4. Materiali e metodi

4. Materiali e metodi

Obiettivo dello studio era quello di valutare l’effetto dell’età dei riproduttori su diversi aspetti legati alle performance riproduttive della pernice rossa (Alectoris rufa rufa); tra questi, particolare attenzione è stata posta alla mortalità embrionale. In aggiunta, anche l’effetto della durata dello stoccaggio delle uova è stato studiato attraverso l’osservazione del tasso di schiusa delle uova stesse.

Lo studio si inserisce nel contesto delle ricerche condotte dal Dipartimento di Scienze Veterinarie, in collaborazione con il Centro Pubblico di Produzione Selvaggina del Casolino di Scarlino (GR) e di cui Responsabile scientifico è il Dott. Baldassare Fronte.

4.2 Specie oggetto dello studio

Lo studio è stato condotto presso il Centro Pubblico di Produzione Selvaggina “ Casolino”, ricadente nell’area di competenza delle Bandite di Scarlino.

La ricerca è stata eseguita su un numero totale iniziale di 732 coppie di pernici rosse (Alectoris rufa rufa) la cui distribuzione per classi di età è riportata in tabella 1.

Le coppie che non hanno deposto alcun uovo durante tutto il periodo di deposizione, non sono state prese in considerazione ai fini dello studio in quanto, di solito, la loro sterilità dipende da cause non strettamente legate a fattori genetici della pernice rossa ma, più in generale, a influenze di tipo “ambientale” quali l’incidenza di tecnopatie di allevamento, errori di formazione delle coppie (soggetti dello stesso sesso) o, più in generale, il management aziendale.

Per tale ragione, ai fini dello studio delle performance riproduttive, vengono prese in considerazione esclusivamente le coppie che, durante il periodo di deposizione, hanno prodotto almeno un uovo (“coppie idonee”); anche il numero di coppie idonee è quindi riportato in tabella 1.

Tabella 4.1. Numero delle coppie suddivise in base all’età dei riproduttori

Età Totale coppie iniziali n°

Totale coppie idonee n° 1 ANNO 51 41 2 ANNI 215 163 3 ANNI 215 156 4 ANNI 215 176 TOTALE 732 536

Le uova deposte da ciascuna coppia, quindi, sono state registrate giornalmente ed il numero totale

di uova deposte per coppia, durante tutta la stagione riproduttiva, è stato calcolato;

4.3 Parametri misurati

I parametri riproduttivi misurati sono stati i seguenti:

1. produzione di uova, intesa come numero di uova incubate durante tutto il periodo riproduttivo;

2. percentuale di deposizione, intesa come numero di coppie produttive sulle totali;

3. fertilità apparente delle uova, calcolata sulla base del numero di uova scartate in fase di speratura, questa effettuata all’ottavo giorno di incubazione;

4. età di morte degli embrioni, valutata tramite l’apertura di uova non schiuse al termine del periodo di incubazione (24° giorno);

5. percentuale di schiusa, calcolata come numero di soggetti nati sul numero totale di uova incubate.

4.4 Metodologia utilizzata

Le coppie sono state allevate (foto 1), durante tutta la stagione riproduttiva, in apposite gabbie di allevamento metalliche (dimensioni 45 x 80 x h 30 cm), munite ognuna di un impianto automatico a goccia per l’acqua di bevanda ed una mangiatoia all’interno, che veniva rifornita di mangime, di norma, una volta ogni 15 giorni.

Ogni gabbia era dotata di una zona aperta e una coperta; quest’ultima serve sia per permettere agli animali di sottrarsi alla vista degli operatori, sia come riparo, per proteggersi dal sole e dagli altri agenti atmosferici.

Le gabbie sono munite di un piano leggermente inclinato che permette alle uova, una volta deposte, di rotolare subito in una apposita canaletta, posizionata al loro esterno, dalle quale poi venivano raccolte giornalmente dagli operatori.

Foto 4.1. Gabbie da riproduttori (Foto di Gennai S.)

Al fine di anticipare il periodo riproduttivo, gli animali sono stati sottoposti a un fotoperiodo artificiale: ogni settimana, a partire dal mese di gennaio, questo è stato aumentato di un ora fino a raggiungere 16 ore di luce (composte da luce naturale più luce artificiale) e 8 ore di buio al giorno. La luce artificiale, che aveva un’intensità di circa 35 Lux, è stata mantenuta fino a quando quella naturale non ha coperto tutta la lunghezza del fotoperiodo. In questo modo, quindi, la deposizione delle uova ha avuto inizio la prima settimana di marzo e si è conclusa la prima settimana di giugno; la durata complessiva del periodo di deposizione è stata quindi pari a 14 settimane.

Raccolta delle uova

Durante tutto il periodo, le uova sono state raccolte una volta al giorno, nelle prime ore del mattino.

Ogni uovo, al momento della raccolta, è stato contrassegnato con un codice composto dal numero della coppia che lo aveva deposto e la lettera iniziale del giorno in cui era stato raccolto (per i giorni martedì e mercoledì sono state utilizzate invece le prime due lettere).

