[segue]

(1)

IL RUOLO DELLA

MICROFLORA NELLA PRODUZIONE DEL

PARMIGIANO-REGGIANO

Erasmo Neviani – Monica Gatti Università di Parma

La ricerca per la valorizzazione del Parmigiano Reggiano

Reggio Emilia 16.06.2009

(2)

Batteri lattici, Chi sono?

A cosa servono?

Il latte lo faccio io

Lo studio del ruolo della microflora lattica nella caseificazione non è cosa recente……

…….più di 100 anni

di lavori sperimentali

(3)

A Lodi nel 1873 , con i contributi finanziari del Ministero

dell’Agricoltura aveva iniziato ad operare la Prima Stazione

Sperimentale di Caseificio Italiana (Regia Stazione Sperimentale di Caseificio).

I primi direttori che ne lanciarono l’attività furono Guglielmo Corner,

Luigi Manetti e Giovanni Musso.

Nel 1879 iniziavano 40 di attività

del Prof.Carlo Besana (nella foto)

(4)

•L’adozione dell’utilizzo del

sieroinnesto per la produzione di formaggio Grana risale alla fine del secolo scorso.

•Gli studi di Gorini e Spallanzani

avevano enfatizzato l’importanza dei microrganismi nel processo di

caseificazione e Notari, prima, e poi Fascetti individuavano l’innesto come possibile metodo per

contenere i difetti di gonfiore.

PRIME ESPERIENZE NELL’IMPIEGO DI INNESTI

La tradizione di oggi è stata innovazione in passato !

(5)

Spallanzani nel 1895, in una sua memoria, riporta i primi

esperimenti di aggiunta di sieroinnesto a debole acidità

eseguiti presso la scuola di caseificio di Reggio Emilia, di

cui il Notari era

“capocascinaio”. Le

esperienze di Notari vennero riprese da Fascetti succeduto

a Spallanzani nella direzione

della Scuola.

(6)

Fascetti nel 1911 al II Congresso nazionale di Chimica applicata, spiega che “fin dal 1888 anche in Italia si fecero

tentativi sulla azione migliorante del siero latteo spontaneamente fermentato”.

Nello stesso periodo il Laboratorio Batteriologico della Scuola di Zootecnia e di Caseificio di Reggio Emilia

produce e distribuisce ai caselli colture pure da utilizzare per la preparazione del primo sierofermento. Con tali colture nel 1912

si produssero almeno 3000 forme.

Besana nel 1912 giudica “i risultati del metodo dell’innesto nella fabbricazione del formaggio reggiano nel loro complesso

soddisfacenti”.

(7)

CASEIFICAZIONE

Batteri lattici motore del processo

Non Starter LAB + Starter LAB Glicolisi Proteolisi

Enzimi

Cellule microbiche intere

(8)

Prima degli anni 80

• ILC Lodi (Carini e coll)

• Centro latte CNR Milano (Carini, Lodi e coll

• Uni Cattolica Piacenza (Bottazzi, Battistotti e coll.)

• Uni Bologna (Losi…. e coll.)

• Parmigiano Reggiano

Caratterizzazione

microrganismi Parmigiano Reggiano

Innovazione tecnologica

(9)

-

Analisi fenotipo

(10)

anni 80

• ILC lodi

• Uni Piacenza

• Uni Bo- Molise

• Parmigiano Reggiano

• …..altri

(11)

batteri lattici

Differenti

•Generi

•Specie

•Biotipi

(12)

Biodiversità e sopravvivenza

La biodiversità si traduce in differente

possibilità di sopravvivere in un substrato

Quindi

Differente attitudine alla trasformazione

tecnologica….

(13)

Cambia il territorio, cambia il clima, cambia l’organizzazione della vita dell’uomo…..

SONO SEMPRE VALIDE LE “RAGIONI” DEI BATTERI LATTICI?

