Capitolo 2. MATERIALI E METODI 2.1 Disegno sperimentale e siti di campionamento

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Capitolo 2. MATERIALI E METODI

2.1 Disegno sperimentale e siti di campionamento

Gli individui di T. atlantica e C. stellatus utilizzati nel presente lavoro provengono da un campionamento più ampio effettuato in otto delle nove isole che compongono l’Arcipelago delle Azzorre (Portogallo): Flores, Corvo, S. Maria, São Miguel, Terceira, Graciosa, Fajal, Pico (Fig. 2.1). Le isole dell’Arcipelago delle Azzorre sono suddivise in tre gruppi (gruppo ovest di cui fanno parte Flores e Corvo; gruppo centrale di cui fanno parte Terceira, Graciosa, Pico e Fajal; gruppo est di cui fanno parte Santa Maria e São Miguel) ed il campionamento tiene conto della suddetta divisione.

Fig. 2.1. Area di campionamento, suddivisione delle Azzorre in tre gruppi di isole e

GRUPPO OVEST GRUPPO EST GRUPPO CENTRALE

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In ciascuna isola sono stati prelevati campioni di T. atlantica e C. stellatus da tre diverse località distanti tra loro 50-100 Km; in una località per isola sono anche stati prelevati individui da tre differenti siti distanti tra loro 100-200 m (Milana, 2004). Da ogni sito campionato sono stati prelevati 50-100 individui per ciascuna delle due specie e posti successivamente in provette contenenti etanolo al 96%. Gli organismi sono stati prelevati dalla parte di scogliera in cui la loro abbondanza era massima, al fine di campionare individui presenti nella parte di habitat più favorevole.

Dato il carattere preliminare del presente studio, mirato a testare l’efficacia dell’utilizzo di nuovi marcatori molecolari (ISSR) sulle specie di interesse, l’analisi della variabilità genetica spaziale è stata condotta in modo tale da permettere un’analisi sulle seguenti scale spaziali (Fig. 2.2):

• media scala, confrontando popolazioni d'individui provenienti da località diverse all’interno della stessa isola: il confronto è stato effettuato tra individui dell’isola di Terceira prelevati dalle località di Forcada e Baia das Mos.

• larga scala, confrontando individui provenienti da isole diverse: il confronto è stato effettuato tra individui campionati nelle località di Faja Grande (Flores), Maia (S. Maria), Baia das Mos (Terceira) e Forcada (Terceira).

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Fig. 2.2 Disegno sperimentale di campionamento.

Per ciascuna delle quattro località utilizzate nel presente studio sono stati analizzati 30 individui provenienti dal medesimo sito di campionamento, per un totale di 120 individui per ognuna delle due specie. In Tab. 2.1 sono riportati i dettagli dei campionamenti utilizzati nel presente lavoro.

Tab. 2.1: Località e siti campionati.

SITI DI CAMPIONAMENTO T. atlantica C. stellatus

ISOLA LOCALITA’ sito 1 sito 3 sito 1 sito 3

Flores Faja Grande X X

S. Maria Maia X X

Terceira Baia das Mos X X

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Il campionamento è stato effettuato nel periodo compreso tra il 5 e il 22 Luglio 2003; è importante sottolineare il fatto che negli studi riguardanti l’analisi spaziale della variabilità genetica è raccomandabile svolgere i campionamenti nell’arco di uno stesso periodo al fine di minimizzare l’effetto che la variabilità temporale potrebbe avere sul pattern genetico (Maltagliati & Camilli, 2000).

Consideriamo ora brevemente le isole i cui individui campionati sono stati utilizzati nel presente studio.

Santa Maria (gruppo est)

Fig. 2.3 Santa Maria.

Santa Maria (Fig. 2.3) è l’isola più orientale, più antica dell’Arcipelago delle Azzorre ed è, tra tutte, quella sismicamente più stabile (Morton & Britton, 1998). Le coste settentrionali ed orientali sono caratterizzate da alte scogliere che raggiungono un’altezza massima di 350 m sul livello del mare. La zona meridionale presenta una spiaggia sabbiosa, Praia, che evidenzia la posizione protetta di questo lato dell’isola.

SANTA MARIA Area: 97.42 Km2

LOCALITA’ E SITI DI CAMPIONAMENTO:

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Flores (gruppo ovest)

Le isole del gruppo ovest sono le uniche dell’Arcipelago delle Azzorre ad essere localizzate sulla Placca Americana.

Fig. 2.4 Flores.

Flores (Fig. 2.4) è l’isola più occidentale dell’Arcipelago delle Azzorre.

Terceira (gruppo centrale)

Fig. 2.5 Terceira.

