Summary
Legionella pneumophila urinary antigen: diagnostic efficiency of a new quantitative Elisa test.
Background. To provide a rapid and suitable diagnosis of Legionella pneumophila serogroup1 (LPsg1) infection, a total of 160 urine
sam-ples were collected from 56 suspected or diagnosed patients, 8 from the VEQ-NEQAS Program, 96 from healthy blood donors, to detect LPsg1 urinary antigen by a new automated single device quantitative Elisa assay (Urinary Legionella Antigen Chorus, Diesse).
Materials and Methods. An immunochromatographic rapid test
(V-test Legionella, Coris) was used as a reference. Prevalence of specific IgM and IgG LPsg1 antibodies was assessed on 20 sera collected among the 56 patients with disease.
Results. Urinary Ag LPsg1 results of two direct tests from a total of
64 samples (patients and VEQ) showed an overall concordance of 90.6% (58 out of 64); all healthy blood donors resulted as negatives, as well (specificity 100%). Serology positive results (LPsg1 IgM and IgG antibodies) were revealed on 14 out of 20 diagnosed patients sera; instead, both urinary LPsg1 antigen tests resulted as positives in 18 out of 20 urine samples. The combined use of both LPsg1 urinary anti-gen and specific IgM antibodies improved the diagnostic efficiency
than a single test approach, showing 20 out 20 patients with at least one positive LPsg1 specific marker.
Conclusions. The new LPsg1 urine antigen quantitative Elisa assay
seems to be a useful tool for an early diagnosis of suspected LPsg1 infection and along the follow up of treated patients.
Introduzione
La legionellosi o Malattia dei Legionari (ML) è una severa forma di polmonite causata da Legionella pneumophila, clinicamente indistin-guibile da altre forme infettive polmonari. Dal punto di vista epidemio-logico, Legionella pneumophila sierotipo 1 (LPs1) è responsabile del 91% dei casi di legionellosi in USA (13) e del 95% dei casi in Europa (1, 14, 15). Per contro, in Australia e Nuova Zelanda Legionella
long-beachae è l’agente eziologico nel 50% dei casi (16).
La malattia si presenta con esordio brusco, febbre elevata, tosse non produttiva e insufficienza respiratoria, a cui si possono accom-pagnare stato confusionale con iposodiemia, vomito, diarrea, artro-mialgie. L’esame Rx rivela uno o più infiltrati essudativi localizzati in diverse aree polmonari (3), fornendo un dato suggestivo seppure non dirimente.
La diagnosi è un rompicapo per il clinico a causa di una serie di fattori negativi, tra i quali: la non specificità dei sintomi, la qualità dei test di laboratorio impiegati e, non ultimo, il pregiudizio di con-siderare l’infezione come “esotica” (14); viceversa, L. pneumophila è uno dei più comuni agenti eziologici di polmonite, responsabile del 1-5% delle infezioni comunitarie e del 5-10% di quelle nosocomiali (1, 5, 14, 15).
L’approccio diagnostico spesso intuitivo ha ricadute negative sul-l’appropriatezza delle richieste mirate per esami di laboratorio (14, 15). Per contro, l’ampio arsenale di test, diretti e indiretti, differenti per efficienza e significato diagnostico, generano talvolta difficoltà interpretative al clinico (1, 5).
Tra i test diretti, l’esame colturale, ritenuto il gold standard micro-biologico, permette l’isolamento di Legionella pneumophila in terreni selettivi arricchiti (BCYE), partendo da campioni di escreato, sangue, lavaggio bronco-alveolare; gli inconvenienti risiedono nei lunghi tempi di risposta e in una insoddisfacente sensibilità, variabile tra 10-80%, in relazione alla qualità del campione (1, 14).
Il test con tecnica di immunofluorescenza diretta (IFD) è più rapi-do, ma richiede personale esperto e una buona qualità del campione, spesso difficile da ottenere in pazienti con tosse non produttiva; inol-tre, è inficiato da cross-reazioni con Bacteroides fragilis, Pseudomonas spp ed ha una sensibilità stimata tra 25-60% (1, 5, 14, 15).