Microrganismi ed evoluzione ecosistema produttivo e modificazioni tecnologia di

produzione

(14)

La storia ci insegna…

…la continua evoluzione negli anni della composizione della microflora degli innesti in relazione sia alla modificazione degli

ecosistemi ambientali che, e soprattutto, alle variazioni della tecnologia di produzione è stata osservata nel tempo.

Prima Renko negli anni ’40 e poi Bottazzi riprendendone gli studi hanno evidenziato come dagli inizi del secolo in poi la microflora del

sieroinnesto sia mutata da una miscela di microrganismi sostanzialmente mesofili ad una di microrganismi termofili.

Questa modificazione è probabilmente da mettere sia in relazione alle diverse temperature di cottura della cagliata sia

alle condizioni di incubazione del siero dolce.

(15)

Legame indissolubile tra sviluppo di specifica

microflora lattica e

tecnologia di caseificazione

(16)

Dal 1995 al 2008

(17)

Luigi Grazia, Raffaele Coppola (e coll.: Nanni, Sorrentino, Iorizio, Salzano, Chiavari, Benevelli;

Ferri, Castagnetti, Nocetti, Reverberi)

Caratterizzazione microflora termofila innesto e mesofila da latte crudo

sviluppo microflora LAB

Lactobacillus rhamnosus isolati da Parmigiano Reggiano

latte crudo!!!

Impronta ambiente

(18)

Gatti, Mucchetti, Neviani e coll.

Caratterizzazione microflora termofila innesto – ruolo biodiversità

sviluppo microflora LAB in maturazione

Produzione peptidi (Dossena, Marchelli e coll.)

Sieroinnesto !!!

Biochimica Maturazione

Università di Parma

(19)

Aspetti microbiologici relativi a sicurezza e contenimento difetti

Difetti fermentazione e gonfiori

• Sandri, Pecorari…Mariani

• Colombari, Zapparoli….Pecorari

• Consorzio e laboratori collegati

(20)

sono biodiverso a cosa servo…?

“MOLTE

INCERTEZZE E DIBATTITI IN

MERITO”

Biodiversità ???

(21)

Studio biodiversità in batteri lattici isolati da diverse

Aree geografica

Nicchie di produzione

(22)

Biodiversità in sieroinnesti Parmigiano Reggiano e Grana Padano

L helveticus pianura S 18 P.Reggiano L helveticus pianura S 10 P.Reggiano

L helveticus ATCC 15009

L helveticus ft 5 Grana

L helveticus 3 s Grana

L helveticus pianura Q 5 P.Reggiano L helveticus pianura Q 8 P.Reggiano L helveticus pianura S 14 P.Reggiano

L helveticus hbt 4 Grana

L helveticus pianura R 7 P.Reggiano L helveticus pianura R 10 P.Reggiano L helveticus montagna O 4 P.Reggiano L helveticus montagna M 5 P.Reggiano L helveticus montagna N 14 P.Reggiano L helveticus pianura Q 7 P.Reggiano L helveticus montagna M 11 P.Reggiano L helveticus montagna M 4 P.Reggiano

L helveticus Lh25 Grana

L helveticus TH456 Grana

L helveticus montagna N 1 P.Reggiano

L helveticus 14s Grana

L helveticus 14d48 Grana

L helveticus 15b Grana

L helveticus 3a48 Grana

L helveticus 1 s Grana

L helveticus 15b48 Grana

L helveticus 37s Grana

L helveticus sf 1 Parm.Regg.

L helveticus sf 2 Parm. Regg.