Terceira (Fig. 2.5) è l’isola più orientale del gruppo centrale e la terza per estensione superficiale. Le sue coste sono caratterizzate da basse scogliere spesso interrotte, soprattutto nelle zone meridionali ed orientali, da piccoli avvallamenti. Mentre la costa settentrionale è soggetta ad un elevato idrodinamismo, quella orientale, di bassa elevazione, è più protetta. Sull’isola è presente la spiaggia più estesa dell’Arcipelago (circa 3 Km), costituita per un

TERCEIRA

Area: 318.96 Km2

LOCALITA’ E SITI DI CAMPIONAMENTO: 1) Baia das Mos S1

2) Forcada S1

FLORES

Area: 143.11 Km2

LOCALITA’ E SITI DI CAMPIONAMENTO: 2) Faja Grande S1

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terzo da frammenti terrigeni ignei e per i due terzi restanti da detriti organogeni quali frammenti di conchiglie, di aculei di echinodermi, resti di foraminiferi, di briozoi e di alghe calcaree.

2.2. Protocollo di estrazione del DNA per

Tesseropora

atlantica

e

Chthamalus stellatus

L’estrazione del DNA dagli individui di Tesseropora atlantica e

Chthamalus stellatus prevede l’utilizzo del metodo del “Salting Out” (Aljanabi & Martinez, 1997). Esso presenta due importanti vantaggi: l’utilizzo di sostanze non tossiche e la rapidità d'esecuzione. L’estrazione viene condotta sull’intero organismo privato della sola conchiglia. Il procedimento è il seguente:

1. risospendere l’individuo privato della conchiglia (conservato dopo il campionamento a -20 °C in etanolo al 96%) in una provetta da 1.5 ml con 270 µl di una soluzione contenente TNE (Tris-NaCl-EDTA) 1X, 1.5% di SDS (Sodio-Dodecil-Solfato) e con 30 µl di Proteinasi K [10mg/ml];

2. agitare velocemente e centrifugare brevemente; 3. incubare per 2-3 ore a 55°C;

4. aggiungere 100 µl di NaCl 6M; 5. agitare velocemente per 15 sec; 6. centrifugare per 18 min a 1300 rpm;

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7. preparare un nuovo set di provette da 1.5 ml in cui inserire 2 volumi (800 µl) di etanolo assoluto;

8. rimuovere il surnatante dal primo set (circa 300 µl) prestando attenzione a non prelevare l’eventuale schiuma presente sulla superficie e a non toccare il pellet bianco sul fondo della provetta; 9. addizionare il surnatante al set di provette contenenti etanolo

assoluto ed agitare manualmente;

10. mantenere la soluzione a –20°C per almeno 2 ore;

11. centrifugare per 15 min alla massima velocità (1300 rpm);

12. rimuovere l’etanolo assoluto (versandolo o pipettandolo), risospendere il pellet in 300 µl di etanolo al 70%, agitare velocemente e centrifugare per 5 min a 1300 rpm (rimuovere nuovamente l’etanolo assoluto e ripetere l’operazione 2-3 volte);

13. asciugare il pellet all’aria o nel blocco termostatato a 37°C lasciando aperto il coperchio della provetta;

14. risospendere il pellet in 30 µl di TE (Tris-EDTA) buffer. Agitare velocemente e centrifugare brevemente. Conservare il pellet cosi’ risospeso a 4°C per una notte per facilitarne la dissoluzione;

15. mantenere il DNA in soluzione in freezer a –20°C.

Il DNA estratto viene visualizzato su gel di agarosio all’1% contenente TBE (Tris-acido borico-EDTA) 1X; i campioni vengono preparati per la corsa

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elettroforetica aggiungendo 2 µl di tampone di migrazione e 6 µl di acqua a 2 µl di DNA.

2.3. Primer utilizzati e protocollo di amplificazione del DNA

I primer utilizzati nel presente studio sono stati usati in altri studi di genetica di popolazione dando buoni risultati (Casu et al., 2004). I primer, le loro sequenze e temperature di melting (Tm) sono riportati in Tab. 2.2.

Tab. 2.2 Primer utilizzati.

Primer Sequenza Tm

SAS1 5’-GTG(GTG)3GC-3’ 57.3°C SAS3 5’-GAG(GAG)2GAGC-3’ 46.8°C SAS5 5’-GT(GT)6GTC-3’ 50.3°C UBC809 5’-AG(AG)6AGG-3’ 46.6°C UBC811 5’-GA(GA)6GAC-3’ 43.3°C UBC827 5’-AC(AC)6ACG-3’ 54.9°C

Il ciclo della PCR utilizzato per tutti i primer è riassunto in Tab. 2.3 in cui non è specificata la temperatura di appaiamento poiché essa varia da un primer all’altro e, pertanto, verrà specificata di volta in volta.

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Tab. 2.3 Ciclo di PCR.

Denaturazione 94°C 3 min Denaturazione 94°C 40 sec Appaiamento TA°C 45 sec

Estensione 72°C 1 min e 40 sec

45 volte

Estensione 72°C 5 min

Per tutti i primer è stata utilizzata la seguente miscela di reazione (Tab. 2.4) che non riporta, però, le concentrazioni del primer e del cloruro di magnesio, poiché questi parametri sono stati modificati nel corso dell’ottimizzazione (i valori utilizzati nelle diverse reazioni verranno di volta in volta specificati) e variano da primer a primer. Tutte le reazioni sono state effettuate in un volume finale di 10 µl.

