario temperatūroje 1 min ir centifruguojama 1 min 6000 g.

2.6. UGT1A6rs6759892, rs2070959, rs1105879 pokyčių nustatymas

UGT1A6 pokyčių nustatymui naudota Sanger sekoskaita. PGR reakcijai naudoti pradmenys sukurti naudojantis naudojantis „Primer3“ [1], „Oligo Analyzer“ , „BLAT“ [2], „BLAST“ [3] programomis ir „Ensembl“ [4], „UCSC Genome Browser“ [5], „NCBI Refseq“ [6] duomenų bazėmis. PGR reakcijai naudoti pradmenys pateikti 2 lentelėje (prie pradmenų 5‘ galo pridėtos M13 (-21) sekos). PGR mišinio sudėtis nurodyta 3 lentelėje, PGR termociklerio programa nurodyta 4 lentelėje.

2.Lentelė. Pradmenys naudoti PGR. Pradmens

pavadinimas Kryptis Seka

rs6759892_F Tiesioginė TGTAAAACGACGGCCAGTGGAGCCCTGTGATTTGGAGAGT rs6759892_R Atvirkštinė CAGGAAACAGCTATGACCCAGCAGCTTGTCACCTACAACC rs2070959_rs 1105879_F Tiesioginė TGTAAAACGACGGCCAGTTTTTCACAGACCCAGCCTTACC rs2070959_rs 1105879_R Atvirkštinė CAGGAAACAGCTATGACCGGGCTCCAACAAATTAACAAGG AAG

3. Lentelė. PGR mišinio sudėtis.

Medžiaga Kiekis (1 reakcijai)

PGR mišinys „AmpliTaq GOLD 360“ 6,25 µl

Pradmuo tiesioginis 10 µM

Pradmuo atvirkštinis 10 µM

Vanduo be nukleazių Iki 13,5 µl

DNR 20-50 ng

4. Lentelė. PGR termociklerio programa.

Temperatūra Laikas Ciklų skaičius

21 Po amplifikacijos, nepanaudoti pradmenys bei nukleotidai pašalinti naudojant

egzonukleazę bei krevečių šarminę fosfatazę. Reakcijos mišinio sudėtis nurodyta 5 lentelėje, termociklerio programa 6 lentelėje.

5. Lentelė. Amplifikuotų produktų apdorojimo reakcijos mišinio sudėtis.

Medžiaga Kiekis (1 reakcijai)

Krevečių šarminė fosfatazė „FastAP“ 0,25 µl

Egzonukleazė „ ExoI“ 0,125 µl

1x TE buferis 0,625 µl

PGR produktas 2 µl

6. Lentelė. Amplifikuotų produktų apdorojimo termociklerio programa.

Temperatūra Laikas

37 °C 15 min

80 °C 15 min

4 °C ∞

Sekoskaitos PGR atliktas naudojant „BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing“ rinkinį (Applied Biosystems, JAV). Reakcijos mišinio sudėtis nurodyta 7 lentelėje, termociklerio programa nrodyta 8 lentelėje.

7. Lentelė. Sekoskaitos PGR mišinio sudėtis.

Medžiaga Kiekis (1 reakcijai)

„BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing“ mišinys

0,5 µl

Pradmuo tiesioginis (M13 (-21)) 3,3 µM

5x Sekoskaitos buferis 2 µl

Vanduo be nukleazių Iki 10 µl

Apdorotas PGR produktas 1 µl

8. Lentelė. Sekoskaitos PGR termociklerio programa.

Temperatūra Laikas Ciklų skaičius

96 °C 1 min 1 96 °C 10 s 25 55 °C 5 s 60 °C 4 min 4 °C ∞ 1

22 solution“, reakcijos mišinys sumaišytas 30 minučių sūkuriniu maišytuvu ir nucentrifuguotas 2 min x1000 g.

Kapiliarinė elektroforezė atlikta naudojant „Applied Biosystems Genetic Analyzer 3500“ (Applid Biosystems, JAV). Naudotas 50 cm kapiliaras ir POP7 polimeras, Z dažų rinkinys. Naudoti gamintojo leidimo nustatymai: 1,6 kV injekcijos įtampa,3 s injekcijos laikas,5760 s leidimo laikas, 8,5 kV leidimo įtampa. 60 °C orkaitės temperatūra, 50 °C detekcijos celės temperatūra.

Duomenų analizei naudotos „Applied Biosystems KB Basecaller v1.4“ bei „novoSNP“ programos [7]. Gautos tiriamųjų sekos (2 ir 3 pav.) su programa „Applied Biosystems KB

Basecaller v1.4“ sulygintos su referentine UGT1A6 seka, paimta iš duomenų bazės „NCBI RefSeq“ [6], naudojantis programa „novoSNP“ [7].

2. pav. rs6759892 heterozigotinio pokyčio elektroforegrama.

3. Pav. rs2070959ir rs1105879heterozigotiniųpokyčiuelektroforegrama.

2.7. CYP2C9 genotipavimas

CYP2C9*2 ir CYP2C9*3 alelių nustatymui naudoti „TaqMan“ zondai (Applied Biosystems, JAV), reakcija vykdyta ir detekcija atlikta su „Rotor Gene Q“ sistema (Qiagen, Šveicarija). Reakcijos mišinio sudėtis nurodyta 9 letelėje, leidimo programa 10 lentelėje.

9. Lentelė. CYP2C9 genotipavimo mišinio sudėtis.

Medžiaga Kiekis

„TaqMan Universal PCR Master Mix“ PGR mišinys

(Applied Biosystems, JAV) 5 µl

Taqman zondų ir pradmenų mišinys 0,5 µl

Vanduo be nukleazių Iki 10 µl

DNR 20 ng

10.Lentelė. CYP2C9 genotipavimui naudota „Rotor Gene Q“ programa.

Temperatūra Laikas Ciklų skaičius Detekcija

95 °C 10 min 1 -

23

60 °C 90 s -

2.8. Statistinė analizė

24

3. REZULTATAI

3.1. Tiriamųjų imties apibūdinimas priklausomai nuo lyties ir epilepsijos formos

Tiriamųjų imtis surinkta atsitiktine tvarka neatsižvelgiant į tiriamojo lytį. Iš tirtų tiriamųjų n =24 buvo vyriškos lyties ir n = 27 moteriškos lyties. Amžiaus, svorio, ūgio ir skiriamos VPA dozės mediana, mažiausios ir dižiausio vertės ir jų pasiskirstymas tarp lyčių pateikiamos 11 lentelėje. Iš tirtų tiriamųjų 24 buvo vyriškos lyties 27 moteriškos lyties.Tiriamųjų amžius, svoris, ūgis ir skiriama terapinė VPA dozė statistiškai reikšmingai neišsiskyrė tarp lyčių, p vertės pateiktos atitinkamai: p = 0,326, p = 0,528, p = 0,346, p = 0,494.Tiriamųjų svoris ir ūgis statistiškai

reikšmingai susiję su skiriama VPA terapine doze (r = 0,515, p < 0,001 ir r = 0,406, p = 0,006 atitinkamai). Didėjant tiriamųjų svoriui ir ūgiui mažėja skiriama terapinė VPA dozė

tiriamiesiems.Tiriamųjų svoris (r = 0,885, p < 0,001) ir ūgis (r = 0,877, p < 0,001) statistiškai reikšmingi susiję su tiriamųjų amžiumi.

