Materiali e Metodi
2.5.b Reazione cromogenica per la β-galattosidasi
Nella maggior parte degli esperimenti di microiniezione, insieme al trascritto di interesse abbiamo iniettato il messaggero per la β-galattosidasi nucleare. Questo metodo ci permette di individuare facilmente il lato iniettato da quello di controllo attraverso la reazione catalizzata dall’ enzima, il cui prodotto è colorato. Esistono diversi substrati per la β-galattosidasi, ad esempio il Salmon-gal che viene convertito in un prodotto di colorato rosato e l’ X-gal, che viene convertito invece in un prodotto di colore celeste.
Quando gli embrioni iniettati hanno raggiunto lo stadio desiderato, vengono fissati in MEMFA per 30 minuti. Dopo un breve lavaggio in tampone fosfato 0.1 M a pH 6.3, vengono incubati nella soluzione contenente Salmon-gal a 37°C fino a quando non sono sufficientemente colorati.
E’ importata colorare spesso la reazione di colorazione poiché la durata di questa fase è variabile (da 15 minuti a 1 ora).
Per interrompere la reazione cromogenica, si passano gli embrioni nel tampone fosfato per qualche minuti, infine, si fissano nuovamente in MEMFA per 30 minuti e si disidratano con brevi passaggi in soluzioni a concentrazione crescente di etanolo (EtOH).
Gli embrioni in EtOH 100% possono essere conservati a -20 °C oppure utilizzati per l’ ibridazione in situ “whole mount”.
Soluzioni:
Tampone fosfato 0.1 M, pH 6.3 (1 litro)
Na2HPO4 21.6 ml
NaH2PO4 78.4 ml
H2O mQ 900 ml
Materiali e Metodi
β-gal solution (10 ml)
C6FeK3N6 32.93 g
C6FeK4N63H2O 21.74 g
Salmon-gal 100 µl
Tampone fosfato fino a volume
2.5.c Ibridazione in situ “whole mount”
(Sive et al., 2000)
L’ibridazione attraverso la tecnica di “whole mount” permette di studiare il pattern d’ espressione di un gene durante lo sviluppo embrionale di Xenopus laevis oppure di verificare l’alterata espressione dei geni di interesse. Gli esperimenti svolti in questa tesi sono stati condotti seguendo il protocollo di Sive et al., 2000.
Durante l’esperimento gli embrioni si trovano in tubi (“vials”) “RNase free” (RF). La vetreria per essere RF viene tenuta in stufa per almeno 4 ore. Anche l’acqua e tutte le altre soluzioni utilizzate nell’ibridazione dovranno essere RF e quindi saranno sterilizzate in autoclave.
Tutti i passaggi, se non diversamente indicato sono eseguiti sistemando le “vials” in orizzontale su un agitatore, aggiungendo e rimuovendo ogni volta 5 ml di soluzione