Principali metodologie elettroforetiche nella ricerca e nella diagnostica biomedica
1930-1940 (Tiseluis) Elettroforesi a
“fronte mobile”
Elettroforesi
”zonale”
1960-1980 Elettroforesi
“capillare”
1937 (Koning) Su strato sottile
Fine anni ‘50 Su gel
Di poliacrilammide (PAGE)
Di agarosio (AGE)
1966 (Vesterberg e Svensson) Per focalizzazione isoelettrica
(IEF)
1970 (Laemmli) In presenza di SDS
(SDS-PAGE)
1975 (O’Farrel)
Elettroforesi Bidimensionale (2DE)
Gel di agarosio, Nativa,
SDS-PAGE,
Isoelettrofocalizzazione, 2D-PAGE
Tecniche elettroforetiche:
Gel di
poliacrilammide
L’elettroforesi è una tecnica che consiste nella migrazione differenziata
in un campo elettrico, di molecole elettricamente cariche.
protein electrophoresis
nucleic acids electrophoresis
Elettroforesi verticale e orizzontale
tecnica che permette di separare facilmente i frammenti di DNA.
A seconda della loro lunghezza i frammenti rimarranno intrappolati nelle maglie formate dall'agarosio
Gel di agarosio : digestione enzimatica miniprep rFAAH-DTM .
Il SYBR Green I è un agente intercalante e si lega preferenzialmente a DNA a doppio filamento (dsDNA). Il complesso DNA-colorante assorbe luce blu ad una lunghezza d'onda λmax = 488 nm ed emette luce verde λmax = 522 nm. Altri picchi di assorbimento, sebbene
Std non dig 2013 2015
50000 bp 2000 bp 1650 bp
Digestione enzimatica miniprep rFAAH-DTM (2013-2015)
Std non dig digerito
50000 bp
2000 bp 1650 bp
50000 bp 2000 bp 1650 bp
Std Prot1 Prot2
Digestione enzimatica miniprep delle proteine 1 e 2
Tecnica che permette di separare facilmente le proteine.
Purificazione della proteina rFAAH DTM. SDS-PAGE
Elettroforesi su gel di poliacrilammide
Due Tipi:
•Elettroforesi Nativa: le proteine si muovono in funzione della loro massa e della loro carica netta
•Elettroforesi Denaturante in presenza di SDS (SDS-PAGE): le
proteine, uniformemente dotate di carica negativa (SDS), si muovono in
base alla loro massa.
Elettroforesi nativa
Le proteine vengono separate sulla base della loro carica netta e in base alle dimensioni,
La risoluzione è relativamente bassa,
Discrimina tra proteine con PM uguale ma con carica differente,
Permette la rapida purificazione e il recupero di proteine in condizioni native, Può essere usata per una colorazione catalitica,
Permette lo studio di proteine polimeriche,
Nell’elettroforesi nativa i campioni non vengono denaturati né caricati negativamente prima della corsa: la velocità di migrazione pertanto sarà il risultato della massa molecolare del campione e della sua carica intrinseca
IEF nativa della LOX-1 di soia
colorazione catalitica della LOX-1 di soia
colorazione catalitica della
Ceruloplasmina umana
SDS-PAGE
(Sodium-Dodecyl-Sulphate-Polyacrilamide-Gel-Electrophoresis)
E’ uno dei metodi più largamente usati per separare le proteine e determinare il loro peso molecolare apparente.
Abbinata al Western Blot e all’Immunocolorazione costituisce un metodo riproducibile, rapido ed efficace per l’isolamento e l’identificazione delle proteine.
SDS-PAGE
Fasi di una SDS-PAGE
1 - Montaggio dell’apparato;
2 - Preparazione del gel;
3 - Preparazione e caricamento dei campioni;
4 - Corsa elettroforetica;
5 - Colorazione;
6 - Studio dell’immagine ottenuta.
