MATERIALI E METODI
RILEVAMENTI IN CAMPAGNA
AREA DI STUDIO
La zone da me frequentate durante la primavera-estate 2004 e lo stesso periodo del 2005 si trovano all´interno del Parco Regionale di Migliarino-San Rossore-Massaciuccoli. Il territorio del Parco si estende per circa 240 Km² sulla fascia costiera delle province di Pisa e Lucca, in particolare dalla periferia settentrionale di Viareggio (LU) al canale scolmatore che segna il confine tra le province di Pisa e Livorno. Il Parco si estende inoltre nell´entroterra fino alla base delle Alpi Apuane, comprendendo l´area del Lago di Massaciuccoli. L´area interessata dal Parco era un tempo lagunare e paludosa, e numerose bonifiche, per colmata e per pompaggio, hanno dato al Parco il suo attuale assetto idrico, caratterizzato dalla presenza di numerosi canali artificiali ad andamento rettilineo.
Il territorio del Parco presenta una grande varetà di habitat: arenili e dune lungo il litorale, depressioni retro-dunali con caratteristiche tipiche di ambienti salmastri, zone paludose interne create da alte falde freatiche o da problemi di drenaggio, aree adibite alla coltivazione e boschi. Questa grande variabilità a livello ambientale è accompagnata da un´altrettanto grande variabilità a livello floristico e faunistico.
Le mie ricerche all´interno del Parco hanno interessato soprattutto una zona, denominata “Lamone”, situata presso la località di Arnino, all´interno della Tenuta di Tombolo. La Tenuta si trova a circa 10 km a Sud-Ovest dalla città di Pisa e 2 km circa a Est della costa Tirrenica (43°39´45” Latitudine Nord, 10°17´30” Longitudine Est). La zona di studio è rappresentata da una fascia ecotonale di transizione tra un ambiente di tipo boscoso e un´ampia radura erbosa su quella che anticamente doveva essere una duna, al momento completamente spianata. Questa fascia è separata dalla strada asfaltata da un canale temporaneo, asciutto durante l´estate, ed è suddivisa in tre parti da altri due canali, per una lunghezza complessiva di circa 1,5 km.
Oltre alla zona di Lamone, alcuni esemplari di Vipera aspis sono stati catturati vicino alle località di San Piero a Grado e Camp Darby, caratterizzate dallo stesso tipo di habitat dell´area appena descritta.
Fig. 09- Lamone, la fascia ecotonale di transizione (foto M.A.L. Zuffi).
Fig.10- Zona boscosa vicino a Camp Darby (foto M.A.L. Zuffi).
CLIMA
Le caratteristiche macroclimatiche dell´area di studio sono quelle tipiche del bacino del Mediterraneo: per 4 o 5 mesi l´anno il clima è caldo-asciutto e le precipitazioni sono sporadiche, mentre durante il restante periodo abbiamo un clima fresco-umido in cui cade la maggior parte della pioggia annuale (precipitazioni medie annue relative a San Rossore = 777,27 mm).
VEGETAZIONE
Nell´area di studio il bosco è formato in prevalenza da pini domestici (Pinus pinea) e lecci (Quercus ilex), con un sottobosco ad erica (Erica scoparia ed E. arborea), mirto (Myrtus communis) e lentisco (Pistacia lentiscus).Queste aree a pineta si alternano con boschi di caducifoglie come la farnia (Quercus robur), il frassino (Fraxinus oxicarpa), l´olmo (Ulmus minor) ed il pioppo bianco (Populus alba); in questo caso il sottobosco è maggiormente variabile e vi si può trovare il pungitopo (Ruscus aculeatus), lo stracciabrache (Smilax aspera), il biancospino (Crataegus monogyna) e l´edera (Hedera helix). La fascia ecotonale è costituita da numerose specie vegetali, tra le quali abbondano il rovo (Rubus fruticosus), la fillirea (Phillyrea angustifolia) ed il cisto (Cistus incanus e C. salvifolius). Lungo i canali la vegetazione è prevalentemente costituita da cannucce di palude (Phragmites australis).
