ELENCO DELLE ABBREVIAZIONI

INDICE

INDICE

ELENCO DELLE ABBREVIAZIONI

RIASSUNTO

ABSTRACT

SEZIONE I: INTRODUZIONE

1. TTV 13

1.1 La scoperta 13

1.2 Tassonomia e nomenclatura 16

1.3 La particella virale 24

1.4 Organizzazione del genoma eproteine codoficate 26

1.5 Eterogeneità genetica 36

1.6 Replicazione 40

1.7 Metodi per la rivelazione diagnostica di TTV 43

1.8 Epidemiologia 46

1.9 Interazioni con l’ospite infettato 52

1.10 Associazione con la malattia 58

1.11 Sensibilità ai farmaci antivirali 64

2. Asma 66

2.1 Ruolo dell’ossico nitrico nell’asma 69

3. Scopo della tesi 72

SEZIONE II: MATERIALI E METODI

1. Popolazione 74

1.1 Metodologia di misura dell’ossido nitrico 79

2. Raccolta e processamento dei campioni 82

3. Estrazione del DNA virale 83

4. Saggi di PCR 85

4.1 Caratteristiche della PCR 85

4.2 Real-Time PCR: metodo per quantificare il genoma di TTV 90

4.3 PCR genogruppo specifiche 100

5. Corsa elettroforetica su gel di agarosio 106

6. Estrazione di DNA dal gel di agarosio 109

7. Sequenziamento 111

7.1 Descrizione della metodica 111

7.2 Amplificazione 115

7.3 Purificazione della reazione di sequenza 117

7.4 Elettroforesi 118

8. Estrazione e amplificazione del genoma di altri virus 121

8.1 Estrazione dell’RNA virale 121

8.2 Nested RT-PCR 123

8.3 Sistema per analisi in PCR Real-Time 127

9. Analisi statistica 128

SEZIONE III: RISULTATI

nell’aria esalata 133 2. Correlazione tra le variazioni della carica virale

di TTV e le variazioni della concentrazione di

ossido nitrico 137

2.1 Osservazini iniziali 137 2.2 Determinazione delle variabili clinico-terapeutiche associate alle variazioni di eNO 143 3. Studio nel tempo di singoli pazienti 148

SEZIONE IV: DISCUSSIONE

CONCLUSIONI

RINGRAZIAMENTI

SEZIONE V: RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI

ELENCO DELLE ABBREVIAZIONI

aa aminoacido/i

ALT Alanine aminotransferase, alanina aminotransferasi.

BFDV Beak and feather disease virus, virus della malattia del becco e delle penne dei pappagalli.

BP Broncopolmonite.

CAV Chicken anemia virus, virus dell’anemia del pollo.

CITV Commissione internazionale per la tassonomia dei virus.

CRV Common respiratory viruses, virus respiratori comuni.

ECP Eosinophilic cationic protein, proteina cationica eosinofilica.

eNO Exhaled nitric oxide. Concentrazione di ossido nitrico nell’aria espirata.

IC Intervallo di confidenza.

IFN Interferon, Interferone.

Ig Immunoglobuline.

HBV Hepatitis B virus, virus dell’epatite B.

HCV Hepatitis C virus, virus dell’epatite C.

HIV Human immunodeficiency virus, virus dell’immunodeficienza umana.

HVR Hypervariable Region, regione ipervariabile.

MRA Malattie respiratorie acute.

NO Nitric oxide. Ossido Nitrico.

nt nucleotide/i.

ORF Open Reading Frame, cornice di lettura aperta.

PCR Polymerase chain reaction, reazione a catena della polimerasi.

PCV Porcine circovirus, circovirus porcino.

RDA Representational difference analysis, analisi di rappresentazione differenziale.

RSV Respiratory syncytial virus, virus respiratorio sinciziale.

RV Rhinovirus. Rinovirus.

SD Standard deviation. Deviazione standard.

TTMV Torqueteno-mini-virus.

TLMV TTV-like-mini-virus.

TTV Torqueteno virus.

UTR Untraslated region, regione non tradotta.

.

RIASSUNTO

Torquetenovirus (TTV), prototipo del nuovo genere Anellovirus, è un virus di piccole dimensioni con un genoma a DNA di circa 3,8 Kb costituito da un singolo filamento circolare a polarità negativa. Studi successivi alla sua scoperta, avvenuta nel 1997 nel siero di un paziente con epatite criptogenetica, hanno focalizzato l’attenzione sul possibile ruolo patologico di TTV nelle malattie epatiche.

Tuttavia, la dimostrata elevata prevalenza di viremia cronica nella popolazione generale ha resa incerta le potenzialità patogene di TTV, tanto da far ritenere il virus, da alcuni autori, un commensale dell’uomo.