Tab. 2.4 Miscela di reazione.

9 Tampone 1µl (1X) 9 MgCl2 ?

9 dNTPs 0.8 µl (200 µM) 9 Primer ?

9 Taq Polimerasi 0.1 µl (0,5 U/µl) 9 DNA 1 µl (~30 ng)

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2.4. Ottimizzazione degli ISSR su

Tesseropora atlantica

Nel corso dell’ottimizzazione dei primer ISSR sono sorti problemi riguardanti soprattutto la presenza di bande poco definite che tendevano, in amplificazioni successive (condotte nelle stesse condizioni), ad apparire e scomparire. In tal modo alcuni prodotti non erano riproducibili in quanto davano di volta in volta un risultato differente. E’ stato, quindi, necessario aumentare la specificità della reazione in modo da eliminare prodotti non specifici dovuti all’appaiamento tra primer e siti non perfettamente complementari. A tal fine si è lavorato sui seguenti parametri: temperatura di appaiamento, concentrazioni di primer e di cloruro di magnesio.

Per quanto riguarda la temperatura di annealing, un suo aumento determina un incremento della specificità di appaiamento poiché in queste condizioni il primer si attacca solo alle sequenze perfettamente complementari. In linea generale sono state adottate temperature di appaiamento di poco inferiori a quelle di melting proprie dei vari primer. Nel caso, invece, del primer UBC811 è stato necessario aumentare la temperatura di annealing al di sopra di quella di melting (TA=50°C, Tm=43.3°C). Ciò al fine di migliorare la definizione del pattern di bandeggio e di aumentare la specificità della reazione.

Considerando, invece, le concentrazioni dei primer, sono state scelte concentrazioni inferiori a 2 µM (0.2 µl in un volume di reazione di 10 µl). In linea generale, infatti, basse concentrazioni di primer consentono di ottenere i

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migliori pattern di bandeggio e di aumentare la stringenza e, quindi, la ripetibilità della reazione stessa.

Infine, anche per quanto concerne il cloruro di magnesio, un aumento della sua concentrazione facilita l’attacco dei primer determinando, quindi, un decremento della stringenza della reazione. Al contrario, una diminuizione della concentrazione rende più difficile e, quindi, specifico l’attacco dei primer. Le concentrazioni di MgCl2 scelte, non superano mai 1 µM (0.2 µl in un volume di reazione di 10 µl).

I prodotti della PCR sono stati separati tramite elettroforesi, utilizzando gel di agarosio al 2% sottoposto ad una differenza di potenziale di 80V per 3h.

I pattern di bandeggio sono stati visualizzati utilizzando un transilluminatore UV e fotografati digitalmente con il sistema DigiDoc (DigiDoc-It Sistem, 2001).

Per quanto riguarda gli individui utilizzati nel corso delle ottimizzazioni, si rimanda all’Appendice 1. Per l’ottimizzazione di Tesseropora atlantica sono stati utilizzati individui provenienti da Faja Grande e Cerco che nei gel verranno indicati con FJ, CE seguiti dal numero dell’individuo in questione.

Tutte le reazioni di PCR a cui si farà riferimento in seguito sono state condotte in un volume finale di 10 µl.

2.4.1. Ottimizzazione del primer SAS1

Il processo di ottimizzazione del primer SAS1 su Tesseropora atlantica,

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Innanzitutto abbiamo deciso di utilizzare come protocollo iniziale il primo di quelli usati nel corso di una precedente ottimizzazione del primer SAS1 effettuata su quattro individui di Balanus amphitrite (La Spezia Porto (P) n° 1-4; Comacchio (C) n° 3-4). Tale prova (Fig. 2.6) è stata condotta ad una temperatura di annealing di 54°C, utilizzando una concentrazione di primer pari a 2 µM (0.2 µl) e di cloruro di magnesio di 1.5 mM (0.3 µl).

P P C C 1 4 3 4

Fig. 2.6 Prima prova nel percorso di ottimizzazione del primer SAS1.

La corsa elettroforetica ha evidenziato la presenza di bande abbastanza nitide. Al fine di migliorare la definizione delle bande è stata aumentata la stringenza della reazione abbassando la concentrazione di cloruro di magnesio ad un valore di 1 mM (0.2 µl), lasciando inalterata la concentrazione di primer e conducendo l’amplificazione a due temperature di annealing differenti (54°C/56°C); ciò ha portato al seguente pattern di bandeggio (Fig. 2.7).

MgCl2: 1.5 mM (0.3 µl) Primer: 2 µM (0.2 µl) TA = 54°C

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CE CE FJ FJ CE CE FJ FJ 11 24 13 27 11 24 13 27

Fig. 2.7. Seconda prova nel percorso di ottimizzazione del primer SAS1.