FAUNA
L´area di studio annovera una notevole varietà di Vertebrati. I Mammiferi sono presenti con diversi ordini: i Roditori, molto comuni, sono rappresentati dal topo selvatico (Apodemus sylvaticus), dal topolino delle case (Mus domesticus), dall´istrice (Hystrix cristata), dallo scoiattolo (Sciurus vulgaris) dal ghiro (Myoxus glis) e dal moscardino (Muscardinus avellanarius). Tra gli Insettivori troviamo il riccio (Erinaceus europaeus) ed il toporagno comune (Sorex araneus), mentre i Carnivori comprendono la volpe (Vulpes vulpes), il tasso (Meles meles), la faina (Martes foina) e, sebbene più rara, la martora (Martes martes; M.Zuffi, com.pers.). Tra gli Artiodattili molto comune è il cinghiale (Sus scrofa), mentre i Lagomorfi sono rappresentati dal coniglio selvatico (Oryctolagus cuniculus).
Gli Uccelli sono particolarmente abbondanti, sia con le specie stanziali che con le specie migratrici: fra queste ultime, è facile incontrare durante il periodo primaverile ed estivo, il gruccione (Merops apiaster), il rigogolo (Oriolus oriolus), l´upupa (Upupa epops) e la rondine (Hirundo rustica). Grazie a questa grande varietà di specie ornitiche, tutto il Parco Regionale di San Rossore è considerato un´importante stazione di rilevamento ornitologico. Per quanto riguarda l´erpetofauna, oltre alla vipera comune (Vipera aspis) sono presenti altre specie di Serpenti: il biacco (Hierophis viridiflavus) e la biscia dal collare (Natrix natrix), mentre sono estremamente rari il saettone (Zamenis longissima) e il colubro liscio (Coronella austriaca). Tra i Sauri troviamo la luscengola (Chalcides chalcides), l´orbettino (Anguis fragilis), la lucertola muraiola (Podarcis muralis), la lucertola campestre (Podarcis sicula)
e il ramarro (Lacerta bilineata). Lungo i canali vive la testuggine palustre (Emys orbicularis). Gli Anfibi più comuni sono la rana verde minore (Rana synkl. „hispanica“), la raganella (Hyla intermedia), la rana agile (Rana dalmatina), il rospo smeraldino (Bufo viridis), il tritone punteggiato (Triturus vulgaris) e il tritone crestato (Triturus carnifex) (Zuffi e Lippi, 1994).
METODI DI CATTURA E DI MARCATURA
Il metodo da me utilizzato è quello della cattura a mano che rimane sicuramente il più semplice e il più rapido.
La ricerca degli animali è compiuta attraverso il cosiddetto „random walk“: nel corso della giornata si percorre più volte lo stesso itinerario, basandosi sull´attività giornaliera (termoregolazione, spostamento, alimentazione, ecc.) e sull´occupazione dell´habitat da parte della specie in studio.
Dato che la cattura di questo animale comporta notevoli rischi, essendo la vipera un serpente velenoso, occorre prestare sempre la massima attenzione nel maneggiarla e dotarsi di un abbigliamento adeguato nelle uscite in campagna.
Una volta individuata, la vipera viene bloccata con i piedi, dopodiché la si afferra per la coda (usando guanti spessi e lunghi) e se ne controllano i movimenti con un bastone con estremità a “T”. Di seguito si registra la data, l´ora solare e il luogo esatto della cattura.
In una prima analisi sul campo si determina il sesso dell´animale e il suo stato fisiologico. Il riconoscimento del sesso avviene osservando la forma e la lunghezza della coda: nei maschi la coda è più lunga e con una base di
attacco più ampia (per la presenza degli emipeni), mentre nelle femmine è corta e con base di attacco ristretta. Per quanto riguarda lo stato fisiologico, si può verificare se un animale si trovi in fase di muta (pelle opaca e ruvida, ventre biancastro, occhio gelatinoso), se abbia ingoiato una preda di recente (tramite palpazione del ventre), oppure, nel caso di femmine, se siano gravide (con la tecnica di palpazione dei follicoli ovarici è possibile stimare, con un minimo margine di errore, il numero di uova o embrioni). Successivamente l´animale viene posto all´interno di un sacchetto di tela e trasportato al Museo di Storia Naturale e del Territorio di Calci per effettuare ulteriori analisi.