11 lentelė. Tiriamųjų amžiaus, svorio, ūgio ir skiriamos VPA dozės medianų pasiskirstymas tarp lyčių.

Tiriamųjų lytis Imties dydis

n (proc.)

Mediana, ribos (mažiausias, didžiausias) Tiriamųjų amžius (metai)

Vyrai Moterys Iš viso 23 (47,7) 28 (52,3) 51 (100) 10 (3-17) 9 (4-17) 9 (3-17) Tiriamųjų svoris (kg) Vyrai Moterys Iš viso 20 (47,6) 22 (47,8) 42 (100) 32 (15-66) 29 (16-71) 30 (15-71) Tiriamųjų ūgis (cm) Vyrai Moterys Iš viso 20 (46,5) 23 (53,5) 43 (100) 141,5 (100-177) 135 (104-175) 140 (100-177) Skiriama VPA dozė (mg/kg/parai)

25 priepuoliais, 1 tiriamajam – toniniais priepuoliais, 1 tiriamajam miokloniniais, toniniais-kloniniais priepuoliais, 1 tiriamajam - miokloniniais, toniniais-kloniniais, atoniniais, absansų priepuoliais, 1 tiriamajam – toniniais-kloniniais, absansų priepuoliais, 11 tiriamųjų – toniniais-kloniniais

priepuoliais, 1 tiriamajam – toniniais-kloniniais, daliniais sudėtingaisiais, daliniais su antrine generalizacija priepuoliais. Generalizuota epilepsija diagnozuota 23 tiriamiesiems, dalinė epilepsija diagnozuota 24 tiriamiesiems, 4 tiriamųjų epilepsijos forma nenurodyta. Tiriamųjų svorio, ūgio, amžiaus ir skiriamos VPA terpainės dozės medianų pasiskirstymas pagal diagnozuotą epilepsijos forma nurodyti 12 lentelėje.Tiriamųjų amžius, svoris, ūgis ir skiriama terapinė VPA dozė

statistiškai reikšmingai nesiskyrė nepriklausomai nuo diagnozuotos epilepsijos formos, p vertės pateiktos atitinkamai: p = 0,933, p = 0,471, p = 0,687, p = 0,269.

12 lentelė. Tiriamųjų amžiaus, svorio, ūgio ir skiriamos VPA dozės medianų pasiskirstymas pagal diagnozuotą epilepsijos formą.

Epilepsijos forma Imties dydis n (proc.) Mediana, ribos (mažiausias, didžiausias) Tiriamųjų svoris (kg) Generalizuota Dalinė Iš viso 20 (45,5) 24 (54,5) 44 (100) 29,5 (17-71) 33 (15-70) 31 (15-71) Ūgis (cm) Generalizuota Dalinė Iš viso 19 (45,2) 23 (54,8) 42 (100) 135 (104-175) 143 (100-177) 140 (100-177) Amžius (metai) Generalizuota Dalinė Iš viso 21 (46,7) 24 (53,3) 45 (100) 9 (4-17) 9,5 (3-16) 9 (3-17) Skiriama terapinė VPA dozė (mg/kg/parai)

Generalizuota Dalinė Iš viso 19 (44,2) 24 (55,8) 43 (100) 20 (12,5-41,7) 19,55 (7,14-28,8) 19,9 (7,14-41,7) 3.2. Klinikinių, antropometrinių ir demografinių veiksnių įtaka VPA bei jos metabolitų koncentracijoms kraujo plazmoje

Skiriama terapinė VPA dozė statistiškai reikšmingai susijusi su VPA (r = 0,32, p = 0,004) ir VPAG (r = 0,424, p = 0,004) koncentracijomis kraujo plazmoje, tačiau ne su 3-OH-VPA (r = 0,119, p = 0,436) ir 5-OH-VPA (r = 0,186, p = 0,22) koncentracijomis.

26 Nustatyta statistiškai reikšminga, mažo stiprumo koreliacija (r = 0,331, p = 0,025) tarp tiriamųjų svorio ir VPAG koncentracijos kraujo plazmoje: didesnis tiriamųjų svoris lėmė didesnes VPAG koncentracijas kraujo plazmoje.

13 lentelė. VPA ir jos metabolitų koncentracijų medianų pasiskirstymas tarp svorio grupių.

Tiriamųjų svoris n (proc.) Mediana, ribos

(mažiausias, didžiausias) VPA koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

< 30 kg ≥ 30 kg Iš viso 19 (41) 27 (59) 46 (100) 51,37, (16,35-142,73) 65,42, (31,16-81,29) 57,95, (16,35-142,73) VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

< 30 kg ≥ 30 kg Iš viso 19 (41) 27 (59) 46 (100) 0,56, (0.07-4.9) 1,56, (0,28-5.01) 0,94, (0.07-5.01) 3-OH-VPA (µg/ml) < 30 kg ≥ 30 kg Iš viso 19 (41) 27 (59) 46 (100) 0,061, (0,017-0,331) 0,076, (0,027-0,21) 0,075, (0,017-0,331) 5-OH-VPA (µg/ml) < 30 kg ≥ 30 kg Iš viso 19 (41) 27 (59) 46 (100) 0,036, (0,0013-0,361) 0,051, (0,0031-0,342) 0,043, (0,0013-0,361) Tiriamųjų VPA, VPAG, 3-OH-VPA ir 5-OH-VPA koncentracijų kraujo plazmoje medianos, mažiausios ir dižiausios vertės ir jų pasiskirstymas tarp ūgio grupių pateikiamos 14 lentelėje. Tiriamųjų ūgis neturėjo statistiškai reikšmingos įtakos VPA (r = 0,2, p = 0,193), 3-OH-VPA (r = 0,007, p = 0,962) ir 5-OH-3-OH-VPA (r = 0,073, p = 0,637) koncentracijai kraujo plazmoje. Nustatyta statistiškai reikšminga, mažo stiprumo koreliacija (r = 0,425, p = 0,004) tarp tiriamųjų ūgio ir VPAG koncentracijos kraujo plazmoje: didesnis tiriamųjų ūgis lėmė didesnes VPAG koncentracijas kraujo plazmoje.

14 lentelė. VPA ir jos metabolitų koncentracijų medianų pasiskirstymas tarp svorio grupių. Tiriamųjų ūgis n (proc.) _{(mažiausias, didžiausias)} Mediana, ribos

VPA koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml) <140 cm ≥ 140 cm Iš viso 20 (45) 24 (55) 44 (100) 52,27, (16,35-142,73) 58,02, (31,16-81,29) 57,95, (16,35-142,73) VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

27 ≥ 140 cm Iš viso 24 (55) 44 (100) 1,49, (0,28-5.01) 0,9, (0.07-5.01) 3-OH-VPA (µg/ml) < 140 cm ≥ 140 cm Iš viso 20 (45) 24 (55) 44 (100) 0,078, (0,017-0,331) 0,078, (0,027-0,21) 0,078, (0,017-0,331) 5-OH-VPA (µg/ml) < 140 cm ≥ 140 cm Iš viso 20 (45) 24 (55) 44 (100) 0,05, (0,0013-0,361) 0,0465, (0,0031-0,342) 0,047, (0,0013-0,361) Tiriamųjų VPA, VPAG, 3-OH-VPA ir 5-OH-VPA koncentracijų kraujo plazmoje

medianos, mažiausios ir didžiausios vertės ir jų pasiskirstymas tarp lyčių pateikiamos 15 lentelėje. VPA, 3-OH-VPA ir 5-OH-VPA koncentracijos kraujo plazmoje statistiškai reikšmingai nesiskyrė tarp vyrų grupės ir moterų grupės, p vertės pagal išvardintų metabolitų eiliškumą: p = 0,092, p = 0,749, p = 0,888. Vyrų tiriamųjų grupėje nustatyta statistiškai reikšminga (p = 0,025) didesnė VPAG koncentracija kraujo plazmoje.