Come si evince dal gel sovrastante, abbiamo ottenuto un pattern di bandeggio soddisfacente, sia in numero di bande che in definizione. Tra le due diverse temperature testate abbiamo scelto quella corrispondente ai 56°C essendo, quest’ultima, la temperatura alla quale la definizione è più marcata.

Possiamo, quindi, schematizzare il protocollo ottimizzato per l’amplificazione di T. atlantica con il primer SAS1 nelle seguenti tabelle riassuntive (Tab. 2.5, 2.6).

Tab. 2.5 Ciclo di PCR per il primer SAS1. Denaturazione 94°C 3 min

Denaturazione 94°C 40 sec Appaiamento 56°C 45 sec

45 volte

MgCl2: 1 mM (0.2 µl) Primer: 2 µM (0.2 µl)

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Tab. 2.6 Miscela di reazione per il primer SAS1.

2.4.2. Ottimizzazione del primer SAS3

Nell’ottimizzazione del primer SAS3 abbiamo condotto una prima prova a due temperature di annealing diverse (43°C/46°C), utilizzando una concentrazione di cloruro di magnesio pari a 1 mM (0.2 µl) e di primer pari a 2 µM (0.2 µl). In queste condizioni abbiamo ottenuto il seguente bandeggio (Fig. 2.8). FJ FJ CE CE FJ FJ CE CE 13 27 11 24 13 27 11 24 9 Tampone 1µl (1X) 9 MgCl2 0.2 µl (1 mM) 9 dNTPs 0.8 µl (200 µM) 9 Primer 0.2 µl (2 µM)

9 H20 per portare a volume

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Al fine di migliorare il risultato ottenuto abbiamo abbassato la concentrazione del primer a 1 µM (0.1 µl), lasciando inalterata quella di MgCl2. FJ FJ CE CE FJ FJ CE CE

13 27 11 24 13 27 11 24

.

Fig. 2.9 Seconda prova nel percorso di ottimizzazione del primer SAS3.

Il pattern di bandeggio ottenuto (Fig. 2.9) è rimasto sostanzialmente invariato, motivo per cui si è ritenuto opportuno riportare la concentrazione del primer a 2 µM (0.2 µl) diminuendo, questa volta, la concentrazione di MgCl2 a 0.5 mM (0.1 µl).

FJ FJ CE CE FJ FJ CE CE 13 27 11 24 13 27 11 24

Fig. 2.10 Terza prova nel percorso di ottimizzazione del primer SAS3.

MgCl2: 1 mM (0.2 µl) Primer: 1 µM (0.1 µl) MgCl2: 0.5 mM (0.1 µl) Primer: 2 µM (0.2 µl) TA = 43°C TA = 46°C TA = 43°C TA = 46°C

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La corsa elettroforetica (Fig. 2.10) ha mostrato un bandeggio ben delineato soprattutto alla temperatura di 46°C. Bisogna sottolineare il fatto che in nessuna delle prove effettuate è stata ottenuta l’amplificazione degli individui CE n° 11-24, eccetto che nell’ultima prova condotta alla temperatura di 46°C in cui è risultata l’amplificazione di CE n° 24.

Le condizioni di ottimizzazione del primer SAS3 scelte sono, quindi, le seguenti (Tab.2.7, 2.8):

Tab. 2.7 Ciclo di PCR per il primer SAS3. Denaturazione 94°C 3 min

45 volte

Tab. 2.8 Miscela di reazione per il primer SAS3. 9 Tampone 1µl (1X)

9 MgCl2 0.1 µl (0.5 mM) 9 dNTPs 0.8 µl (200 µM) 9 Primer 0.2 µl (2 µM)

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2.4.3. Ottimizzazione del primer SAS5

Per il primer SAS5 abbiamo effettuato una prima prova a due temperature di annealing (48°C/50°C) differenti utilizzando una concentrazione di cloruro di magnesio di 0.5 mM (0.1 µl) ed una di primer di 1 µM (0.1 µl). Probabilmente a causa di un insufficiente quantitativo di MgCl2, però, non abbiamo ottenuto alcuna amplificazione. Abbiamo, quindi, aumentato la concentrazione di cloruro di magnesio a 1 mM (0.2 µl) e quella del primer a 3 µM (0.3 µl). Queste condizioni hanno condotto all’amplificazione del DNA ma non ad un soddisfacente bandeggio, come si evince dalla seguente corsa elettroforetica (Fig. 2.11).

Fig. 2.11 Seconda prova nel percorso di ottimizzazione del primer SAS5.

Il precedente tentativo ci ha consentito, comunque, di stabilire la concentrazione di cloruro di magnesio necessaria all’amplificazione ad un valore di 1 mM (0.2 µl).

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La terza prova è stata condotta a quattro differenti temperature (48°C/50°C/52°C/54°C) utilizzando 1 mM (0.2 µl) di MgCl2 e 2 µM (0.2 µl) di primer e ha dato i seguenti risultati (Fig. 2.12).

Fig. 2.12 Terza prova nel percorso di ottimizzazione del primer SAS5.