Una volta portato al museo, l´animale viene pesato, all´interno di un sacchetto la cui tara è rilevata volta a volta, sopra una bilancia elettronica da 0-400 g (precisione al ± 0,1 g).
Di seguito viene rilevata la lunghezza corporea, bloccando la testa dell´animale su un tavolo con una mano e stendendone il corpo accanto ad un metro a nastro (precisione 1 mm) con l´altra mano; si prendono così queste misure:
SVL (snout-vent length) = lunghezza dall´apice del muso alla cloaca; TL (total length) = lunghezza dall´apice del muso alla punta della coda.
L´operazione successiva consiste nella marcatura: è una tecnica che consente il riconoscimento individuale nelle ricatture ed è stata utilizzata sia in questo lavoro che in quelli precedenti sulle vipere della popolazione di Arnino e di Tombolo. Ogni esemplare è stato marcato incidendo con una forbicina per unghie le squame ventrali a destra e a sinistra in modo progressivo, dalla squama preanale compresa proseguendo in senso cefalico:
la prima serie di nove squame corrisponde alle unità, la seconda serie di nove squame corrisponde alle decine e la terza serie di nove squame corrisponde alle centinaia. In questo modo ogni animale possiede un proprio numero, che corrisponde a quello delle squame ventrali marcate.
Questa marcatura serve per il riconoscimento a lungo termine, in quanto la cicatrice permane di solito per mesi o anni. Talvolta il numero di marcatura è stato riportato sul dorso dell´animale con un pennarello resistente all´acqua (di solito UNIPOSCA): ciò consente un riconoscimento giornaliero e a breve termine, visto che tale numero permane fino alla muta successiva.
Fig. 11- Esempio di conteggio delle squame ventrali (foto Fabio Pupin).
I dati raccolti durante questo periodo di osservazione in vivo sono stati archiviati su schede giornaliere standardizzate (schede di campo). Successivamente gli esemplari maschi e i giovani sono stati riportati in campagna e liberati nello stesso punto in cui è avvenuta la loro cattura; le femmine adulte invece, sono state tenute temporaneamente in cattività per poterne studiare la biologia riproduttiva.
ESEMPLARI TENUTI IN CATTIVITÀ
Durante lo studio da me condotto sulla biologia riproduttiva di Vipera aspis francisciredi, sono stati tenuti temporaneamente in cattività presso il museo diversi esemplari adulti di sesso femminile. In particolare, nell´anno 2004, una femmina gravida catturata all´inizio del mese di agosto è stata trattenuta fino al momento del parto, avvenuto il 24/08/2004. Nell`anno 2005 invece, tutte le femmine adulte catturate nel periodo che va da aprile ad agosto (otto in totale) sono state tenute in cattività fino al mese di settembre. Fra queste soltanto due, catturate nell´estate 2005, sono risultate essere riproduttive.
Durante la loro permanenza al museo, queste otto femmine sono state misurate (SVL e TL) e marcate soltanto una volta, mentre la loro massa corporea è stata rilevata con cadenza settimanale: è stato così possibile osservare le variazioni della loro massa corporea, confrontando le femmine riproduttive con quelle non riproduttive.
Le vipere sono state tenute all´interno di appositi terrari, poste in condizioni di luce e temperatura ambiente e alimentate con topolini di allevamento: è stato offerto loro un topolino ogni 10-15 giorni.
Nel luglio 2005 tutte le femmine adulte sono state ecografate presso la clinica veterinaria di San Piero a Grado, in modo da poter osservare, nel caso di un`effettiva gravidanza, lo stadio di sviluppo di uova o embrioni.
Fig. 12- Ecografia dell´addome di una femmina gravida, in cui è possibile osservare un uovo con all´interno un embrione in precoce fase di sviluppo.
Una volta avvenuto il parto (nei casi da me seguiti, sempre nel mese di agosto), per la madre sono state annotate le seguenti variabili:
massa corporea pre partum: in realtà si tratta dell´ultima rilevazione della
massa corporea della madre prima del parto;
massa corporea post partum: massa corporea della madre subito dopo il
parto.