Correspondence: Gino Ciarrocchi, S.O. Laboratorio Analisi, Serologia, A.O. Ospedali Riuniti Policlinico Ancona, Via Conca 71, Ancona 60126, Italy. Tel.: +071.596.4251 - Fax: +071.596.4638.
E-mail: ciarrokki@libero.it
Key words: legionellosis, specificity, sensitivity, urinary antigen. Contributions: the authors contributed equally.
Conflict of interests: the authors declare no potential conflict of interests. ©Copyright G. Ciarrocchi et al., 2014
Licensee PAGEPress, Italy Microbiologia Medica 2014; 29:4890 doi:10.4081/mm.2014.4890
This article is distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Noncommercial License (by-nc 3.0) which permits any noncom-mercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the orig-inal author(s) and source are credited.
Antigene urinario di
Legionella pneumophila
: efficienza diagnostica di un
innovativo test Elisa quantitativo
Gino Ciarrocchi,
1Barbara Cinti,
1Marco d’Anzeo,
1Maria Enrica Cimarelli,
2Brunilde Berti,
3Helena Cerutti,
3Francesco Cocola,
3Andrea Ianniello,
3Claudia Soldatini
3 1S.O. Laboratorio Analisi, Sierologia, A.O. Ospedali Riuniti Policlinico Ancona, Italy;
2
S.O. Broncopneumologia, A.O. Ospedale Civile Jesi, Italy;
3Centro Ricerca e Sviluppo, Diesse
Diagnostics, Siena, Italy
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La legionellosi o Malattia dei Legionari (ML) è una severa forma di
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La legionellosi o Malattia dei Legionari (ML) è una severa forma di
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IgM and IgG LPsg1 antibodies was assessed on 20 sera collected amongNon-commercial
IgM and IgG LPsg1 antibodies was assessed on 20 sera collected among Urinary Ag LPsg1 results of two direct tests from a total of
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Urinary Ag LPsg1 results of two direct tests from a total of 64 samples (patients and VEQ) showed an overall concordance of
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64 samples (patients and VEQ) showed an overall concordance of 90.6% (58 out of 64); all healthy blood donors resulted as negatives, as
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90.6% (58 out of 64); all healthy blood donors resulted as negatives, as well (specificity 100%). Serology positive results (LPsg1 IgM and IgG
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well (specificity 100%). Serology positive results (LPsg1 IgM and IgG antibodies) were revealed on 14 out of 20 diagnosed patients sera;
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antibodies) were revealed on 14 out of 20 diagnosed patients sera; instead, both urinary LPsg1 antigen tests resulted as positives in 18
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instead, both urinary LPsg1 antigen tests resulted as positives in 18 out of 20 urine samples. The combined use of both LPsg1 urinary
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out of 20 urine samples. The combined use of both LPsg1 urinary anti-gen and specific IgM antibodies improved the diagnostic efficiency
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gen and specific IgM antibodies improved the diagnostic efficiency
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polmonite causata da
guibile da altre forme infettive polmonari. Dal punto di vista
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guibile da altre forme infettive polmonari. Dal punto di vista epidemio-logico,
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logico, Legionella pneumophila
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Legionella pneumophila
91% dei casi di legionellosi in USA (13) e del 95% dei casi in Europa
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91% dei casi di legionellosi in USA (13) e del 95% dei casi in Europa (1, 14, 15). Per contro, in Australia e Nuova Zelanda
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(1, 14, 15). Per contro, in Australia e Nuova Zelanda
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Correspondence: Gino Ciarrocchi, S.O. Laboratorio Analisi, Serologia, A.O.Non-commercial
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polmonite causata da
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The new LPsg1 urine antigen quantitative Elisa assay
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seems to be a useful tool for an early diagnosis of suspected LPsg1 infection and along the follow up of treated patients.
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infection and along the follow up of treated patients.