Il tentativo non ha portato ad un risultato soddisfacente: le bande ottenute non sono ben definite, l’individuo Cerco n° 24 non è stato mai

MgCl2: 1 mM (0.2 µl) Primer: 2 µM (0.2 µl) MgCl2: 1 mM (0.2 µl) Primer: 2 µM (0.2 µl) TA = 48°C TA = 50°C TA = 52°C TA = 54°C

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l’amplificazione dell’individuo Cerco n° 11 forse a causa delle elevate condizioni di stringenza tali da non consentire l’amplificazione dell’individuo in questione.

Nel successivo esperimento abbiamo, quindi, utilizzato temperature inferiori (46°C/50°C) unitamente ad una concentrazione di cloruro di magnesio di 1 mM (0.2 µl) ed una di primer di 1 µM (0.1 µl). Anche in questo caso, però, non abbiamo ottenuto risultati soddisfacenti (Fig. 2.13).

CE CE FJ FJ CE CE FJ FJ 11 24 13 27 11 24 13 27

Fig. 2.13 Quarta prova nel percorso di ottimizzazione del primer SAS5.

I successivi tentativi sono stati effettuati mantenendo inalterata la concentrazione di cloruro di magnesio, abbassando gradualmente quella del primer e modificando la temperatura di appaiamento. I risultati ottenuti sono i seguenti (Fig. 2.14):

TA = 50°C TA = 46°C

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FJ FJ CE CE FJ FJ CE CE 13 27 11 24 13 27 11 24 FJ FJ CE CE FJ FJ CE CE 13 27 11 24 13 27 11 24 FJ FJ CE CE FJ FJ CE CE 13 27 11 24 13 27 11 24

Fig. 2.14 Quinta, sesta, settima prova nel percorso di ottimizzazione del primer SAS5. MgCl2: 1 mM (0.2 µl) Primer: 0.5 µM (0.05 µl) MgCl2: 1 mM (0.2 µl) Primer: 0.3 µM (0.03 µl) MgCl2: 1 mM (0.2 µl) Primer: 0.2 µM (0.02 µl) CORSA n°1 CORSA n°2 CORSA n°3 TA = 49°C TA = 51°C TA = 48°C TA = 50°C TA = 49°C TA = 51°C

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Dall’analisi dei gel (Fig. 2.14) risulta evidente che ne’ una concentrazione di primer pari a 0.5 µM (Corsa n°1), ne’ una pari a 0.2 µM (Corsa n°3), consentono di ottenere una buona amplificazione. Al contrario, l’utilizzo del primer ad una concentrazione di 0.3 µM (Corsa n°2) conduce ad un pattern con bande ben delineate senza quasi traccia di smear, in particolare alla temperatura di 49°C.

Riassumendo, il ciclo della PCR ed il Master Mix ottimizzati per l’amplificazione di T. atlantica con il primer SAS5 sono i seguenti (Tab. 2.9, 2.10):

Tab. 2.9 Ciclo di PCR per il primer SAS5. Denaturazione 94°C 3 min

45 volte

Tab. 2.10 Miscela di reazione per il primer SAS5. 9 Tampone 1µl (1X)

9 MgCl2 0.2 µl (1 mM) 9 dNTPs 0.8 µl (200 µM) 9 Primer 0.03 µl (0.3 µM)

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2.4.4. Ottimizzazione del primer UBC811

Per l’ottimizzazione del primer UBC811 è stata effettuata una prova iniziale a due temperature di annealing (41°C/43°C) ed a due concentrazioni di cloruro di magnesio (1/0.5 mM corrispondenti a 0.2/0.1 µl in un volume totale di 10 µl) utilizzando una concentrazione di primer pari a 1 µM (0.1 µl).

FJ FJ CE CE FJ FJ CE CE 13 27 11 24 13 27 11 24 FJ FJ CE CE FJ FJ CE CE 13 27 11 18 13 27 11 18

Fig. 2.15 Prima prova nel percorso di ottimizzazione del primer UBC811.

TA = 41°C TA = 43°C MgCl2: 1 mM (0.2 µl) Primer: 1 µM (0.1 µl) TA = 41°C MgCl2: 0.5 mM (0.1 µl) Primer: 1 µM (0.1 µl) TA = 43°C

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Dall’analisi della corsa elettroforetica (Fig. 2.15) risulta evidente che una concentrazione di cloruro di magnesio pari a 0.5 mM (0.1 µl) è insufficiente per ottenere una buona amplificazione, ne consegue che la concentrazione ottimale di detto reagente è pari a 1 mM (0.2 µl). Le due differenti temperature d'annealing non sembrano, invece, influenzare il risultato.

Per migliorare ulteriormente il risultato ottenuto, abbiamo diminuito la concentrazione del primer a 0.5 µM (0.05 µl), conducendo la prova a tre diverse temperature (46°C/48°C/50°C). In tal modo abbiamo ottenuto il seguente pattern di bandeggio (Fig. 2.16).