Per quanto riguarda i neonati invece, sono state annotate le seguenti variabili:
dimensioni della covata: il numero totale dei neonati della covata;
massa corporea: ogni neonato è stato pesato singolarmente; di seguito sono
state ricavate sia la massa totale della covata (somma dei pesi di tutti i neonati della covata), sia la massa corporea media dei neonati per covata (massa totale della covata/dimensioni della covata).
SVL: ogni neonato è stato misurato singolarmente; di seguito è stata ricavata
SVL di tutti i neonati della covata/dimensioni della covata). Lo stesso procedimento è stato successivamente adottato per la TL dei neonati.
È stata inoltre calcolata:
RCM (relative clutch mass) = massa relativa della covata: esprime, in
percentuale, la quantità di massa corporea investita dalla madre per lo sviluppo della covata = (massa totale della covata/massa corporea post partum) x 100.
Dopo queste operazioni i neonati sono stati marcati tramite incisione delle squame ventrali, e liberati, insieme alla madre, nel sito in cui è avvenuta la cattura della femmina.
Fig. 13- Misurazioni su un neonato partorito in laboratorio (agosto 2005).
CAMPIONI CONSIDERATI
Per realizzare questo lavoro, oltre ai dati da me raccolti negli anni 2004 e 2005, sono stati aggiunti ulteriori dati, raccolti nel corso di precedenti lavori in cinque diverse località dell´areale di distribuzione di Vipera aspis francisciredi: Tombolo (PI), Bosco della Fontana (MN), Castelfusano (RM) Tolfa200 (RM) e Tolfa400 (RM) (in queste ultime due località i numeri 200 e 400 si riferiscono all´altitudine a cui si trovano le due diverse popolazioni). Questi dati comprendono le stesse variabili biometriche e riproduttive descritte nel paragrafo precedente, e comprendono inoltre delle variabili riguardanti il clima e le caratteristiche geografiche delle cinque diverse località.
Per quanto riguarda il clima sono state considerate le seguenti variabili:
precipitazioni annuali, ovvero la quantità totale di pioggia (in millimetri)
caduta nell´arco di un anno;
temperatura media del mese più freddo: è stata calcolata la media delle
temperature (in °C) del mese di gennaio;
temperatura media del mese più caldo: è stata calcolata la media delle
temperature (in °C) del mese di luglio.
In particolare alcune analisi statistiche sono state effettuate confrontando le medie dei campioni provenienti dalle cinque diverse località.
Altre analisi statistiche riguardano invece la sola popolazione di Tombolo, l´unica popolazione cioè, fra le altre citate precedentemente, che comprende campioni sufficientemente grandi per poter effettuare le analisi.
Le femmine riproduttive esaminate, provenienti dalla popolazione di Tombolo, sono in tutto ventiquattro (N = 24), ma soltanto nove di queste hanno partorito in cattività (N = 9). Per effettuare i confronti statistici con le femmine riproduttive e con i neonati delle altre quattro popolazioni (Bosco della Fontana, Castelfusano, Tolfa200 e Tolfa400), sono state quindi considerate le variabili delle nove femmine riproduttive e della loro prole.
Nei confronti statistici che riguardano le femmine adulte della sola popolazione di Tombolo invece, sono state paragonate solo alcune variabili, come la lunghezza corporea (TL) e la massa corporea primaverile delle femmine riproduttive e delle femmine non riproduttive. Per queste analisi sono state quindi considerate tutte le femmine riproduttive, comprese quelle di cui non si conoscono le caratteristiche della prole.
METODI
STATISTICI
Per elaborare i dati è stato utilizzato il programma di statistica SPSS 8.0 per Windows xp nella versione Inglese.
Per verificare se i dati seguissero una distribuzione normale è stato inizialmente effettuato il test di Kolmogorov-Smirnov. La distribuzione dei dati è risultata normale e sono stati così impiegati dei metodi statistici parametrici.
Le dimensioni corporee degli esemplari esaminati sono espresse in millimetri (mm) mentre la loro massa corporea viene espressa in grammi (g).