15 lentelė. VPA ir jos metabolitų koncentracijų medianų pasiskirstymas tarp lyties grupių. Tiriamųjų lytis n (proc.) _{(mažiausias, didžiausias)} Mediana, ribos

VPA koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml) Vyrai Moterys Bendrai 25 (47) 26 (53) 51 (100) 61,57, (16,35-81,29) 53,15, (19,92-142,73) 57,94, (16,35-142,73) VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

Vyrai Moterys Bendrai 25 (47) 26 (53) 51 (100) 1,38, (0.07-4.95) 0,58, (0.09-5.01) 0,97, (0.07-5.01) 3-OH-VPA (µg/ml) Vyrai Moterys Bendrai 25 (47) 26 (53) 51 (100) 0,74, (0,0082-0,331) 0,091, (0,034-0,219) 75,27, (0,0082-0,331) 5-OH-VPA (µg/ml) Vyrai Moterys Bendrai 25 (47) 26 (53) 51 (100) 0,051, (0,0013-0,342) 0,0043, (0,0045-0,361) 0,044, (0,0013-0,361) Tiriamųjų VPA, VPAG, 3-OH-VPA ir 5-OH-VPA koncentracijų tiriamųjų kraujo plazmoje medianos, mažiausios ir dižiausios vertės ir jų pasiskirstymas pagal diagnozuotą epilepsijos formą pateikiamos 16 lentelėje. VPA ir jos metabolitų koncentracijos nebuvo

28 16 lentelė. VPA ir jos metabolitų koncentracijų medianų pasiskirstymas tarp diagnozuotos

epilepsijos formos grupių.

Epilepsijos forma n (proc.) _{(mažiausias, didžiausias)} Mediana, ribos VPA koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

Generalizuota Dalinė Iš viso 24 (48) 26 (52) 50 (100) 57,1 (19,92-81,3) 58,02 (16,35-142,73) 57,57 (16,35-142,73) VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

Generalizuota Dalinė Iš viso 24 (48) 26 (52) 50 (100) 0,9 (0,094-4,56) 1,15 (0,066-5,01) 0,94 (0,066-5,01) 3-OH-VPA (µg/ml) Generalizuota Dalinė Iš viso 24 (48) 26 (52) 50 (100) 0,061 (0,0082-0,33) 0,09 (0,025-0,22) 0,074 (0,0082-0,33) 5-OH-VPA (µg/ml) Generalizuota Dalinė Iš viso 24 (48) 26 (52) 50 (100) 0,039 (0,0032-0,26) 0,054 (0,0013-0,36) 0,047 (0,0013-0,36) Tiriamųjų VPA, VPAG, 3-OH-VPA ir 5-OH-VPA koncentracijų tiriamųjų kraujo plazmoje medianos, mažiausios ir dižiausios vertės ir jų pasiskirstymas amžiaus grupėse

pateikiamos 17 lentelėje. Nenustatytas statsitiškai reikšmingas ryšys tarp tiriamųjų amžiaus ir VPA koncentracijos kraujo plazmoje (p = 0,441), 3-OH-VPA koncentracijos kraujo plazmoje (p = 0,507) ir 5-OH-VPA koncentracijos kraujo plazmoje (p= 0,608). Nustatyta statistiškai reikšminga,

vidutinio stiprumo, priklausomybė tarp tiriamųjų amžiaus ir VPAG koncentracijos kraujo plazmoje (r = 0,495, p< 0,001).

17 lentelė. VPA ir jos metabolitų koncentracijų medianų pasiskirstymas tarp amžiaus grupių.

Amžiaus grupės n (proc.) Mediana, ribos

(mažiausias, didžiausias) Skiriama VPA dozė (mg/kg)

Iki 10 metų Vyresni nei 10 metų

Iš viso 26 (56,5) 20 (43,5) 46 (100) 20,77 (8,8-41,7) 16,15 (7,14-29,8) 19,55 (7,14-41,7) VPA koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

Iki 10 metų Vyresni nei 10 metų

Iš viso 26 (55,3) 21 (44,7) 47 (100) 54,5 (16,35-90,39) 58,25 (31,16-142,73) 57,79 (16,35-142,73) VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

Iki 10 metų Vyresni nei 10 metų

29 Iki 10 metų

Vyresni nei 10 metų Iš viso 26 (55,3) 21 (44,7) 47 (100) 0,071 (0,018-0,331) 0,076 (0,028-0,22) 0,076 (0,018-0,331) 5-OH-VPA (µg/ml) Iki 10 metų Vyresni nei 10 metų

Iš viso 26 (55,3) 21 (44,7) 47 (100) 0,04 (0,0013-0,269) 0,051 (0,0032-0,361) 0,044 (0,0013-0,361)

3.3. UGT1A6 rs6759892, rs2070959, rs1105879 pokyčių ir CYP2C9*2 ir *3 alelių dažnumas tirtųjų imtyje

UGT1A6 nustatytų pokyčių, epilepsija sergančiuose, vaikuose dažnumai pateikti 18 lentelėje. CYP2C9 nustatytų haplotipų dažnumai, epilepsija sergančiuose, vaikuose pateikti 19 lentelėje. Pokyčiai pasiskirstė pagal Hardy-Weinberg dėsnį.

18 lentelė. UGT1A6 pokyčių dažnumai epeilepsija sergančių vaikų imtyje. UGT1A6 Homozigotai n (proc.) Heterozigotai n (proc.) Laukinio tipo n (proc.) Iš viso (n, proc.) rs6759892 9 (18) 24 (48) 17 (34) 50 (100) rs2070959 6 (12) 23 (46) 21 (42) 50 (100) rs1105879 7 (14) 22 (44) 21 (42) 50 (100)

19 lentelė. CYP2C9 haplotipų dažnumai epilepsija sergančių vaikų imtyje.

CYP2C9 haplotipas n Proc.

*1 *1 33 64 *1 *2 8 16 *1 *3 8 16 *2 *3 1 2 *3 *3 1 2 Iš viso 51 100

3.4. UGT1A6 rs6759892, rs2070959, rs1105879 pokyčių įtakos VPA ir jos metabolitų koncentracijoms kraujo plazmoje analizės rezultatai

UGT1A6 pokyčiai, vertinant kiekvieno atskiro pokyčio įtaką, dedarė statistiškai

reikšmingos įtakos, VPA, VPAG, 3-OH-VPA ir 5-OH-VPA koncentracijai kraujo plazmoje (20 lentelė). Sekančioje lentelėje (21 lentelė) nurodyta VPA ir jos metabolitų koncentracijų kraujo plazmoje medianos, mažiausios ir dižiausios vertės ir jų pasiskirstymas pagal rs6759892 pokytį; 22 lentelėje nurodyta VPA ir jos metabolitų koncentracijų kraujo plazmoje medianos, mažiausios ir dižiausios vertės ir jų pasiskirstymas pagal rs2070959 pokytį, o 23 lentelėje nurodyta VPA ir jos metabolitų koncentracijų kraujo plazmoje medianos, mažiausios ir dižiausios vertės ir jų