FJ FJ CE CE FJ FJ CE CE FJ FJ CE CE 13 27 11 18 13 27 11 18 13 27 11 18

Fig. 2.16 Seconda prova nel percorso di ottimizzazione del primer UBC811.

L’analisi dei gel (Fig. 2.16) ha mostrato un risultato soddisfacente soprattutto alle condizioni di temperatura di annealing pari a 50°C che, tra le tre temperature testate, è quella che fornisce il maggior numero di bande.

MgCl2 : 1 mM (0.2 µl) Primer: 0.5 µM (0.05 µl)

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Per cercare di eliminare lo smearing presente la concentrazione di primer è stata diminuita ad un valore di 0.4 µM (0.04 µl); la prova condotta a due differenti temperature di annealing (43°C/46°C) ha mostrato il risultato osservabile in Fig. 2.17.

Fig. 2.17 Terza prova nel percorso di ottimizzazione del primer UBC811.

Non avendo ottenuto alcun miglioramento dello smearing ed avendo anche osservato una riduzione nel numero di bande, si è deciso di abbassare ulteriormente la concentrazione del primer: prima ad un valore di 0.3 µM (0.03 µl), poi ad un valore di 0.2 µM (0.02 µl). I risultati evidenziati dalla corsa elettroforetica sono i seguenti:

TA = 43°C TA = 46°C

MgCl2 : 1 mM (0.2 µl) Primer: 0.4 µM (0.04 µl)

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FJ FJ CE CE 13 27 11 18

Fig. 2.18 Quarta prova nel percorso di ottimizzazione del primer UBC811.

Fig. 2.19 Quinta prova nel percorso di ottimizzazione del primer UBC811.

L’amplificazione condotta con 0.3 µM (0.03 µl) di primer (Fig. 2.18) ha dato un risultato ben poco soddisfacente mentre quella effettuata con 0.2 µM (0.02 µl) (Fig. 2.19) ha prodotto un miglioramento dello smear ma, al contempo, la perdita di gran parte delle bande.

Fra tutte le prove effettuate si sono scelte, per l’amplificazione con il primer UBC811, le seguenti concentrazioni:

MgCl2: 1 mM (0.2 µl) MgCl2 : 1 mM (0.2 µl) Primer: 0.2 µM (0.02 µl) MgCl2: 1 mM (0.2 µl) Primer: 0.3 µM (0.03 µl) TA = 43°C TA = 46°C TA = 50°C

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In tali condizioni, infatti, la luminosità delle bande è tale da rendere i risultati facilmente interpretabili. Per quanto riguarda la temperatura di annealing, tra le differenti temperature testate, è stata scelta quella corrispondente a 50°C, temperatura alla quale si ottiene il maggior numero di bande.

Il protocollo di amplificazione e il Master Mix ottimizzati per il primer UBC811 su T. atlantica sono riassunti nelle tabelle 2.11, 2.12:

Tab.2.11 Ciclo di PCR per il primer UBC811. Denaturazione 94°C 3 min

45 volte

Tab. 2.12 Miscela di reazione per il primer UBC811. 9 Tampone 1µl (1X)

9 MgCl2 0.2 µl (1 mM) 9 dNTPs 0.8 µl (200 µM) 9 Primer 0.05 µl (0.5 µM)

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2.4.5. Ottimizzazione del primer UBC827

La prima prova (Fig. 2.20) nel percorso di ottimizzazione del primer UBC827 su Tesseropora atlantica è stata condotta a due temperature di annealing (52°C/54°C) utilizzando un quantitativo di cloruro di magnesio pari a 1 mM (0.2 µl) e di primer pari a 2 µM (0.2 µl).

Fig. 2.20 Prima prova nel percorso di ottimizzazione del primer UBC827.

Allo scopo di eliminare lo smearing presente, abbiamo provato ad abbassare il cloruro di magnesio a 0.5 mM (0.1 µl) ed il primer a 1 µM (0.1µl) effettuando l’amplificazione ad una temperatura di 54°C. Ciò però, probabilmente a causa dell’utilizzo di condizioni di stringenza molto marcate, non ha consentito l’ottenimento di un buon prodotto d'amplificazione come si evince dalla corsa elettroforetica mostrata in Fig.2.21.

MgCl2: 1 mM (0.2µl) Primer: 2 µM (0.2µl)

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FJ FJ CE CE 13 27 11 24

Fig. 2.21 Seconda prova nel percorso di ottimizzazione del primer UBC827.

Si è deciso, quindi, di aumentare la concentrazione del primer mantenendo inalterata quella del cloruro di magnesio e di effettuare la prova a tre temperature di annealing (52°C/54°C/56°C). La corsa elettroforetica ha portato al bandeggio mostrato in Fig. 2.22:

Fig. 2.22 Terza prova nel percorso di ottimizzazione del primer UBC827. MgCl2: 0.5 mM (0.1 µl) Primer: 2 µM (0.2µl) TA = 52°C TA = 54°C TA = 56°C MgCl2: 0.5 mM (0.1 µl) Primer: 1 µM (0.1µl) TA = 54°C

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I risultati ottenuti, oltre a non aver dato un pattern meglio definito rispetto a quello della prima prova, hanno evidenziato una diminuzione numerica delle bande, in particolare alle temperature d'annealing più elevate.