L’impiego di un test elisa per la ricerca qualitativa di antigene di
Legionella pneumophila sierotipo 1 ha rappresentato una rilevante
innovazione, ulteriormente migliorata con la versione del test rapido con tecnica immunocromatografica (1, 8, 9, 14, 15). Quest’ultimo ha in larga misura sostituito i test diretti, almeno nelle aree in cui Legionella
pneumophila sierotipo 1 ha più larga diffusione (13, 15, 16, 17, 18),
poiché l’antigene solubile appare precocemente, già dopo un giorno dall’inizio dei sintomi e persiste per giorni e settimane (6, 8, 9, 12, 14, 15). La sensibilità si attesta tra 70-100%, mentre la specificità sfiora il 100% (1, 14).
I metodi di amplificazione genica per la ricerca del DNA di Legionella
pneumophila costituiscono potenzialmente una rivoluzione
metodolo-gica, poiché sono in grado di poter rilevare tutte le specie. Tuttavia, l’e-secuzione dei test, oltre che essere laboriosa, risente di una mancata standardizzazione analitica nell’impiego diagnostico. Da ciò deriva l’ampia variabilità dei risultati ottenuti in differenti tipologie di studio, con evidenze di sensibilità che variano tra 11-100% (1, 4, 10, 14).
La recente introduzione del metodo Real Time PCR appare molto promettente, con eccellenti livelli di sensibilità e specificità (1, 3, 4); il suo impiego nel laboratorio diagnostico, con procedure semplificate e a basso costo, oltre lo stretto ambito della ricerca, costituirebbe un importante salto di qualità.
Tra i test indiretti, il presidio tradizionale della diagnosi di legionel-losi si basa sulla risposta immunologica specifica generata dall’infezio-ne, con comparsa di IgM dopo circa 10-14 gg e IgG prodotte dopo 4-6 settimane. La tardiva produzione anticorpale sembra ridurne le poten-zialità diagnostiche; tuttavia, nel variabile arco temporale di prima dia-gnosi, l’apparizione precoce di IgM può addirittura rivelarsi l’unico indizio specifico d’infezione (1, 5, 14, 15, 19, 20).
Con tale vasto potenziale a disposizione, due fattori sembrano irri-nunciabili: la rapidità di risposta al quesito clinico e l’efficienza dia-gnostica dei test impiegati.
Lo scopo dello studio è costituito dalla valutazione dell’utilità clinica di un nuovo test Elisa quantitativo a singolo dispositivo per la ricerca degli antigeni di Legionella pneumophila sierotipo 1 (LPs1) in campio-ni di urine, appartenenti a pazienti con sospetta o accertata legionello-si; verificare altresì se l’uso combinato di test diretto e ricerca sierolo-gica possa migliorare l’efficienza diagnostica.
Materiali e Metodi
Un totale di 160 campioni di urina furono esaminati per la ricerca di antigeni di LPs1: 56 urine raccolte da pazienti con sospetta o accertata diagnosi di legionellosi, 8 campioni di urine di riferimento del program-ma VEQ_NEQAS, UK, 96 urine fresche di donatori sani asintoprogram-matici.
Allo scopo è stato valutato un nuovo test Elisa quantitativo a singo-lo device, Legionella urinary antigen Chorus, Diesse Diagnostics, Siena (LPsg1 Ag Chorus), eseguito in completa automazione su ana-lizzatore Chorus (Valori di Riferimento: Index <0.6 negativo; 0.6-0.8 border-line; >0.8 positivo). Per confronto è stato impiegato il test immunocromatografico Legionella V-test (Coris Diagnostics, Francia), in uso di routine e precedentemente valutato verso l’analo-go test Legionella NOW, Binax, USA. Ricerca di anticorpi anti-LPs1 IgG e IgM è stata effettuata con distinti test Elisa (Legionella IgG, IgM Chorus, Diesse) in 20 campioni di siero raccolti tra i 56 pazienti in studio. I campioni di urina di 49/56 pazienti erano stati precedente-mente esaminati con V-test Coris e poi congelati a −30°C fino alla seduta analitica con il nuovo test; 7 urine fresche appartenevano a nuovi pazienti con accertamento di legionellosi. I 96 campioni di urina di donatori sani furono processati senza congelamento. Nessun campione di urina fu sottoposto a procedura di concentrazione o di trattamento termico.
