Mercoledi 17 Novembre Mercoledi 24 Novembre Aula GOLGI Ore 15,00 - 16,00 Esercitazioni di Biochimica

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Mercoledi 17 Novembre Mercoledi 24 Novembre

Aula GOLGI Ore 15,00 - 16,00

Esercitazioni di Biochimica

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Regolazione dell’Espressione Genica

Puo’ essere regolata in una delle seguenti sei fasi:

DNA RNA

transcript

mRNA mRNA

inactive mRNA

protein

inactive protein

NUCLEUS CYTOSOL

trascrizione Maturazione trasporto traduzione

degradazione

controllo dell’attivita’

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Erythrocytes White blood cells

Molecular mass kDa

10 200

pH pH

4 10 4 10

Different cell types contain different proteins

Molecular mass kDa

10 200

Hb Hb

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• Perche’ l’emoglobina e’ presente ad alti livelli negli eritrociti e assente nei globuli bianchi ?

• Hb e Hb sono I polipeptidi che insieme all’eme formano l’emoglobina dell’adulto

• Concentriamoci sulla -globina .

• Se la regolazione coinvolge la sua sintesi allora dovremo studiare le cellule che la producono, gli eritroblasti.

Differenziamento degli eritrociti

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Il differenziamento delle cellule del sangue nel midollo spinale

Myeloid stem cells (Precursor

cells)

Erythroblasts

(Fanno l’emoglobina)

White blood cells except lymphocytes (non contengono emoglobina)

Erythrocytes

(contengono l’emoglobina)

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Regulation of  globin synthesis

White blood cells Erythroblasts DNA

 globin mRNA

 globin Protein

Gene presente Gene presente

Proteina quasi completamente

assente

Proteina presente

? ?

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Regulation of  globin synthesis

White blood cells Erythroblasts DNA

 globin mRNA

Globin Protein

Gene presente Gene presente

Proteina quasi completamente

assente

Proteina presente Quasi assente presente in grandi

Quantita’

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Meccanismi che Potrebbero portare ad un aumento dell’mRNA di Hb negli eritrociti

1.  globin mRNA e’ trascritto negli eritrociti e nei globuli bianchi ma in questi ultimi :

• Non e’ processato e poi e’ degradato

• Processato ma rapidamente degradato

2.  globin mRNA e’ trascritto negli eritrociti ma non nei globuli bianchi

• Un modo di misurare SOLO la velocita’ di trascrizione e’ : RUN-OFF TRANSCRIPTION

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• Nucei ISOLATI, continuano a sintetizzare l’RNA (run-off RNA), ma non iniziano nuove molecole di RNA

• I nuclei sono incubati con ATP radioattivo.

• I run-off RNA sono isolati, separati e identificati.

• Un forte segnale significa che al momento dell’isolamento dei nuclei la cellula stava producendo molto RNA.

Run-off transcription

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5’

Nessun nuovo inizio

Run-off transcription in vitro

precursori Radioactivi

Result of hybridisation

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 globin

Run-off transcripts from Eritroblasti

Run-off transcripts from Gobuli Bianchi

Positive control,

actin Positive control,

actin globin

filter filter

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L’esperimento ci dice :

Negli eritroblasti il gene della globina e’ trascritto molto velocemente

Nei globuli bianchi la sua velocita’ di trascrizione e’ bassissima

 globin

Quindi la globina e’ presente solo negli eritroblasti perche’ qualche cosa influenza la

trascrizione del suo gene.

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Controllo del livello di ferro nella cellula

• Il ferro e’ un nutriente essenziale

• La cellula lo usa per : citocromi, emoglobina e molti enzimi.

• Il ferro in eccesso e’ causa di formazione di radicali liberi

• Quindi il livello di ferro deve essere controllato accuratamente.

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Fe ²⁺

Sangue

Fe ³⁺

Transferrin (trasporto)

Transferrin receptor (ingresso)

Ferritin (Stoccaggio)

Regolazione di proteine

trasportatrici/immagazzinamento del ferro

• Quando il ferro e’ in eccesso la cellula deve diminuire il livello del recettore e aumentare quello della ferritina.

• La cellula ottiene questo mediante regolazione della traduzione,

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Controllo della Traduzione

1. Repressione - es. Iron Response Element della ferritina 2. Stabilizzazione- es. IRE del recettore della transferrina

Ferritina - Lega il Ferro e lo conserva

Recettore della Transferrina (TFR)- trasporta il ferro nella cellula Se il Ferro e’ nella cellula - Si Ferritina, No TFR

Se non c’e’ Ferro - Si TFR, No Ferritina Come viene regolato tutto questo?

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M

AUG

Fe m⁷G

Iron Response Element

IRE-BP (cytosolic aconitase)

Fe

M

Fe

Ferritin mRNA

Coding region AUG

1. Repressione :-Ferro, ferritina NO

2. Attivazione:+ Ferro, ferritina SI

M

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AUG

m⁷G

Fe

M

Fe

TFR mRNA

1. Stabilizzazione:- Ferro, TFR SI

2. Degradazione:+ Ferro, TFR NO

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AUG

m⁷G

TFR mRNA

1. Stabilizzazione:- Ferro, TFR SI

2. Degradazione:+ Ferro, TFR NO

Fe

RNAse

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Il ferro previene il legame di una proteina di 90 kDa ad uno o piu’ Iron Response Elements.

•Recettore della Transferrina.

Stem loop al 3’. La presenza dello stem loop causa la degradazione dell’mRNA

Ferritina

Stem loop al 5’. La presenza della proteina sullo stem loop causa il blocco della traduzione.

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Purificazione degli Intermedi della traduzione

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CICLOEXIMMIDE: interferisce con La reazione della peptidil transferasi (arresto dei ribosomi 80S sull’AUG) GMP-PNP (Analogo del GTP pero’

Non-idrolizzabile): GTP richiesto per

L’unione della subunita’ 60S al complesso 40S/mRNA

CAP analogo:inibisce il legame della 40S all’mRNA

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CENTRIFUGAZIONE IN GRADIENTE DI DENSITA’

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WT-IRE: IRE come e’ nella Ferritina

C-IRE: IRE con una delezione

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Componenti del Complesso Che lega il CAP

NOTA BENE: all’inizio della traduzione il legame della 40S all’mRNA richiede Il legame del “CAP binding Complex” al cappuccio dell’mRNA

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NOTA: Il legame della 40S al CAP dell’mRNA richiede l’interazione di elF3 (che e’ legato

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Fe

²⁺

+ H

₂

O

₂

Fe

³⁺

+ OH- + OH°

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La presenza di acqua ossigenata o ossido nitrico rende attiva IRP-1 (che e’ la IRE binding Protein piu’ abbondante) che quindi causa un aumento del recettore della transferrina

Il ferro viene rimosso dal sangue e non genera radicali liberi!

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DMT1 DMT2

Quindi DMT1 e’

l’unico regolabile dal Ferro

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DMT2 DMT1 Se non e’ presente abbastanza Fe

Nella cellula del Duodeno viene Indotta la sintesi di DMT1