Prendendo come riferimento la prima delle prove effettuate (Fig. 2.20), un’ulteriore amplificazione è stata condotta, sempre a differenti temperature, utilizzando concentrazioni di primer pari a 1 µM (0.1 µl) e di cloruro di magnesio pari a 1 mM (0.2 µl). In tal modo abbiamo ottenuto un pattern di bandeggio soddisfacente con bande ben delineate ed uno smear del tutto trascurabile (Fig. 2.23).

Fig. 2.23 Quarta prova nel percorso di ottimizzazione del primer UBC827.

Tra le tre diverse temperature testate abbiamo scelto quella corrispondente ai 54°C. Quest’ultima temperatura, infatti, conduce ad una migliore risoluzione del bandeggio unitamente ad una buona intensità luminosa

MgCl2: 1 mM (0.2 µl) Primer: 1 µM (0.1µl)

(30)

delle bande. Riassumendo, per l’amplificazione di T. atlantica condotta con il primer UBC827 utilizzeremo i protocolli indicati nelle Tab. 2.13, 2.14:

Tab. 2.13 Ciclo di PCR per il primer UBC827. Denaturazione 94°C 3 min

45 volte

Tab. 2.14 Miscela di reazione per il primer UBC827.

2.5. Ottimizzazione degli ISSR su

Chthamalus stellatus

Nel corso di questo studio sono stati utilizzati come organismi modello due specie di crostacei cirripedi toracici a differente dispersione larvale:

Tesseropora atlantica e Chthamalus stellatus. Per consentire il confronto tra le due specie è di fondamentale importanza che le condizioni di amplificazione

9 Tampone 1µl (1X) 9 MgCl2 0.2 µl (1 mM) 9 dNTPs 0.8 µl (200 µM) 9 Primer 0.1 µl (1 µM)

(31)

siano le stesse, onde evitare di inserire variabilità dovuta alle procedure metodologiche. Bisogna, tuttavia, considerare che i primer ISSR non sono specifici e, quindi, si attaccano ovunque trovino un sito complementare e perciò, le porzioni di genoma amplificate nelle due specie sono con tutta probabilità differenti.

Al fine di mantenere omogeneità metodologica, per l’amplificazione di

C. stellatus tramite i primer ISSR sono state utilizzate le condizioni ottimizzate precedentemente su T. atlantica. L’analisi dei gel (Figg. 2.24, 2.25, 2.26, 2.27, 2.28) ha mostrato risultati soddisfacenti con bande ben delineate. Di seguito vengono riportati i risultati delle corse elettroforetiche relative ai vari primer e le condizioni utilizzate. Nelle prove preliminari sono stati utilizzati individui provenienti dalle località di Faja Grande, Baia das Mos, Forcada, Maia che verranno indicate con FJ, B, F, M seguite dal numero dell’individuo in questione.

FJ FJ FJ B B B F F F M M M 1 2 3 5 6 7 1 2 5 1 2 3

Fig. 2.24 Prova su C. stellatus delle condizioni ottimizzate per il primer SAS1. SAS1

MgCl2: 1 mM (0.2 µl) Primer: 2 µM (0.2 µl) TA= 56°C

(32)

FJ FJ B B F F M M 1 2 5 6 1 2 1 2

Fig. 2.25 Prova su C. stellatus delle condizioni ottimizzate per il primer SAS3. FJ FJ FJ B B B F F F M M M

1 2 3 5 6 7 1 2 5 1 2 3

Fig. 2.26 Prova su C. stellatus delle condizioni ottimizzate per il primer SAS5. FJ FJ FJ B B B F F F M M M

1 2 3 5 6 7 1 2 5 1 2 3

Fig. 2.27 Prova su C. stellatus delle condizioni ottimizzate per il primer UBC811. SAS3 MgCl2: 0.5mM (0.1 µl) Primer: 2 µM (0.2 µl) TA= 46°C SAS5 MgCl2: 1 mM (0.2 µl) Primer: 0.3 µM (0.03 µl) TA= 49°C UBC811 MgCl2: 1 mM (0.2 µl) Primer: 0.5 µM (0.05 µl) TA= 50°C

(33)

FJ FJ FJ B B B F F F M M M 1 2 3 5 6 7 1 2 5 1 2 3

Fig. 2.28 Prova su C. stellatus delle condizioni ottimizzate per il primer UBC827.

2.6. Trattamento statistico dei dati

I marcatori ISSR sono dominanti e vengono trattati come loci diallelici in cui l’allele dominante A determina la presenza della banda; pertanto, gli individui con genotipo AA e Aa producono bande (fenotipo 1) mentre quelli con genotipo aa non ne producono alcuna (fenotipo 0).