30 20lentelė. UGT1A6 pokyčių įtaka VPA terapinei dozei bei VPA ir jos metabolitų

koncentracijoms kraujo plazmoje. VPA koncentracija VPAG koncentracija 3-OH-VPAkoncentracija 5-OH-VPA koncentracija Skirta VPA dozė rs6759892 r = 0,87 p= 0,55 r = 0,04 p= 0,778 r = 0,043 p= 0,764 r = 0,188 p= 0,185 r = 0,023 p = 0,877 rs2070959 r = 0,038 p= 0,795 r = 0,001 p= 0,992 r = 0,159 p= 0,266 r = 0,071 p= 0,62 r = 0,066 p = 0,662 rs1105879 r = 0,011 p= 0,939 r = 0,037 p= 0,796 r = 0,127 p= 0,376 r = 0,087 p= 0,542 r = 0,028 p = 0,852 21lentelė. VPA ir jos metabolitų koncentracijos priklausomai nuo UGT1A6 pokyčio rs6759892

pokyčio.

rs6759892 genotipas n (proc.) Mediana, ribos

(mažiausias, didžiausias) Skiriama VPA dozė (mg/kg)

GG GT TT Iš viso 18 (36) 24 (48) 8 (16) 50 (100) 55,62 (16,35-81,29) 55,98 (30,28-142,73) 69,04 (48,08-90,39) 57,57 (16,35-142,73) VPA koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

GG GT TT Iš viso 18 (36) 24 (48) 8 (16) 50 (100) 55,62 (16,35-81,29) 55,98 (30,28-142,73) 69,04 (48,08-90,39) 57,57 (16,35-142,73) VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

GG GT TT Iš viso 18 (36) 24 (48) 8 (16) 50 (100) 0,9 (0,066-4,95) 0,89 (0,275-4,56) 1,26 (0,094-5,01) 0,94 (0,065-5,01) 3-OH-VPA (µg/ml) GG GT TT Iš viso 18 (36) 24 (48) 8 (16) 50 (100) 0,075 (0,025-0,21) 0,073 (0,017-0,33) 0,105 (0,082-0,16) 0,074 (0,0082-0,33) 5-OH-VPA (µg/ml) GG GT TT Iš viso 18 (36) 24 (48) 8 (16) 50 (100) 0,035 (0,0013-0,34) 0,058 (0,0032-0,361) 0,073 (0,032-0,269) 0,047 (0,0013-0,36) 22lentelė. VPA ir jos metabolitų koncentracijos priklausomai nuo UGT1A6 pokyčio

rs2070959 genotipą.

rs2070959 genotipas n (proc.) _{(mažiausias, didžiausias)} Mediana, ribos Skiriama VPA dozė (mg/kg)

31 VPA koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

AA AG GG Iš viso 21 (42) 23 (46) 6 (12) 50 (100) 57,79 (16,35-142,72) 54,63 (30,28-79,71) 64,05 (48,08-90,39) 57,57 (16,35-142,73) VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

AA AG GG Iš viso 21 (42) 23 (46) 6 (12) 50 (100) 0,91 (0,066-4,95) 0,815 (0,275-5,01) 1,26 (0,094-4,9) 0,94 (0,065-5,01) 3-OH-VPA (µg/ml) AA AG GG Iš viso 21 (42) 23 (46) 6 (12) 50 (100) 0,088 (0,025-0,22) 0,073 (0,017-0,33) 0,073 (0,082-0,16) 0,074 (0,0082-0,33) 5-OH-VPA (µg/ml) AA AG GG Iš viso 21 (42) 23 (46) 6 (12) 50 (100) 0,04 (0,0013-0,36) 0,057 (0,0032-0,24) 0,073 (0,032-0,269) 0,047 (0,0013-0,36) 23 lentelė. VPA ir jos metabolitų koncentracijos priklausomai nuo UGT1A6 pokyčio

rs1105879 genotipą.

rs1105879 genotipas n (proc.) Mediana, ribos

(mažiausias, didžiausias) Skiriama VPA dozė (mg/kg)

TT TG GG Iš viso 21 (42) 22 (44) 7 (14) 50 (100) 57,79 (16,35-142,73) 53,9 (30,28-79,71) 69,84 (48,08-90,39) 57,57 (16,35-142,73) VPA koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

TT TG GG Iš viso 21 (42) 22 (44) 7 (14) 50 (100) 57,79 (16,35-142,72) 54,63 (30,28-79,71) 64,05 (48,08-90,39) 57,57 (16,35-142,73) VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

32 Tiriamieji, kurie neturėjo UGT1A6 pokyčių ar turėjo heterozigotinį (1 tiriamasis) arba homozigotinį (1 tiriamasis) pokytį rs6759892 priskirti UGT1A6*1*1 haplotipui. Tiriamieji, kurie turėjo heterozigotinius pokyčius rs6759892, rs2070959 ir rs1105879 arba homozigotinius

rs6759892 ir rs1105879 ir heterozigotinį rs2070959 (1 tiriamasis) priskirti UGT1A6*1*2 haplotipui. Tiriamieji , kurie turėjo homozigotinius UGT1A6 pokyčius rs6759892, rs2070959 ir rs1105879, priskirti haplotipui UGT1A6*2*2. Vertinant UGT1A6 haplotipo įtaką VPA ir jos metabolitų koncentracijoms kraujo plazmoje, nenustatyta statistiškai reikšminga įtaka (24 lentelė). VPA ir jos metabolitų koncentracijų medianos, mažiausios ir dižiausios vertės ir jų pasiskirstymaspagal UGT1A6 haplotipą pateikti 25 lentelėje.

24 lentelė. UGT1A6 haplotipų įtaka VPA ir jos metabolitų koncentracijoms. VPA koncentracija VPAG koncentracija 3-OH-VPAkoncentracija 5-OH-VPA koncentracija UGT1A6 haplotipas r = 0,015 p= 0,916 r = 0,069 p= 0,632 r = 0,127 p= 0,379 r = 0,12 p= 0,405 T

25 lentelė. VPA ir jos metabolitų koncentracijos priklausomai nuo UGT1A6 haplotipo. UGT1A6 haplotipas n (proc.) _{(mažiausias, didžiausias)} Mediana, ribos

Skiriama VPA dozė (mg/kg) *1*1 *1*2 *2*2 Iš viso 21 (42) 23 (46) 6 (12) 50 (100) 57,79 (16,35-142,73) 54,63 (30,28-79,71) 64,04 (48,08-90,39) 57,57 (16,35-142,73) VPA koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

*1*1 *1*2 *2*2 Iš viso 21 (42) 23 (46) 6 (12) 50 (100) 57,79 (16,35-142,73) 54,63 (30,28-79,71) 64,05 (48,08-90,39) 57,57 (16,35-142,73) VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

33 Vertinant UGT1A6 pokyčių įtaką VPA ir jos metabolitų koncentracijoms, atsižvelgiant į tiriamųjų amžių ir lytį nenustatyta statistiškai reikšminga įtaka (26 lentelė). VPA ir jos metabolitų koncentracijų kraujo plazmoje medianos, mažiausios ir didžiausios vertės bei jų pasiskirstymas pagal UGT1A6 pokyčius bei tarp amžiaus grupių, vyrų ir moterų grupių pateikti 27-34lentelėse (2 priedas).