Risultati
I risultati ottenuti con i due test per la ricerca diretta dell’antigene di LPs1 in 64 campioni di urina complessivi mostrano una concordan-za totale del 90.6% (58/64), quattro discordanze maggiori (V-test posi-tivo/Ag Chorus negativo), 2 discordanze minori (V-test border-line/Ag Chorus negativo). Il valore medio di Index in 43 urine positive fu 2.51 (range 0.6-9.0) (Tabella 1). I 96 campioni di urina di donatori sani risultarono tutti negativi sia al test Ag Chorus (specificità 100%) che al V-test, per confronto (concordanza 100%). Valore medio di Index=0.14 (range 0.1-0.3) (Tabella 2). I campioni di urina del programma VEQ-NEQAS, 5 positivi e 3 negativi, diedero risultati corretti e concordanti al 100% con entrambi i test. La ricerca di anticorpi IgG e IgM anti-LPs1 in 20 campioni di siero pervenuti, appartenenti al gruppo di 56 pazien-ti, risultò positiva per IgM e/o IgG+IgM in 14 casi; l’impiego del solo test diretto fornì positività in 18/20 casi (Tabella 3). L’impiego combinato della ricerca antigene e del dosaggio anticorpale, corredato di dati cli-nici suggestivi, ha dimostrato la presenza di almeno un marcatore spe-cifico in tutti i 20 pazienti esaminati (Tabella 4). In due casi di legio-nellosi con isolamento microbiologico di LPs1, fu rivelato antigene uri-nario e presenza di anticorpi IgM e IgG nel siero.
Discussione
Le indagini di laboratorio nelle infezioni da L. pneumophila rive-stono un ruolo molto rilevante nella definizione clinica della malattia (1, 5, 14, 15), in particolare, il test per la ricerca di antigeni urinari di LPsg1 ha trovato ampia diffusione, sostituendo, di fatto, l’esame col-turale. Il nuovo test Elisa a singolo device ha fornito risultati
quanti-[Microbiologia Medica 2014; 29:4890] [page 41]
Article
Tabella 1. Confronto tra test Ag LPs1 Chorus e V-test Coris in 64 campioni di urina.
Ag Leg Coris Ag Leg Chorus Concordanti Discordanti Lotto 3100D1408 Lotto 020/052 Pos Pos 43 -Neg Neg 13 -Bl Bl 1 -Pos Bl 1 -Pos Neg - 4 Bl Neg - 2 Neg Bl - -Neg Pos - -Totale 58 6
Valore medio index campioni positivi=2.51 Concordanza totale=58/64=90.6%
Discordanza totale (maggiori+minori)=6/64=9.4%
Tabella 2. Ricerca di Ag LPs1 urinario in 96 donatori sani asin-tomatici.
Negativo Positivo Clinica
Ag Leg Chorus 96 0 Negativa
V-test Coris 96 0 Negativa
Concordanza=100% Specificità=100
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stono un ruolo molto rilevante nella definizione clinica della malattia
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stono un ruolo molto rilevante nella definizione clinica della malattia
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Lo scopo dello studio è costituito dalla valutazione dell’utilità clinicaNon-commercial
Lo scopo dello studio è costituito dalla valutazione dell’utilità clinica di un nuovo test Elisa quantitativo a singolo dispositivo per la ricerca
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di un nuovo test Elisa quantitativo a singolo dispositivo per la ricerca sierotipo 1 (LPs1) in
campio-Non-commercial
sierotipo 1 (LPs1) in campio-ni di urine, appartenenti a pazienti con sospetta o accertata
legionello-Non-commercial
ni di urine, appartenenti a pazienti con sospetta o accertata legionello-si; verificare altresì se l’uso combinato di test diretto e ricerca
sierolo-Non-commercial
si; verificare altresì se l’uso combinato di test diretto e ricerca
sierolo-Non-commercial
Un totale di 160 campioni di urina furono esaminati per la ricerca di
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Un totale di 160 campioni di urina furono esaminati per la ricerca di
antigeni di LPs1: 56 urine raccolte da pazienti con sospetta o accertata
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antigeni di LPs1: 56 urine raccolte da pazienti con sospetta o accertatadiagnosi di legionellosi, 8 campioni di urine di riferimento del program-
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diagnosi di legionellosi, 8 campioni di urine di riferimento delprogram-(1, 5, 14, 15), in particolare, il test per la ricerca di antigeni urinari di
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(1, 5, 14, 15), in particolare, il test per la ricerca di antigeni urinari di LPsg1 ha trovato ampia diffusione, sostituendo, di fatto, l’esame
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LPsg1 ha trovato ampia diffusione, sostituendo, di fatto, l’esame col-turale. Il nuovo test Elisa a singolo
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turale. Il nuovo test Elisa a singolo
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Discussione
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Discussione
Le indagini di laboratorio nelle infezioni da
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Le indagini di laboratorio nelle infezioni da
stono un ruolo molto rilevante nella definizione clinica della malattia
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stono un ruolo molto rilevante nella definizione clinica della malattiaonly
cifico in tutti i 20 pazienti esaminati (Tabella 4). In due casi di
legio-only
cifico in tutti i 20 pazienti esaminati (Tabella 4). In due casi di legio-nellosi con isolamento microbiologico di LPs1, fu rivelato antigene
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nellosi con isolamento microbiologico di LPs1, fu rivelato antigene uri-nario e presenza di anticorpi IgM e IgG nel siero.