L helveticus pianura S 8 P.Reggiano 100

80 60

40 20

GP GP

PR PR

(23)

classe del nodo

se C31 è assente quando altro

ceppi

se C53.7 è assente quando altro se C51.7 è assente quando altro

se P50 è assente quando altro

se C59 è assente quando altro

PROV = Provolone GRPA = Grana Padano PARM = Parmigiano Reggiano Node 1

Term. Node 4 6 PARM2

119 PROV

Node 2 60 GRPA

Node 4 46 GRPA

Node 3 54 GRPA

Node 5 59 GRPA

Term. Node 6 5 PARM3

nodo terminale

2 43 GRPA nodo terminale

1 3 PARM

Biodiversità (Classification Tree) in L. helveticus isolati da Parmigiano Reggiano - Grana Padano -

Provolone

(24)

Biodiversità in sieroinnesti Parmigiano Reggiano

M13 M13 fingerprinting fingerprinting

1 2

3 4 5

7 11

10 8 9

6

11

10 9 8

7 6 5 4 3 2

1

Lact helveticus S13 pianura Lact helveticus R 1 pianura Lact helveticus S 2 pianura Lact helveticus S 4 pianura Lact helveticus R 5 pianura Lact helveticus M 5 montagna Lact helveticus S11 pianura Lact helveticus R13 pianura Lact helveticus S 7 pianura Lact helveticus M 7 montagna Lact helveticus Q11 pianura Lact helveticus N 1 montagna Lact helveticus S19 pianura Lact helveticus M 12 montagna Lact helveticus N 9 montagna Lact helveticus N10 montagna Lact helveticus M 3 montagna Lact helveticus N 5 montagna Lact helveticus N13 montagna Lact helveticus N 8 montagna Lact helveticus N 3 montagna Lact helveticus N 6 montagna Lact helveticus N15 montagna Lact helveticus M 2 montagna Lact helveticus N16 montagna Lact helveticus 0 4 montagna Lact helveticus 011 montagna Lact helveticus 0 7 montagna Lact helveticus 0 8 montagna Lact helveticus M 15 montagna Lact helveticus 014 montagna Lact helveticus M 8 montagna Lact helveticus M10 montagna Lact helveticus M 9 montagna Lact helveticus 019 montagna Lact helveticus Q 4 pianura Lact helveticus 0 20 montagna Lact helveticus 017 montagna Lact helveticus 018 montagna Lact helveticus Q 2 pianura Lact helveticus Q12 pianura Lact helveticus 0 9 montagna Lact helveticus M11 montagna Lact helveticus M 1 montagna Lact helveticus M 6 montagna Lact helveticus S 9 pianura Lact helveticus S12 pianura Lact helveticus S10 pinaura Lact helveticus N14 montagna Lact helveticus Q 1 pianura Lact helveticus 010 montagna Lact helveticus Q 6 pianura Lact helveticus 016 montagna Lact helveticus M 4 montagna Lact helveticus 012 montagna Lact helveticus S16 pianura Lact helveticus Q 7 pianura Lact helveticus S 8 pianura Lact helveticus S14 pianura Lact helveticus R 6 pianura Lact helveticus R14 pianura Lact helveticus S17 pianura Lact helveticus Q 5 pianura Lact helveticus S18 pianura Lact helveticus Q 8 pianura Lact helveticus R 8 pianura Lact helveticus R 10 pianura Lact helveticus R 7 pianura 100

90 80 70 60 50

montagna

pianura

(25)

Modificazioni del prodotto associate a produzione e stagionatura

Selezione biotipi

“adatti”

Evoluzione microflora nel formaggio

Devo resistere ^!

biodiversità come differente possibilità di sopravvivere

Quindi

differente attitudine alla trasformazione tecnologica

(26)

OGGI

(27)

NUOVI DUBBI E FRONTIERE

Cosa siamo in grado di valutare delle componenti di una popolazione

microbica

Nel corso della vita del prodotto fattori di stress modificano vitalità e significato

tecnologico di una popolazione

microbica

(28)

Microrganismi non coltivabili

Alcuni biotipi risultano incapaci di crescere in condizioni “colturali”, ma solo nell’ecosistema alimento (non siamo in grado

di riprodurre)

Alcune cellule sono danneggiate o “stressate”

Altre necessitano di interazioni con altri microrganismi

• etc……

(29)

VITALI NON VITALI

NON

COLTIVABILI COLTIVABILI

TOTALI

Possibile popolazione microbica in un alimento

?