26 lentelė. Amžiaus, lyties ir UGT1A6 pokyčių įtakos VPA ir jos metabolitų koncentracijoms r ir p vertės. Klinikinis veiksnys Genetinis pokytis VPA koncentracija VPAG koncentracija 3-OH-VPAkoncentracija 5-OH-VPA koncentracija Amžius rs6759892 r = 0,157 p= 0,296 r = 0,087 p= 0,563 r = 0,142 p= 0,345 r = 0,098 p= 0,518 rs2070959 r = 0,007 p = 0,965 r = 0,026 p = 0,861 r = 0,024 p = 0,874 r = 0,004 p = 0,977 rs1105879 r = 0,006 p = 0,968 r = 0,087 p = 0,565 r = 0,007 p = 0,963 r = 0,008 p = 0,96 UGT1A6 haplotipas r = 0,007 p =0,965 r = 0,026 p =0,861 r = 0,024 p = 0,874 r = 0,004 p = 0,977 Lytis rs6759892 r = 0,183 p = 0,213 r = 0,106 p = 0,472 r = 0,084 p = 0,571 r = 0,09 p = 0,545 rs2070959 r = 0,003 p = 0,985 r = 0,004 p = 0,976 r = 0,081 p = 0,586 r = 0,004 p = 0,979 rs1105879 r = 0,023 p = 0,878 r = 0,08 p = 0,588 r = 0,061 p = 0,682 r = 0,005 p = 0,972 UGT1A6 haplotipas r = 0,003 p = 0,985 r = 0,004 p = 0,976 r = 0,081 p = 0,586 r = 0,004 p = 0,979

3.5. CYP2C9 pokyčių įtaka VPA ir jos metabolitų koncentracijoms kraujo plazmoje

CYP2C9 pokyčiai individualiai neturėjo statistiškai reikšmingos įtakos VPA, VPAG, 3-OH-VPA ir 5-3-OH-VPA koncentracijoms tiriamųjų kraujo plazmoje (35 lentelė). Trisdešimt šeštoje lentelėje nurodyta VPA ir jos metabolitų koncentracijų kraujo plazmoje medianos, mažiausios ir dižiausios vertės ir jų pasiskirstymas pagal CYP2C9*2 pokytį, 37 lentelėje nurodyta VPA ir jos metabolitų koncentracijų kraujo plazmoje medianos, mažiausios ir dižiausios vertės ir jų

pasiskirstymas pagal CYP2C9*3 pokytį. Sudaryti CYP2C9 haplotipai pagal pokyčių įtaką fermento funkcijai; CYP2C9haplotipas neturėjo statistiškai reikšmingos įtakos VPA ir jos metabolitų

koncentracijoms kraujo plazmoje (35lentelė). VPA ir jos metabolitų koncentracijų kraujo plazmoje medianos, mažiausios ir didžiausiosvertės bei jų pasiskirstymas pagal CYP2C9 haplotipą

nurodomos38lentelėje.

34 VPA koncentracija VPAG koncentracija 3-OH-VPAkoncentracija 5-OH-VPA koncentracija CYP2C9*2 r = 0,037 p= 0,799 r = 0,124 p= 0,389 r = 0,121 p= 0,403 r = 0,186 p= 0,196 CYP2C9*3 r = 0,245 p= 0,089 r = 0,196 p= 0,173 r = 0,038 p= 0,795 r = 0,204 p= 0,155 CYP2C9 haplotipas r = 0,252 p = 0,08 r = 0,223 p = 0,123 r = 0,068 p = 0,641 r = 0,238 p = 0,1

36 lentelė. VPAir jos metabolitų koncentracijų pasiskirstymas pagal CYP2C9 *2. CYP2C9*2 genotipas n (proc.) _{(mažiausias, didžiausias)} Mediana, ribos

Skiriama VPA dozė (mg/kg) CC CT Iš viso 40 (82) 9 (18) 49 (100) 55,62 (16,35-81,29) 55,98 (30,28-142,73) 57,57 (16,35-142,73) VPA koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

CC CT Iš viso 40 (82) 9 (18) 49 (100) 57,57 (16,35-81,29) 50,45 (32,47-142,73) 57,34 (16,35-142,73) VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

CC CT Iš viso 40 (82) 9 (18) 49 (100) 0,9 (0,066-5,01) 1,41 (0,28-4,95) 0,91 (0,065-5,01) 3-OH-VPA (µg/ml) CC CT Iš viso 40 (82) 9 (18) 49 (100) 0,075 (0,0082-0,33) 0,052 (0,027-0,22) 0,074 (0,0082-0,33) 5-OH-VPA (µg/ml) CC CT Iš viso 40 (82) 9 (18) 49 (100) 0,056 (0,0013-0,34) 0,024 (0,0032-0,36) 0,044 (0,0013-0,36) 37 lentelė. VPAir jos metabolitų koncentracijų pasiskirstymas pagal CYP2C9 *3. CYP2C9*3 genotipas n (proc.) _{(mažiausias, didžiausias)} Mediana, ribos

VPA koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml) AA AC CC Iš viso 40 (82) 8 (16) 1 (2) 50 (100) 58,18 (30,28-142,73) 53,01 (16,35-74) 19,91 (19,91-19,91) 57,34 (16,35-142,73) VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

35 Iš viso 50 (100) 0,074 (0,0082-0,33) 5-OH-VPA (µg/ml) AA AC CC Iš viso 40 (82) 8 (16) 1 (2) 50 (100) 0,053 (0,0031-0,36) 0,032 (0,0013-0,088) 0,022 (0,022-0,022) 0,044 (0,0013-0,36) 38 lentelė. VPAir jos metabolitų koncentracijų pasiskirstymas pagal CYP2C9 haplotipą. CYP2C9 haplotipas n (proc.) _{(mažiausias, didžiausias)} Mediana, ribos

VPA koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml) *1*1/*1*2 *1*3 *2*3/*3*3 Iš viso 40 (82) 7 (14) 2 (4) 49 (100) 57,79 (16,35-142,73) 54,63 (30,28-79,71) 64,05 (48,08-90,39) 57,57 (16,35-142,73) VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

36

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Šio tyrimo metu pirmą kartą įvertintos VPAG koncentracijos vaikų kraujo plazmoje. Panašių kitų tyrėjų rezultatų, mums prieinamose, duomenų bazėse nepavyko surasti. Tyrimo rezultatai parodė, kad amžius ir lytis darė didžiausią įtaką VPA metabolizmui. Vyresnių tiriamųjų kraujo plazmoje nustatyta aukštesnė VPAG koncentracija, taip pat, tirtų vyrų grupėje kraujo plazmos mėginiuose nustatyta aukštesnė VPAG koncentracija nei moterų grupėje.

Tiriamųjų ūgis, svoris, amžius, skiriama terapinė VPA dozė vienodai pasiskirstė tarp lyčių grupių ir diagnozuotos epilepsijos formos grupių. Tiriamųjų ūgis ir svoris tiesiogiai priklausė nuo amžiaus: didėjant tiriamųjų amžiui, didėjo ūgis ir svoris. Skiriamai terapinei VPA dozei didžiausią įtaką darė pacientų svoris arba ūgis. Vistik, daugiau sveriantiems tiriamiesiems buvo skiriamos mažesnės terapinės VPA dozės. Literatūros teigimu [8], su amžiumi mažėja VPA pašalinimas per inkstus. Taigi, mano nuomone, jei svoris ir amžius, tiriamųjų grupėje, buvo tiesiogiai susiję tarpusavyje, tikėtina, kad atvirkštinę priklausomybę tarp tiriamojo svorio ir skiriamos terapinės VPA dozės nulėmė tiriamųjų amžius.