In seguito, sulla relativa gabbia, è stato annotato il numero crescente di uova prodotte dalla medesima coppia tramite l’utilizzo di un cartellino su cui era indicata una serie di numeri che andava da 0 a 9; sul cartellino erano state posizionate due mollette: una molletta blu, con cui si indicava l’unità e una molletta rosa, con cui venivano indicate le decine. Per ogni uovo raccolto la molletta blu veniva spostata di uno spazio. Questo metodo permette di quantificare il totale delle uova prodotte da ogni coppia al termine di tutta la stagione riproduttiva (foto 2).

Stoccaggio

Le uova deposte, una volta raccolte, venivano portate in una apposita stanza adibita al loro stoccaggio, dove venivano conservate da un minimo di uno ad un massimo di 7 giorni, prima di essere incubate. Hanno fatto eccezione a tale pratica le prime due settimane di deposizione e le ultime due, per le quali le uova sono state incubate solo dopo essere state conservate fino a 14 giorni; ciò rappresenta una normale prassi di allevamento in quanto, all’inizio e alla fine del periodo di deposizione, la produzione è più bassa ed è necessario un periodo più lungo per poter caricare l’incubatrice con un numero idoneo di uova.

Sono state effettuate operazioni di pulizia e disinfezione in presenza di uova eccessivamente sporche di feci; inoltre, eventuali uova rotte, di dimensioni e forme irregolari o con difetti del guscio sono state scartate.

Foto 4.3. Stoccaggio delle uova (Foto di Gennai S.)

Per lo stoccaggio, le uova sono state posizionate su degli appositi vassoi, con il polo acuto rivolto verso il basso; a loro volta, i vassoi venivano sistemati su una struttura basculante che permetteva una rotazione di 90°, una volta al giorno. Nella stanza di stoccaggio, infine, in assenza di ventilazione, le uova sono state mantenute ad una temperatura compresa tra 16-17 °C ed umidità relativa pari a 70-80% tramite un condizionatore presente nella stanza.

Incubazione e speratura

Dopo essere state stoccate per 7 giorni, le uova sono state incubate ad una temperatura di 99,7 °F (37,6 °C) e umidità relativa del 47%. La stanza dove si trovava l’incubatrice è stata mantenuta a una temperatura di 75,2 °F (24 °C) e ad una umidità del 55%.

L’incubatrice eseguiva automaticamente il voltaggio delle uova una volta l’ora. Le macchine, anche se dotate di allarmi che segnalavano la presenza di anomalie, sono state controllate almeno due volte al giorno per verificare il loro corretto funzionamento.

All’ottavo giorno di incubazione è stata effettuata la speratura, che di norma viene eseguita con l’obiettivo di individuare precocemente le uova non fertili e la presenza di embrioni morti; le uova che presentavano queste caratteristiche sono state scartate e segnate su dei registri.

Schiusa

Al 21° giorno di incubazione, le uova sono state trasportate nella camera di schiusa o schiuditrice, dove sono state tenute fino alla nascita dei pulcini; nelle camera di schiusa è stata mantenuta una temperatura di 37,2 °C (99 °F), leggermente più bassa rispetto a quella presente nell’incubatrice, e l’umidità relativa è statainizialmente abbassata al 43% i primi due giorni, poi è stata alzata al 56%, per essere poi nuovamente abbassata al 47% al momento della nascita dei pulcini.

Foto 4.5. Schiusa (Foto di Gennai S.)

Durante gli ultimi tre giorni è necessario che le uova non siano mai voltate perché il pulcino si prepara alla nascita e si mette nella posizione che gli consentirà di rompere il guscio. La schiusa è avvenuta al 24° giorno e l’apertura della camera di schiusa è stata eseguita quando il 90% circa dei pulcini risultava asciutto.

Le uova non schiuse sono state segnate su dei registri ed è stato possibile quindi valutare il numero di nati e la percentuale di schiusa di ciascuna coppia.

Trasferimento dei pulcini nelle camere calde

In seguito alla schiusa i pulcini sono stati messi in delle apposite scatole di cartone con del truciolo di legno bianco sul fondo; ogni scatola era composta da due sezioni e all’interno di ognuna venivano introdotti 50 pulcini. In questo modo sono stati trasferiti nelle strutture destinate al loro accrescimento: le camere calde.

Queste venivano preparate dagli operatori qualche giorno prima della schiusa, in modo da permettere alla stanza di raggiungere la temperatura ottimale (37 °C) e garantire buone condizioni ambientali per l’accrescimento e il benessere dei pulcini stessi.

Nelle settimane successive alla schiusa, le camere calde venivano controllate più volte durante il giorno, per verificare lo stato di salute generale di tutti gli animali presenti. Ogni giorno veniva distribuito il mangime e controllati gli abbeveratoi.