Quello che sei abituato a vedere: ma c’è

dell’altro…

(30)

Tramite colorazioni differenziali è possibile distinguere cellule vitali e

cellule non vitali

(31)

streptococco non vitale

streptococco vitale

lattobacillo vitale

lattobacillo non vitale

(32)

SIEROINNESTO A SIEROINNESTO B

(33)

Tecnica qualitativa qualitativa e semi-quantitativa;

Permette di distinguere diversi microrganismi in base a variazioni naturali nella lunghezza di una regione del DNA;

Ecosistemi complessi: suolo, sieroinnesto per formaggi Grana, insilati, bacterioplankton;

Si basa su:

• Polimorfismo di un gene Polimorfismo di un gene presente nelle specie di studio, es.

16S rRNA;

• Amplificazione mediante Amplificazione mediante PCR PCR con uno dei due primer fluorescente;

• Separazione e Analisi dei prodotti amplificati per Separazione e Analisi

elettroforesi capillare in un sistema automatizzato quale il sequenziatore

sequenziatore di DNA.

LH-PCR (

LH-PCR ( Length Length heterogeneity heterogeneity PCR) PCR)

(34)

Elettroferogramma

Elettroferogramma di frammenti di DNA in un di frammenti di DNA in un campione di Sieroinnesto

campione di Sieroinnesto

La lunghezza dei

La lunghezza dei frammenti frammenti amplificati per ogni specie presente in un amplificati per ogni specie presente in un sieroinnesto per Grana Padano:

sieroinnesto per Grana Padano:

Streptococcus thermophilus

Streptococcus thermophilus 318 pb 318 pb Lactobacillus delbrueckii

Lactobacillus delbrueckii spp spp. lactis/bulgaricus . lactis/bulgaricus 331 331 pb pb Lactobacillus helveticus

Lactobacillus helveticus ₃₃₅ ₃₃₅ _pb _pb Lactobacillus fermentum

Lactobacillus fermentum 342 – 342 – 345 pb 345 pb

F lu o r e s c e n z a (r fu )

L. helveticus

L. fermentum L. delbrueckii

S. thermophilus

(35)

Siero 1

Siero 2

Siero 3

Siero 4

Siero 5

(36)

autoli si

(37)

(38)

DNA di cellule batteriche intere DNA di cellule batteriche lisate

1 L. delbrueckii subsp. lactis/bulgaricus

2 L. helveticus

3 L. rhamnosus / L. casei / L. plantarum

4 P. acidilactici / L. parabuchneri

* Unattributable peaks

LH-PCR applicata a siero, latte, cagliata e formaggio

(39)

PROFILI CAMPIONE ……..:

Cellule intere Cellule intere

Cellule lisate Cellule lisate

L.rhamnosus

L.parabuchneri /P. acidilactici?

L.d lactis

L.helveticus

L.rhamnosus

L.d lactis L.helveticus

L.fermentum?

337: L.plantarum?

• • Profilo molto diverso. Profilo molto diverso.

• • Minoranza di Minoranza di L.lactis L.lactis e e L. L.

helveticus helveticus. .

• • Maggioranza di Maggioranza di L.rhamnosus L.rhamnosus. .

• • Evidenza di presenza di Evidenza di presenza di L. L.

plantarum, L. fermentum e plantarum, L. fermentum e P.acidilactici?

P.acidilactici?. .

(40)

PROFILI CAMPIONE …….:

Cellule intere Cellule intere

Cellule lisate Cellule lisate

L.rhamnosus

L.d lactis

L.helveticus

L.fermentum

345: L.parabuchneri / P. acidilactici?

L.d lactis L.helveticus

L.fermentum

• • Predominanza L. lactis Predominanza L. lactis, ,

• • Minoranza Minoranza L. helveticus e L. helveticus e L. L.

rhamnosus rhamnosus. .