Suaugusiųjų VPA klirensas mažesnis nei vaikų [8]. Didesnį vaikų VPA klirensą lemia keletas veiksnių: didesnis santykinis paviršiaus plotas, didesnis laisvos VPA kiekis kraujo plazmoje, dėl mažesnio baltymų kiekio kraujo plazmoje, skirtingas metabolizuojančių fermentų aktyvumas [43]. VPA ir VPAG koncentracijos statistiškai reikšmingai susijusios su skiriama terapine VPA doze. Terapinės VPA dozės įtaka VPA ir VPAG koncentracijai buvo vidutinio stiprumo. Tai patvirtina, kad keletas veiksnių daro įtaką VPA ir VPAG koncentracijai kraujo plazmoje.VPA koncentracijos skirtumus gali lemti: VPA bioprieinamumas, klirensas, metabolizmas ir pernašos per hematoencefalinį barjerą efektyvumas. VPAG koncentracijai kraujo plazmoje tiriamųjų grupėje įtaką darė amžius ir tiriamųjų lytis. Su amžiumi didėja UGT ekspresija dėl kintančio hormoninio fono ir didėjančio kontakto su ksenobiotikais [16]. UGT ekspresiją kontroliuoja CAR, PXR ir ESR1 transkripcijos faktoriai [16]. Susiduriant su naujais ksenobiotikais didėja CAR ir PXR ekspresija, ko pasekoje skatinama UGT ekspresija [16]. Mano nuomone, CAR ir PXR transkripcijos faktoriai yra reikšmingesni UGT fermentų aktyvumui nei ESR1.

UGT1A6 pokyčiai rs6759892, rs2070959 ir rs1105879 pasiskirtė pagal Hardy-Weinberg dėsnį. Tirti UGT1A6 pokyčiai nedarė įtakos terapinei VPA dozei ir VPA bei jos metabolitų

37

rezultatais. Tačiau, Hung et. al, Shen et. al. tyrė suaugusius pacientus. Be to, mažesnę ar didesnę

UGT1A6 funkciją gali kompensuoti kiti UGT izofermentai, dalyvaujantys VPA metabolizme, taip pat, skirtingus tyrimų rezultatus gali lemti populiacijų skirtumai ir pokyčiai esantys nepusiausvyroje sankiboje tarpusavyje.

CYP2C9 metabolizuoja VPA į 5-OH-VPA. Todėl buvo nuspręsta tirti CYP2C9 pokyčius (alelius *2 ir *3). CYP2C9 pasiskirstė pagal Hardy-Weinberg dėsnį. Šie pokyčiai neturėjo įtakos skiriamai terapinei VPA dozei ar VPA ir jos metabolitų koncentracijoms kraujo plazmoje. Tikėtina, kad dėl per mažos tyrimo imties nenustatyta CYP2C9 pokyčių įtaka 5-OH-VPA metabolitui.

38

5. IŠVADOS

1. Nustatyta statistiškai reikšminga vidutinė priklausomybė amžiaus ir VPA gliukuronido koncentracijos kraujo plazmoje grupėse. Vyresniems vaikams nustatyta aukštesnė VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje. Vyriškos lyties tiriamiesiems nustatyta didesnė VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje.

2. UGT1A6 pokytis rs6759892 nustatytas 66 proc. tiriamųjų (48 proc. heterozigotai, 18 proc. homozigotai), pokytis rs2070959 nustatytas 58 proc. tiriamųjų (46 proc. heterozigotai, 12 proc. homozigotai) , pokytis rs1105879 nustatytas 58 proc. tiriamųjų (44 proc. heterozigotai, 14 proc. homozigotai) CYP2C9*1*1 haplotipas nustatytas 64 proc. tiriamųjų, CYP2C9*1*2 haplotipas – 16 proc. tiriamųjų, CYP2C9*1*3 haplotapas – 16 proc. tiriamųjų, CYP2C9*2*3 haplotipas – 2 proc. tiriamųjų ir CYP2C9*3*3 haplotipas 2 proc. tiriamųjų.

39

6. MOKSLINĖ REKOMENDACIJA

40

7. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Zawab ACarmody J. Safe use of sodium valproate. Australian Prescriber. 2014;37(4):124-127.

2. Terbach NWilliams R. Structure–function studies for the panacea, valproic acid. Biochemical Society Transactions. 2009;37(5):1126-1132.

3. Tan J, Cang S, Ma Y, Petrillo R, Liu D. Novel histone deacetylase inhibitors in clinical trials as anti-cancer agents. Journal of Hematology & Oncology. 2010;3(1):5.

4. Löscher W. Basic pharmacology of valproate. CNS drugs. 2002 Oct 1;16(10):669-94. 5. Perucca E. Pharmacological and therapeutic properties of valproate. CNS drugs. 2002

Oct 1;16(10):695-714.

6. Silva MF, Aires CC, Luis PB, Ruiter JP, Ijlst L, Duran M, Wanders RJ, De Almeida IT. Valproic acid metabolism and its effects on mitochondrial fatty acid oxidation: a review. Journal of inherited metabolic disease. 2008 Apr 1;31(2):205-16.

7. Ghodke-Puranik Y, Thorn C, Lamba J, Leeder J, Song W, Birnbaum A et al. Valproic acid pathway. Pharmacogenetics and Genomics. 2013;23(4):236-241.

8. Dutta S, Zhang Y, Conway J, Sallee F, Biton V, Reed M et al. Divalproex-ER pharmacokinetics in older children and adolescents. Pediatric Neurology. 2004;30(5):330-337.

9. Chateauvieux S, Morceau F, Dicato M, Diederich M. Molecular and Therapeutic Potential and Toxicity of Valproic Acid. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010;2010:1-18.

10. Treiman D. GABAergic Mechanisms in Epilepsy. Epilepsia. 2001;42:8-12. 11. Gottlicher M. Valproic acid defines a novel class of HDAC inhibitors inducing

differentiation of transformed cells. The EMBO Journal. 2001;20(24):6969-6978. 12. Guo Y, Hu C, He X, Qiu F, Zhao L. Effects of UGT1A6, UGT2B7, and CYP2C9

genotypes on plasma concentrations of valproic acid in Chinese children with epilepsy. Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 2012;.

41 14. Neumann E, Mehboob H, Ramírez J, Mirkov S, Zhang M, Liu W. Age-Dependent

Hepatic UDP-Glucuronosyltransferase Gene Expression and Activity in Children. Frontiers in Pharmacology. 2016;7.

15. Miyagi S, Collier A. The Development of UDP-Glucuronosyltransferases 1A1 and 1A6 in the Pediatric Liver. Drug Metabolism and Disposition. 2011;39(5):912-919.

16. Liu W, Ramírez J, Gamazon E, Mirkov S, Chen P, Wu K et al. Genetic factors affecting gene transcription and catalytic activity of UDP-glucuronosyltransferases in human liver. Human Molecular Genetics. 2014;23(20):5558-5569.

17. Saeki M, Saito Y, Jinno H, Sai K, Ozawa S, Kurose K et al. Haplotype structures of the UGT1A gene complex in a Japanese population. The Pharmacogenomics Journal. 2005;6(1):63-75.