Recenti studi, condotti su bambini di età inferiore ai due anni affetti da malattie respiratorie acute (MRA), hanno dimostrato che il tratto respiratorio è sede di infezione primaria e continua replicazione del virus. Sebbene non ci siano evidenze che TTV sia la diretta causa di MRA, i risultati suggeriscono un possibile ruolo immunomodulante del virus. Vari studi, inoltre, hanno evidenziato che malattie infiammatorie del tratto respiratorio sono associate ad un’ aumentata espressione di ossido nitrico sintasi inducibile (iNOS) a carico delle cellule epiteliali delle vie aeree e ad un aumentato livello di ossido nitrico nell’aria espirata (eNO). Dal 1993, anno in cui è stato dimostrato che i livelli di eNO dei soggetti asmatici erano superiori

rispetto ai livelli rilevati nei soggetti normali (Alving et al,1993), ebbe inizio una serie di sperimentazioni volte a chiarire il significato fisiologico e patologico dell’eNO e a cercare una possibile correlazione tra la presenza di infiammazione nelle vie aeree e aumentata produzione di eNO .

Proprio in tale direzione è stato condotto questo lavoro di tesi con lo scopo di descrivere la correlazione tra le variazioni dei titoli di TTV e le variazioni della concentrazione di eNO. A tal fine, è stato preso in esame un gruppo di 34 soggetti, di età compresa tra 7 e 15 anni, affetti da asma persistente ben controllata, sottoposti a periodiche visite di controllo. Durante ogni visita veniva misurata la concentrazione di eNO e venivano prelevate le secrezioni nasali sulle quali era effettuata la quantificazione di TTV. Avendo a disposizione tutti i valori della carica virale di TTV e le determinazioni delle misurazioni dell’ eNO effettuate nel tempo sono state calcolate le variazioni nel tempo dei due parametri, ed è stata studiata la relazione tra le due variazioni. I risultati hanno evidenziato una correlazione positiva e un andamento parallelo, nel fluido nasale dei soggetti asmatici, tra le variazioni dei titoli di TTV e le variazioni della concentrazione di eNO. Inoltre, analisi statistiche di correlazione multipla hanno dimostrato che il solo parametro correlato significativamente con le variazioni di eNO è rappresentato da TTV.

I risultati di questo studio suggeriscono un possibile ruolo del virus

come induttore dell’aumento di eNO ed indicano, essendo la concentrazione di eNo elevata nei soggetti con asma, un possibile ruolo patogenetico del virus nell’aggravamento della funzionalità respiratoria in soggetti affetti da questa grave patologia.

ABSTRACT

Torquetenovirus (TTV), member of the new genus Anellovirus, is a small virus with negative single-stranded circular DNA (3.8 Kb). Early studies carried out soon after its discovery in 1997 focused on TTV as the possible causative agent of cryptogenetic hepatitis, but the observation that chronic TTV viremia is widespread among the general population worldwide has led to considerable uncertainties about what possible pathogenetic potential TTV may have.

Recent studies carried out in ≤ 2 year old children, demonstrated that the respiratory tract is indeed a site of primary TTV infection and continual TTV replication. Although no evidence was obtained to suggest that TTV is the direct cause of respiratory diseases, some data have demonstrated that TTV could possibly affect the immune system. Moreover, several studies have shown that inflammatory respiratory diseases are able to upregulate inducible nitric oxide synthase expression (iNOS) in the airway epithelium of asthmatic patients and to increase the levels of exhaled nitric oxide (eNO). In 1993, it has been demonstrated that the levels of eNO were higher in asthmatic patients than in healthy subjects (Alving et al., 1993);

prompted by these findings, several experiments have been made to shed light at the physiologic and pathologic role of eNO and to find a

possible association between airway inflammation and increased production of eNO.

Aim of the present study was to investigate the possible association between variations of nasal TTV loads and eNO concentrations.

Thirty-four children (28 boys and 6 girls, age range, 7-15 years) followed by the Department of Paediatrics, University Hospital of Pisa because suffering of mild to moderate persistent asthma, were enrolled in this study.

At the time of enrolment and at each subsequent control, the children were examined for eNO, and their nasal fluids were tested for presence and titer of TTV.

With all the values of TTV load and eNO thus obtained the variations occurred with time were calculated, these variations were then compared to verify if a correlation existed between the two parameters.

The results have shown a positive association between variations of TTV loads and variations of eNO concentrions. Multiple linear regression analyses demonstrated that TTV was the only variable that had a significant relationship with variations observed in eNO.

These findings suggest a role of TTV as a possible inductor of increased eNo; furthermore, since eNo concentration is high in asthmatic children, these data indicate that TTV might represent a

contributing factor in the worsening of respiratory function observed in previous studies in asthmatic individuals.