• • Forte evidenza L.fermentum Forte evidenza L.fermentum

e e P.acidilactici P.acidilactici?. ?.

(41)

PROFILI CAMPIONE ……..:

Cellule lisate Cellule lisate Cellule intere

Cellule intere L.rhamnosus

L.d lactis L.helveticus

L.fermentum?

345:L. parabuchneri / P. acidilactici?

• • Dominante L.rhamnosus, Dominante L.rhamnosus,

• • Forte evidenza di L. Forte evidenza di L.

fermentum e P. acidilactici?

(42)

PROFILI CAMPIONE……

Cellule intere Cellule intere

Cellule lisate Cellule lisate

L.rhamnosus

L.d lactis

L.helveticus

S.thermophilus? 337: L.plantarum?

L.rhamnosus

L.d lactis

L.helveticus

• • Dominante L.lactis Dominante L.lactis insieme a L. rhamnosus, insieme a L. rhamnosus,

• • Evidenza di presenza di Evidenza di presenza di L. plantarum e S.

L. plantarum e S.

thermophilus,

(43)

PROFILI CAMPIONE ……..:

Cellule intere Cellule intere

Cellule lisate Cellule lisate

L.rhamnosus

L.d lactis

L.helveticus

345: L. parabuchneri / P. acidilactici?

L.d lactis

L.helveticus

• • Profili simili a Parmigiano Profili simili a Parmigiano Reggiano

Reggiano

(44)

Ma anche tra le vitali, coltivabili o no,

importanza presenza o attività?

Differente efficacia tecnologica

(45)

modificazioni

biochimiche associate all’attività metabolica di microrganismi

(Utilità dei Chimici!)

latte

latte formaggio formaggio

La caseificazione è sostanzialmente un processo enzimatico governato dalla

tecnologia

(46)

0 400 800 1200 1600 2000

C ur d 6 ho ur s C ur d 12 h ou rs

C ur d 48 h ou rs

S al te d ch ee se (1 m on th ) C he es e 2 m on th s

C he es e 3 m on th s C he es e 4 m on th s

C he es e 6 m on th s C he es e 8 m on th s

C he es e 10 m on th s C he es e 12 m on th s

C he es e 16 m on th s C he es e 20 m on th s

E A

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

0 400 800 1200 1600 2000

C ur d 6 ho ur s C ur d 12 h ou rs

C ur d 48 h ou rs

S al te d ch ee se (1 m on th ) C he es e 2 m on th s

C he es e 3 m on th s C he es e 4 m on th s

C he es e 6 m on th s C he es e 8 m on th s

C he es e 10 m on th s C he es e 12 m on th s

C he es e 16 m on th s C he es e 20 m on th s

E A

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

Pep N Pep C Pep L

Pep A Pep I Pep X

Attività amminopeptidasica libera in formaggio (non asociata a cellule batteriche intere e vitali)

Parte esterna Parte interna

SLAB autolisi

NSLAB crescita ed autolisi

(47)

S e m iq u a n ti ta ti v e a m o u n t

0 2 4 6 8 10 12

C ur d at v at e xt ra ct io n

C ur d 12 h ou rs

C ur d 48 h ou rs

S al te d ch ee se (1 m on th )

C he es e 2 m on th s

C he es e 3 m on th s

C he es e 4 m on th s

C he es e 6 m on th s

C he es e 8 m on th s

C he es e 10 m on th s

C he es e 12 m on th s

C he es e 16 m on th s

C he es e 20 M on th s

β CN f (99-160) β CN f (99-159) αS1 CN f (1-23)

α S2 CN f (154-162) β CN f (60-68)

β CN f (1-6) αS1 CN f (1-16)

αS1 CN f (186-192) β CN f(37-67)

β CN f (1-4) αS1 CN f (1-14)

αS1 CN f (174-199) β CN f (47-52)

β CN f (1-3) αS1 CN f (14-23)

β CN f (159-183) αS1 CN f (155-187)