18. Guillemette C. Pharmacogenomics of human UDP-glucuronosyl transferase enzymes. The Pharmacogenomics Journal. 2003;3(3):136-158.

19. Nagar S, Zalatoris J, Blanchard R. Human Ugt1a6 pharmacogenetics: identificationof a novel Snp, characterization of allele frequencies and functiona lanalysis of recombinant allozymes in human liver tissue and incultured cells. [Internet]. Insights.ovid.com. 2017 [cited 16 May 2017]. Availablefrom:

http://insights.ovid.com/pubmed?pmid=15284531

20. Krishnaswamy S. UDP Glucuronosyl transferase (UGT) 1A6 Pharmacogenetics: II. Functional Impact of the Three Most Common Non synonymous UGT1A6

Polymorphisms (S7A, T181A, and R184S). Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2005;313(3):1340-1346.

21. Dellinger R, Gomez Garcia A, Meyskens F. Differences in the Glucuronidation of Resveratrol and Pterostilbene: Altered Enzyme Specificity and Potential Gender Differences. Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 2014;29(2):112-119. 22. Crettol S, Petrovic N, Murray M. Pharmacogenetics of Phase I and Phase II Drug

Metabolism. Current Pharmaceutical Design. 2010;16(2):204-219.

23. Zanger U, Schwab M. Cytochrome P450 enzymes in drug metabolism: Regulation of gene expression, enzyme activities, and impact of genetic variation. Pharmacology & Therapeutics. 2013;138(1):103-141.

24. Wilkinson G. Drug Metabolism and Variability among Patients in Drug Response. New England Journal of Medicine. 2005;352(21):2211-2221.

42 26. Koukouritaki S. Developmental Expression of Human Hepatic CYP2C9 and

CYP2C19. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2003;308(3):965-974.

27. PharmGKB. (2017). The Pharmacogenomics Knowledge Base. [online] Available at: https://www.pharmgkb.org/ [Accessed 30 May 2017].

28. Lertkiatmongkol, P., Assawamakin, A., White, G., Chopra, G., Rongnoparut, P., Samudrala, R. and Tongsima, S. (2013). Distal Effect of Amino Acid Substitutions in CYP2C9 Polymorphic Variants Causes Differences in Interatomic Interactions against (S)-Warfarin. PLoS ONE, 8(9), p.e74053.

29. Ncbi.nlm.nih.gov. (2017). ClinVar. [online] Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar [Accessed 30 May 2017].

30. Hung C, Ho J, Chang W, Tai J, Hsieh T, Hsieh Y et al. Association of genetic variants in six candidate genes with valproic acid therapy optimization. Pharmacogenomics. 2011;12(8):1107-1117.

31. Feng W, Mei S, Zhu L, Yu Y, Yang W, Gao B et al. Effects of UGT1A6 and GABRA1 on Standardized Valproic Acid Plasma Concentrations and Treatment Effect in

Children With Epilepsy in China. Therapeutic Drug Monitoring. 2016;38(6):738-743. 32. Chatzistefanidis D, Lazaros L, Giaka K, Nakou I, Tzoufi M, Georgiou I et al.

UGT1A6- and UGT2B7-related valproic acid pharmacogenomics according to age groups and total drug concentration levels. Pharmacogenomics. 2016;17(8):827-835. 33. Xiongrong Shen, Jingbo Bi, Quankun Liu, Yingrong Chen et al. Effects of UGT1A3, UGT1A6, and UGT2B7 genetic polymorphisms on plasma concentration of valproic acid in south Chinese epilepsy patients. International journal of clinical and

experimental pathology. 2016;9(4):4513-4522.

34. Algharably EA, El Hamamsy M, Hassanein SM, Mohamed NA, Mahran MZ, El-Sawy MA, Badary OA. The effect of UGT1A6 polymorphism at two loci on the clinical response to valproic acid in epileptic children. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research. 2016 Oct 1;7(10):3986.

35. Ho P, Abbott F, Zanger U, Chang T. Influence of CYP2C9 genotypes on the formation of a hepatotoxic metabolite of valproic acid in human liver microsomes. The

Pharmacogenomics Journal. 2003;3(6):335-342.

43 37. Kent WJ. BLAT - the BLAST-like alignment tool. Genome Res. 2002

Apr;12(4):656-64

38. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 2015;44(D1):D7-D19.

39. Aken B, Ayling S, Barrell D, Clarke L, Curwen V, Fairley S et al. The Ensembl gene annotation system. Database. 2016;2016:baw093.

40. Kent WJ, Sugnet CW, Furey TS, Roskin KM, Pringle TH, Zahler AM, Haussler D. The human genome browser at UCSC. Genome Res. 2002 Jun;12(6):996-1006.

41. O’Leary NA, Wright MW, Brister JR, Ciufo S, Haddad D, McVeigh R, Rajput B, Robbertse B, Smith-White B, Ako-Adjei D, Astashyn A, Badretdin A, Bao Y, Blinkova O, Brover B, Chetvernin V, Choi J, Cox E, Ermolaeva O, Farrell CM, Goldfarb T, Gupta T, Haft D, Hatcher E, Hlavina W, Joardar VS, Kodali VK, Li W, Maglott D, Masterson P, McGarvey KM, Murphy MR, O’Neill K, Pujar S, Rangwala SH, Rausch D, Riddick LD, Schoch C, Shkeda A, Storz SS, Sun H, Thibaud-Nissen F, Tolstoy I, Tully RE, Vatsan AR, Wallin C, Webb D, Wu W, Landrum MJ, Kimchi A, Tatusova T, DiCuccio M, Kitts P, Murphy TD, Pruitt KD. Reference sequence

(RefSeq) database at NCBI: current status, taxonomic expansion, and functional annotation. Nucleic Acids Res. 2016 Jan 4;44(D1):D733-45.

42. novoSNP, a novel computational tool for sequence variation discoveryStefan Weckx, Jurgen Del-Favero, Rosa Rademakers, Lieve Claes, Marc Cruts, Peter De Jonghe, Christine Van Broeckhoven, Peter De RijkGenome Research (2005) 15(3):436-442. 43. Anderson G. Children Versus Adults: Pharmacokinetic and Adverse-Effect

44 1 Priedas

Prašome Jūsų užpildyti lentelę, informacijai apie pacientą/-ę:

___________________________________________________ _____________________ (paciento Vardas Pavardė) KK kodas

Pacientų atrankos kriterijai: 1) 2 m. - 17 m. vaikai imtinai.

2) gydomi ta pačia valproato doze ilgiau nei 4 savaites Prašome vienu sykiu paimti šiuos ėminius:

1) 2-5 metų vaikams - vienas, 6-17 metų vaikams - du vakutaineriai violetiniais kamšteliais (su EDTA), kuriuos per 1 val. nunešti į 52 kab. cokoliniame aukšte (atsakingas darbuotojas Darius arba Rima, viet. tel. 6741, 8:00-18:30 d.d.);

2) ir bendra tvarka atlikti biocheminius kepenų fermentų (AST, ALT) tyrimus. Gimimo data / /

Svoris kg Ūgis cm Lytis (apibraukti) V M

Epilepsijos forma (pažymėti) Generalizuota epilepsija, pasireiškianti: ⬜ miokloniniais priepuoliais,

⬜ toniniais-kloniniais priepuoliais, ⬜ atoniniais priepuoliais,

⬜ absansų priepuoliais. Epilepsija pasireiškianti:

⬜ daliniais paprastaisiais priepuoliais ⬜ daliniais sudėtingaisiais priepuoliais

⬜ daliniais priepuoliais su antrine generalizacija Įrašyti valproato dozę, kuri

skiriama ≥ 4 savaites Įrašyti datą kada pirmą kartą apskritai

pradėtas gydymas valproatu m. mėn. Įrašyti šiuo metu skiriamus kitus

antiepilepsinius vaistus bei kitus vaistus, jų dozes, gydymo trukmę (pvz.: Klonazepamas 500ug/kg, 3 mėn.)