only
nario e presenza di anticorpi IgM e IgG nel siero.
[page 42] [Microbiologia Medica 2014; 29:4890] tativi, molto interessanti, come si evince dai risultati nel gruppo di
pazienti, come inequivocabile marcatore dell’infezione e della clea-rance del batterio; viceversa inoltre, nel follow up il test potrà mostra-re un rapido decmostra-remento ovvero la scomparsa di Ag LPsg1, come evi-denziato da uno dei due casi di antigene LPsg1 negativi, contestuale alla risoluzione della malattia. In altri casi la clearence avrà un lento decremento, con scomparsa dell’antigene ben oltre la guarigione cli-nica. L’elevato standard di qualità è dimostrato dall’allineamento dia-gnostico con il test preso come riferimento, sia nei 49 campioni di urina conservati provenienti dalla sieroteca che nei 7 nuovi pazienti, due dei quali ebbero diagnosi di legionellosi. Il test Ag Chorus mostra una sensibilità appena inferiore al test rapido, ben compensata da un livello di specificità assoluta. Una totale concordanza e accuratezza di risultati è stata ottenuta anche negli otto campioni di urina del pro-gramma esterno di qualità VEQ-NEQAS. In alcuni casi di suggestiva legionellosi il riscontro negativo di antigene LPs1 ottenuto con il nuovo test e, in minor misura, anche con il test di riferimento, dimo-strerebbe una scarsa o nulla eliminazione di antigeni ovvero la pre-senza di frammenti non rilevabili nelle urine. La scelta di verificare la presenza di marcatori sierologici specifici, quale segno indiretto dell’infezione ha rafforzato la capacità diagnostica. Così, nello studio è stato dimostrato che tra i 20 casi indagati con entrambe le procedu-re analitiche, IgM e IgG antiLPs1 furono rivelati in 14 di essi; in due casi l’antigene non fu rilevato, ma in entrambi si ebbe riscontro di IgM e IgG con elevati e significativi valori.
Dunque, il primo approccio diagnostico si indirizza verso la ricerca di antigene urinario specifico, escreto in una fase precoce dell’infe-zione; tuttavia, una rapida indagine multiparametrica dà evidenza di un miglioramento dell’efficacia diagnostica e di tempestività di rispo-sta al quesito clinico. Tale protocollo analitico sembra confermato da un recente report relativo ad un cluster epidemico in cui la sensibi-lità di IgM anti-LPs1 mostrava un range di 30-72%, in relazione al tempo di prelievo del siero, mentre l’uso combinato dei due metodi migliorava la sensibilità fino a 84% (15). Una negatività sierologica IgM in un paziente in cui permane forte sospetto di legionellosi
giu-stifica il ricorso ad un secondo campione (siero convalescente) per la dimostrazione della siero conversione, nonché una nuova ricerca di antigene urinario. Nella corrente pratica clinica è frequente l’invio di campioni biologici scarsamente associati a una precisa ricostruzione anamnestica, ovvero di singoli campioni di siero, non temporalmente definibili, da qui il suggerimento dell’uso combinato dei test. L’interrelazione tra il laboratorio e la clinica potrà ulteriormente migliorare l’appropriatezza della richiesta di esami, concordando rapidi protocolli d’indagine al fine di ottimizzare la qualità del
clini-cal management.