Le analisi statistiche, effettuate nel presente studio, sono state condotte allo scopo di mettere in evidenza la diversità genetica intrapopolazione ed interpopolazioni nelle due specie oggetto di studio. A tal fine sono stati utilizzati i seguenti programmi: 1) TFPGA (Miller, 1997) per il calcolo dell’F-statistica (Fst) e per la costruzione di dendogrammi UPGMA, 2) Popgene (Yeh et al, 1997) che ha consentito di calcolare l’eterozigosità attesa (Nei 1973) e l’indice di Shannon, 3) IBD (Jensen et al., 2005) attraverso cui sono stati effettuati i test di Mantel

UBC827 MgCl2: 1 mM (0.2 µl) Primer: 1 µM (0.1 µl) TA= 54°C

(34)

calcolo del t-test, 5) Arlequin versione 3.1 (Excoffier et al., 2005) per l’analisi della varianza molecolare (AMOVA).

Le analisi sono state condotte sotto l’assunzione che le popolazioni fossero in equilibrio di Hardy-Weinberg.

Quale misura della diversità genetica basata sulle frequenze alleliche è stata utilizzata l’eterozigosità attesa media [diversità genetica di Nei (1973)].

L’eterozigosità attesa (H) è il descrittore della variabilità genetica presente all’interno delle popolazioni più utilizzato. Per un locus essa è la frazione di genotipi eterozigoti attesa in base all’equilibrio di Hardy-Weinberg ed è data dall’equazione:

dove k è il numero degli alleli e pi è la frequenza dell’i-esimo allele nel

campione. Se c’è completa omogeneità e tutti gli individui hanno lo stesso genotipo il valore di H è nullo, mentre se tutti gli individui hanno genotipi diversi, H assume il valore massimo (1). Per il calcolo dell’eterozigosità di una popolazione viene utilizzato il valore medio delle eterozigosità di tutti i loci.

L’analisi dell’eterogeneità genetica tra campioni è stata effettuata tramite il calcolo dell’indice θ di Weir & Cockerham (1984), analogo all’FST di Wright (1978). Esso descrive il livello di divergenza genetica tra le popolazioni e può assumere valori compresi tra 0 ed 1: più il valore è vicino a 0 minore è la diversità genetica tra le popolazioni in esame. Pertanto, se θ=0 siamo in una situazione di panmissia (non c’è divergenza tra le popolazioni), se θ=1 siamo in condizioni di isolamento completo (divergenza genetica estrema). Come regola

∑

=

−

=

k i i

p

H

1 2

1

(35)

empirica valori di θ fino a 0.05 indicano differenze genetiche trascurabili, mentre valori superiori a 0.25 indicano un’elevata divergenza genetica.

Attraverso il programma TFPGA è stata effettuata l’analisi dei cluster UPGMA ottenuti dalla matrice delle distanze genetiche di Nei (1978) tra i campioni. Le distanze genetiche misurano la differenza genetica tra le popolazioni confrontando le frequenze alleliche, tenendo conto dei loci analizzati nel loro complesso. Esistono vari tipi di distanze genetiche, quella da noi utilizzata (Nei, 1978) è indipendente dalle dimensioni dei campioni. La robustezza dei nodi dei dendogrammi è stata valutata mediante “bootstrap” con 10000 repliche.

L’indice di Shannon, calcolato secondo Lewontin (1972), fornisce un’ulteriore misura della variabilità genetica intrapopolazionale. È espresso dall’equazione:

Dove con ni = numero di alleli degli i-esimi loci

N = numero totale di alleli S= numero totale di loci.

Per saggiare l’ipotesi di isolamento da distanza, cioè la possibile relazione tra distanza genetica e distanza geografica per ciascuna coppia dei campioni, è stato utilizzato il test di Mantel (1967), analisi non parametrica che consente di determinare l’eventuale correlazione tra due matrici di distanza. Nel presente

i e S i i

P

D

log

1

∑

=

N

n

P

i i

=

(36)

matrice di θ è stata costruita calcolando θ tra le varie coppie di località (utilizzando il programma TFPGA). Le distanze geografiche tra le coppie di località sono state misurate in chilometri, utilizzando un atlante geografico digitale (Google Earth). L’ipotesi nulla del test è l’indipendenza tra le due matrici. I valori di probabilità sono stati ottenuti mediante 10000 permutazioni.

L’analisi della varianza molecolare (AMOVA, Excoffier et al., 1992) è un test statistico che consente di ripartire la variabilità genetica su più livelli gerarchici. Nel presente studio la variabilità genetica è stata scomposta a tre diversi livelli: 1) differenze tra individui all’interno di una stessa località, 2) differenze tra località all’interno della stessa isola, 3) differenza tra le isole.

Le scarse differenze intraspecifiche ed interspecifiche riscontrate tra i valori della diversità genetica di Nei (1973) e tra i valori dell’indice di Shannon hanno reso necessario l’effettuazione del t-test al fine di testare se le differenze riscontrate erano significative o meno.