Per ogni variabile vengono indicate le dimensioni campionarie (N) e la media campionaria ± 1 DS (DS = deviazione standard).
Per verificare se le diverse variabili fossero più o meno correlate fra loro è stato utilizzato il metodo delle analisi delle correlazioni semplici. Il grado di correlazione tra variabili in una distribuzione bivariata normale è dato da un coefficiente di correlazione “r” che assume tutti i valori compresi fra –1 e +1 (un valore prossimo a 1 indica una maggiore correlazione). Per queste analisi è stato utilizzato il coefficiente di correlazione di Pearson. Il valore di significatività consente una migliore interpretazione della relazione reciproca delle variabili che talvolta, anche se indicata dal coefficiente di correlazione, può riflettere un fattore casuale. Per convenzione una correlazione è considerata significativa quando p<0,05 (p=probabilità), quando esiste quindi una bassa probabilità di commettere un errore (Fowler e Cohen, 1993). Dai risultati di questa prima fase di analisi sono stati successivamente tracciati dei grafici a dispersione mettendo in relazione una
variabile considerata come indipendente con un´altra variabile definita dipendente. Sono stati quindi realizzati grafici a dispersione inserendo tutte le possibili coppie di variabili che avessero un coefficiente di correlazione il più vicino possibile all`unità.
Per verificare se esistono delle differenze significative fra le medie di due campioni indipendenti provenienti dalla popolazione di Tombolo è stato utilizzato il test t di Student. Questo metodo serve per confrontare le medie di due piccoli campioni e assume che le misure siano state prelevate da popolazioni distribuite normalmente e che le varianze dei campioni siano simili. Per controllare ciò si usa un test preliminare chiamato test F, il quale valuta la deviazione dall´unità del rapporto tra le varianze di due campioni e in particolare si trova:
F = varianza maggiore/varianza minore.
Il valore della probabilità di distribuzione di F è ricavato da specifiche tabelle che tengono conto anche dei gradi di libertà dei due campioni.
Per verificare se esistono delle differenze significative fra le medie dei campioni appartenenti alle cinque diverse popolazioni è stato utilizzato il metodo dell´analisi della varianza (ANOVA). Questo metodo è utile per confrontare le medie di due o più campioni, a condizione che la distribuzione dei dati campionari sia normale e le varianze dei campioni siano simili. Prima di procedere con questo metodo è quidi necessario verificare la similarità tra le due varianze con il test F, descritto precedentemente.
Se il risultato finale dell´F-test di ANOVA indica che esiste una differenza significativa fra le medie delle cinque popolazioni considerate, allora si procede con il test Post Hoc (LSD = Lesser Significant Difference) per le
comparazioni multiple. Con questo test è possibile osservare quale (o quali) popolazione (i), fra le cinque considerate, differisce (differiscono) tra tutte in maniera significativa e il relativo livello di significatività. Nel caso della RCM, trattandosi di dati espressi in percentuale, ho utilizzato i residuali standardizzati della regressione e sottoposto ad ANOVA i residuali, con test Post Hoc.
Per ordinare, e rendere più facilmente interpretabili, le numerose variabili considerate nel confronto fra le cinque diverse popolazioni, è stato utilizzato il metodo dell´analisi discriminante. Questo metodo ha lo scopo di effettuare una comparazione tra i vari gruppi sulla base di un gran numero di variabili, mettendo in luce le variabili che rivestono un ruolo primario nella separazione dei gruppi. L´analisi discriminante richiede che i valori delle variabili siano tratti da una distribuzione multivariata normale e che le matrici di covarianza siano uguali per tutti i gruppi. Il test M di Box è un test parametrico che può essere utilizzato per verificare l´uguaglianza della covarianza. Inoltre viene controllato il livello di tolleranza per le variabili (la tolleranza è il valore di 1-R2 della variabile in oggetto rispetto a tutte le altre
variabili nel modello). Vengono poi selezionate le funzioni che complessivamente spiegano dall´80 a poco più del 90% della varianza complessiva e vengono ordinate le prime due sugli assi X e Y.