β CN f (199-209) αS1 CN f (17-23)

β CN f (103-119) αS1 CN f (156-187)

β CN f (195-209) αS1 CN f (1-6)

β CN f (98-124) αS1 CN f (157-188)

β CN f (194-209) αS1 CN f (1-13)

β CN f (53-93) αS1 CN f (30-35)

β CN f(193-209) αS1 CN f (1-17)

β CN f(57-93) αS1 CN f (24-30)

αS1 CN f (16-20) αS1 CN f (10-16

β CN f (55-93) αS1 CN f(24-38)

αS1 CN f (10-14) αS1 CN f (18-23)

β CN f(59-96) αS1 CN f (24-36)

αS1 CN f (1-4) αS1 CN f (1-7)

β CN f (51-93) αS1 CN f (24-34)

αS1 CN f (1-9) αS1 CN f (10-13)

α S2 CN f (154-162) β CN f (60-68)

β CN f (1-6) αS1 CN f (1-16)

αS1 CN f (186-192) β CN f(37-67)

β CN f (1-4) αS1 CN f (1-14)

αS1 CN f (174-199) β CN f (47-52)

β CN f (1-3) αS1 CN f (14-23)

β CN f (159-183) αS1 CN f (155-187)

β CN f (199-209) αS1 CN f (17-23)

β CN f (103-119) αS1 CN f (156-187)

β CN f (195-209) αS1 CN f (1-6)

β CN f (98-124) αS1 CN f (157-188)

β CN f (194-209) αS1 CN f (1-13)

β CN f (53-93) αS1 CN f (30-35)

β CN f(193-209) αS1 CN f (1-17)

β CN f(57-93) αS1 CN f (24-30)

αS1 CN f (16-20) αS1 CN f (10-16

β CN f (55-93) αS1 CN f(24-38)

αS1 CN f (10-14) αS1 CN f (18-23)

β CN f(59-96) αS1 CN f (24-36)

αS1 CN f (1-4) αS1 CN f (1-7)

β CN f (51-93) αS1 CN f (24-34)

αS1 CN f (1-9) αS1 CN f (10-13)

ß CN f(17-25)2P ß CN f(11-28) 4P ß CN f(12-28) 4P ß CN f(14-28) 4P ß CN f(15-28) 4P ß CN f (15-28)3P ß CN f(17-28) 3P

ß CN f (71-83) ß CN f(142-161)

ß CN f (82-95) aS1 CN f (169-179)

ß CN f(13-28) 4P ß CN f (16-28)3P ß CN f(16-25)3P

ß CN f(17-25)2P ß CN f(11-28) 4P ß CN f(12-28) 4P ß CN f(14-28) 4P ß CN f(15-28) 4P ß CN f (15-28)3P ß CN f(17-28) 3P

ß CN f (71-83) ß CN f(142-161)

ß CN f (82-95) aS1 CN f (169-179)

ß CN f(13-28) 4P ß CN f (16-28)3P ß CN f(16-25)3P

evoluzione della frazione oligopeptidica nel corso della stagionatura

Set 1: 5 peptidi (media Mw 4024)

Set 2: 40 peptidi (media Mw 1640)

Set 3: 21 peptidi (media Mw 2332)

(48)

NSLAB + SLAB

SELEZIONE BIOTIPI

“ADATTI”

LAB: funzionali,

caratteristici, “autoctoni”..

•Parametri Tecnologici

•Presenza altri microrganismi

•Modificazioni del substrato

indotte dalla tecnologia e/o attività microbica (Aw, pH, NaCl, etc.)

Evoluzione e Ruolo microflora nel PR

Ecco fatto!!!!

Rilascio enzimi,

stagionatura, caratteri

organolettici

(49)

Domani !

(50)

quesiti aperti

• Quali e quanti sono i microrganismi presenti

nelle differenti fasi di produzione e stagionatura In che stato fisiologico

• I microrganismi svolgono necessariamente tutti un ruolo di interesse tecnologico