Ai fini dello studio, il periodo di deposizione, durato un totale di 14 settimane, è stato suddiviso in tre sotto-periodi:

1. Periodo iniziale: prima, seconda, terza e quarta settimana di deposizione;

2. Periodo centrale: dalla quinta alla decima settimana di deposizione;

3. Periodo finale: dall’undicesima alla quattordicesima settimana di deposizione.

Questa suddivisione è stata utilizzata per la valutazione della fertilità, mentre la schiusa è stata studiata sulla base di cinque delle quattordici settimane totali.

Percentuale di deposizione

Per la valutazione della percentuale di deposizione, suddivisa per età dei riproduttori, sono stati eseguiti, in ordine, i seguenti passaggi:

1. Calcolo delle coppie effettivamente produttive (“coppie idonee”)durante tutto il periodo di deposizione, come già descritto in precedenza;

2. Calcolo del totale delle uova prodotte da ogni coppia per ciascuna settimana di deposizione;

3. Calcolo delle “uova attese”, ottenuto moltiplicando il numero di coppie produttive per il numero di giorni di una settimana (7);

4. Calcolo della percentuale di deposizione, ottenuta dal rapporto tra il numero di uova prodotte e quelle attese, moltiplicato per cento.

Effetto della durata di conservazione sulla percentuale di schiusa delle uova

Per valutare l’effetto della durata di conservazione delle uova sul tasso di schiusa delle stesse e al fine di ridurre la possibile variabilità dovuta all’età dei riproduttori, sono state prese in considerazione le uova prodotte solo dalle coppie di tre anni di età (156 coppie in totale).

Quindi, le uova sono state raccolte e stoccate per due settimane consecutive e l’esperimento è stato ripetuto per due volte al fine di aumentare l’accuratezza dei risultati ottenuti; il primo esperimento è stato condotto nella settima e ottava settimana di deposizione, il secondo nella tredicesima e quattordicesima settimana.

Le uova, raccolte secondo le procedure già descritte sopra, venivano poi conservate da un minimo di uno ad un massimo di 14 giorni. Ciascun uovo, ovviamente, è stato segnato individualmente come di seguito descritto:

 Uovo prodotto nella prima settimana di raccolta: numero della coppia che lo ha deposto e

lettera iniziale del giorno della settimana in cui era stato raccolto;

 Uovo prodotto nella seconda settimana di raccolta: numero della coppia che lo ha deposto

Foto 4.6. Uova con codici diversi in base alla settimana di raccolta (Foto di Pompignoli M.)

Come di consueto, anche in questo caso le uova sono state sottoposte a speratura all’ottavo giorno di incubazione, scartando le uova risultate non fertili, con embrioni morti o con il guscio incrinato; l’esito dell’incubazione di ogni uovo è stato ugualmente osservato e registrato. Successivamente le uova, sono state raggruppate per classi di durata di conservazione (3-4 giorni) in modo tale da limitare l’incidenza di possibili errori nell’attribuzione del giorno di deposizione a ciascun uovo. La raccolta delle uova veniva infatti compiuta una sola volta al giorno, la mattina, ed era quindi possibile che qualche uovo fosse stato deposto il giorno precedente a quello preso in considerazione.

Infine, il periodo totale di conservazione, della durata complessiva di 14 giorni, è stato suddiviso in quattro sotto-periodi:

 Da 1 a 3 giorni di incubazione;  Da 4 a 7 giorni;

 Da 8 a 10 giorni;

Valutazione dell’età di morte embrionale

Per il seguente studio sono state tenute in considerazione quattro settimane di deposizione: l’ottava, la nona, la decima e l’undicesima.

Per valutare l’età di morte embrionale sono state prese, al 24° giorno, le uova non schiuse e una parte di esse, in maniera completamente casuale, è stata aperta.

Durante le quattro settimane di deposizione prese in considerazione, tutte le uova non schiuse sono state registrate e, in seguito, circa quaranta uova per ogni età (1, 2, 3 e 4), casualmente scelte, sono state aperte e l’età di morte dell’embrione è stata stimata secondo quanto descritto da Fronte et al. (2006).

In particolare, le uova sono state aperte e dopo la rottura del guscio gli embrioni sono stati adagiati e distesi su una superficie piana e di colore chiaro per creare un migliore contrasto ottico. Gli embrioni sono stati sistemati sul piano di appoggio con l’aiuto di una pinzetta e per ognuno è stata valutata l’età di morte embrionale attraverso un’osservazione macroscopica dell’embrione. Per questo studio è stata presa come modello di riferimento la tabella sottostante: tabella dello sviluppo embrionale (Fronte et al, 2006) e la scheda di “determinazione dell’età dell’embrione” SDE (Giuliacci, 2010).

L’intero periodo di incubazione, della durata di 24 giorni, è stato suddiviso in sotto-periodi seguendo lo schema descritto in bibliografia (Souver, 1988):

 Periodo 1: dal 1° all’ 8° giorno di incubazione;

 Periodo 2: dal 9° al 20° giorno di incubazione;

Foto 4.7. Embrioni morti a diversi stadi di sviluppo (Foto di Gennai S.)