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Article
Tabella 3. Confronto tra test sierologici e Test Antigene urinario LPs1 in 20 pazienti con diagnosi di legionellosi.
IgG+IgM IgG+IgM Totale Positivo Negativo Ag Leg Chorus 12 6 18 Positivo Ag Leg Chorus 2* 0 Negativo Totale 14 6 20
*1 caso Ag LPsg1 negativo in legionellosi in corso+1 caso Ag LPsg1 negativo in legionellosi guarita.
Tabella 4. Impiego multiparametrico di test Ag Legionella Chorus e IgG+IgM anti-LPs1 in 20 casi di legionellosi.
N. casi Clinica
Ag Leg Chorus Pos/ 12 Legionellosi
IgG+IgM Pos
Ag Leg Chorus Pos/ 6 Legionellosi
IgG+IgM Neg
Ag Leg Chorus Neg/ 2 Legionellosi
IgG+IgM Pos
Totale 20
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tempo di prelievo del siero, mentre l’uso combinato dei due metodiNon-commercial
tempo di prelievo del siero, mentre l’uso combinato dei due metodi migliorava la sensibilità fino a 84% (15). Una negatività sierologica
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migliorava la sensibilità fino a 84% (15). Una negatività sierologica IgM in un paziente in cui permane forte sospetto di legionellosi
giu-Non-commercial
IgM in un paziente in cui permane forte sospetto di legionellosi
giu-mophila. Clin Vaccine Immunol 2006; 13: 361-4.
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mophila. Clin Vaccine Immunol 2006; 13: 361-4.
5. F ields BS, Benson RF, Besser RE. Legionella and Legionnaires’
disea-Non-commercial
5. F ields BS, Benson RF, Besser RE. Legionella and Legionnaires’ disea-se: 25 years of investigation. Clin Microbiol Rev 2002; 15: 506-26.
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se: 25 years of investigation. Clin Microbiol Rev 2002; 15: 506-26. 6. Guerrero C, Toldos CM, Yag
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6. Guerrero C, Toldos CM, Yag
sensitivities of three assays (Bartels enzyme immunoassay (EIA),
Non-commercial
sensitivities of three assays (Bartels enzyme immunoassay (EIA),
Non-commercial
Tabella 3. Confronto tra test sierologici e Test Antigene urinarioNon-commercial
Tabella 3. Confronto tra test sierologici e Test Antigene urinario
LPs1 in 20 pazienti con diagnosi di legionellosi.
Non-commercial
LPs1 in 20 pazienti con diagnosi di legionellosi.
Non-commercial
IgG+IgM IgG+IgM Totale
Non-commercial
IgG+IgM IgG+IgM Totale
Non-commercial
Positivo NegativoNon-commercial
Positivo Negativo 6Non-commercial
6Non-commercial
use
disease in routine clinical practice. J Clin Microbiol 2008; 46: 671-7.
use
disease in routine clinical practice. J Clin Microbiol 2008; 46: 671-7. 4. Diederen BMW, Kluytmans JAJW, Peeters M. Evaluation of Vircel
use
4. Diederen BMW, Kluytmans JAJW, Peeters M. Evaluation of Vircel enzyme-linked immunosorbent assay and indirect
immunofluore-use
enzyme-linked immunosorbent assay and indirect immunofluore-scence assay for detection of antibodies against Legionella
pneu-use
scence assay for detection of antibodies against Legionella pneu-mophila. Clin Vaccine Immunol 2006; 13: 361-4.
use
mophila. Clin Vaccine Immunol 2006; 13: 361-4.
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antibody in the investigation of an outbreak of pneumonia due to
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antibody in the investigation of an outbreak of pneumonia due to serogroup1. J Clin Microbiol Infect 2000;
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