Gydančio gydytojo spaudas ir parašas Mėginio paėmimo data ir laikas Mėginį paėmusio BPS spaudas ir parašas

2016 m. __________________d. ________ val.

45 2 priedas

27 lentelė. VPA ir jos metabolitų koncentracijų pasiskirstymas amžiaus grupėse pagal rs6759892 pokytį.

Tiriamųjų amžiaus

grupė rs6759892 genotipas n (proc.)

Mediana, ribos (mažiausias,

didžiausias) Iki 10 metų

VPA koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml) GG GT TT Iš viso 8 (17) 10 (21) 3 (6) 21 (44) 66,71 (49,91-81,29) 54,45 (31,16-142,73) 58,25 (49,85-74) 58,25 (31,16-142,73) VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

GG GT TT Iš viso 8 (17) 10 (21) 3 (6) 21 (44) 2,39 (0,37-3,27) 1,47 (0,4-4,46) 1,565 (0,361-5,01) 1,63 (0,361-5,01) 3-OH-VPA (µg/ml) GG GT TT Iš viso 8 (17) 10 (21) 3 (6) 21 (44) 0,092 (0,057-0,21) 0,074 (0,028-0,22) 0,093 (0,054-0,128) 0,076 (0,028-0,22) 5-OH-VPA (µg/ml) GG GT TT Iš viso 8 (17) 10 (21) 3 (6) 21 (44) 0,041 (0,019-0,342) 0,065 (0,0031-0,361) 0,065 (0,035-0,083) 0,051 (0,0032-0,361) 10 metų ir vyresni

VPA koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml) GG GT TT Iš viso 10 (21) 12 (26) 4 (9) 26 (56) 50,83 (16,35-75,58) 56,96 (30,28-79,71) 71,56 (48,08-90,39) 54,5 (16,35-90,39) VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

46 28 lentelė. VPA ir jos metabolitų koncentracijų pasiskirstymas amžiaus grupėse pagal

rs2070959 pokytį.

Tiriamųjų amžiaus

grupė rs2070959 genotipas n (proc.)

Mediana, ribos (mažiausias,

didžiausias) Iki 10 metų

VPA koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml) AA AG GG Iš viso 10 (21,3) 9 (19,1) 2 (4,3) 21 (44,7) 66,71 (49,91-142,73) 51,11 (31,16-74,69) 54,05 (49,85-58,25) 58,25 (31,16-142,73) VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

AA AG GG Iš viso 8 (17) 10 (21) 3 (6) 21 (44) 2,39 (0,37-4,46) 1,31 (0,4-5,01) 0,96 (0,361-1,565) 1,63 (0,361-5,01) 3-OH-VPA (µg/ml) AA AG GG Iš viso 8 (17) 10 (21) 3 (6) 21 (44) 0,12 (0,057-0,22) 0,074 (0,028-0,13) 0,073 (0,054-0,093) 0,076 (0,028-0,22) 5-OH-VPA (µg/ml) AA AG GG Iš viso 8 (17) 10 (21) 3 (6) 21 (44) 0,046 (0,019-0,361) 0,056 (0,0031-0,097) 0,05 (0,035-0,065) 0,051 (0,0032-0,361) 10 metų ir vyresni

VPA koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml) AA AG GG Iš viso 10 (21) 12 (26) 4 (9) 26 (56) 51,38 (16,35-75,58) 56,96 (30,28-79,71) 74,88 (48,08-90,39) 54,5 (16,35-90,39) VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

47 29 lentelė. VPA ir jos metabolitų koncentracijų pasiskirstymas amžiaus grupėse pagal

rs1105879 pokytį.

Tiriamųjų amžiaus

grupė rs1105879 genotipas n (proc.)

Mediana, ribos (mažiausias,

didžiausias) Iki 10 metų

VPA koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml) TT TG GG Iš viso 10 (21) 8 (17) 3 (6) 21 (44) 66,71 (49,91-142,73) 50,78 (31,16-74,69) 58,25 (49,85-74) 58,25 (31,16-142,73) VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

TT TG GG Iš viso 10 (21) 8 (17) 3 (6) 21 (44) 2,39 (0,37-4,46) 0,97 (0,4-3,82) 1,565 (0,361-5,01) 1,63 (0,361-5,01) 3-OH-VPA (µg/ml) TT TG GG Iš viso 10 (21) 8 (17) 3 (6) 21 (44) 0,12 (0,057-0,22) 0,063 (0,028-0,13) 0,093 (0,054-0,128) 0,076 (0,028-0,22) 5-OH-VPA (µg/ml) TT TG GG Iš viso 10 (21) 8 (17) 3 (6) 21 (44) 0,046 (0,019-0,361) 0,047 (0,0031-0,097) 0,065 (0,035-0,083) 0,051 (0,0032-0,361) 10 metų ir vyresni

VPA koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml) TT TG GG Iš viso 10 (21) 12 (26) 4 (9) 26 (56) 51,38 (16,35-75,58) 56,96 (30,28-79,71) 74,88 (48,08-90,39) 54,5 (16,35-90,39) VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

48 30 lentelė. VPA ir jos metabolitų koncentracijų pasiskirstymas amžiaus grupėse pagal

UGT1A6 haplotipą. Tiriamųjų amžiaus

grupė UGT1A6 haplotipas n (proc.)

Mediana, ribos (mažiausias,

didžiausias) Iki 10 metų

VPA koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml) *1*1 *1*2 *2*2 Iš viso 10 (21) 9 (19) 2 (4) 21 (44) 66,71 (49,91-142,73) 51,11 (31,16-74,69) 54,05 (49,85-58,25) 58,25 (31,16-142,73) VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)

*1*1 *1*2 *2*2 Iš viso 10 (21) 9 (19) 2 (4) 21 (44) 2,39 (0,37-4,46) 1,31 (0,4-5,01) 0,96 (0,361-1,565) 1,63 (0,361-5,01) 3-OH-VPA (µg/ml) *1*1 *1*2 *2*2 Iš viso 10 (21) 9 (19) 2 (4) 21 (44) 0,12 (0,057-0,22) 0,073 (0,028-0,13) 0,073 (0,054-0,093) 0,076 (0,028-0,22) 5-OH-VPA (µg/ml) *1*1 *1*2 *2*2 Iš viso 10 (21) 9 (19) 2 (4) 21 (44) 0,046 (0,019-0,361) 0,056 (0,0031-0,097) 0,05 (0,035-0,065) 0,051 (0,0032-0,361) 10 metų ir vyresni

VPA koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml) *1*1 *1*2 *2*2 Iš viso 11 (23) 12 (26) 3 (6) 26 (56) 51,38 (16,35-75,58) 56,96 (30,28-79,71) 74,88 (48,08-90,39) 54,5 (16,35-90,39) VPA gliukuronido koncentracija kraujo plazmoje (µg/ml)