Fase 1 - Montaggio dell’apparato:
- Lastra di vetro grande;
- Lastra di vetro piccola;
- Castello;
- Pettini;
Lastre di vetro grande con
spaziatori da 0.75 , 1 e 1.5 mm Lastre di vetro piccole
A A B
C D E
Pettini da 0.75, 1 e 1.5 mm
elettrodo
Vaschetta per il tampone
Alimentatore di corrente
Anodo +
Catodo -
A B C
E
F
E
A B C
D
A B C
D E
% T Intervallo di frazionamento 5-12 20.000 – 150.000
10-15 10.000 – 80.000
≥ 15 ≤ 15.000
Porosità del gel
La porosità del gel dipende dalla concentrazione di acrilamide e metilenbisacrilamide.
Generalmente al crescere di % T la dimensione dei pori decresce perché l’acrilammide è più concentrata, mentre al disotto del 3% si perde l’effetto setacciante.
Fase 2 - Preparazione del gel:
La dimensione dei pori viene espressa dai valori di T e C.
T = concentrazione % acrilamide + poliacrilamide (w/v); C = rapporto
percentuale tra bis-acrilamide e concentrazione totale di acrilamide +
bisacrilamide. Variando T e C si possono modificare le dimensioni dei
pori del gel e la capacità di risoluzione. Più spesso la composizione del
gel viene data come rapporto in peso acril:bis-acril (29:1).
I gel di poliacrilammide vengono preparati al momento dell’uso facendo copolimerizzare acrilamide con metilen-bisacrilammide, un agente cross-lincante, in presenza di persolfato di ammonio (APS) allo 0,1-0,3% e un catalizzatore come il TEMED. Questa polimerizzazione radicalica viene fatta avvenire all’interno dello spazio compreso tra due vetri, in modo da ottenere una matrice piatta con spessore che varia da 0,75 mm a 1,5 mm.
Il TEMED, catalizza la decomposizione dello ione persolfato con formazione del radicale libero:
S
2O
8 2-+ 1e- SO
4 2+ SO
4-.
SO
4-.
rappresenta la specie efficace (R .
) nella catalisi di polimerizzazione con persolfato. Il radicale libero R .
trasferisce
l'elettrone spaiato sulla catena nascente di acrilammide che funge da
radicale libero essa stessa.
Preparazione del resolving gel e dello stacking gel
-Preparazione del resolving gel (gel di risoluzione).
La scelta della % di acrilamide è in base alle dimensioni della proteina in esame);
-Preparazione dello stacking gel (gel di
impaccamento al 4-5%)
Componenti:
Volume 20 ml
H2O 7,9
30% acrilamide 6,7
1.5 M Tris/HCl (pH 8.8) 5,0
10% SDS 0,2
10% ammonio persolfato 0,2
TEMED 0,008
Proteine
Maglie di acrilamide
Resolving gel al 10%
butanolo saturo di acqua (10:1)
Oppure semplicemente acqua
gel di separazione
Menisco di ossigeno
Componenti:
Volume 10 ml
H2O 6,8
30% acrilamide 1,7
1.0 M Tris/HCl (pH 6.8) 1,25
10% SDS 0,1
10% ammonio persolfato 0,1
TEMED 0,01
Preparazione dello Stacking al 5 %:
Dopo circa 1 h dalla deposizione del gel di separazione, si stratifica su di esso il gel di impaccamento (o stacking)
Il gel di impaccamento ha un pH di 6,8 e un rapporto di acrilam/bis-acrilam pari al 5%
Appena deposto il gel di
impaccamento. si dispone il pettine per la formazione dei pozzetti
Gel di impaccamento
separating gel stacking gel
Pettine
Fase 3 - Preparazione e caricamento dei campioni
Campione contenente l’Albumina:
Sample buffer 5x
Agitare il campione dopo preparazione Riscaldare a 95 C per 5 minuti
(Tris/HCl 0.3 M pH 6.8, 10% SDS, 0.05% Blu di Bromofenolo, 50% Glicerolo e 500 mM DTT)
Preparazione dei campioni
SDS: Denatura le proteine e conferisce la stessa densità di carica negativa
DTT: (ditiotreitolo) e b-Mercaptoetanolo: Rompe eventuali ponti disolfuro
Glicerolo: Aumenta la densità dei campioni depositandoli nel pozzetto
Blu di bromofenolo: Visualizza i campioni e va a costituire il fronte di migrazione
Bollitura: (95-100°C per 2-5 minuti): Accelera la completa
denaturazione
Dopo solidificazione dei gel, si rimuove il pettine, lasciando nello stacking la serie di pozzetti pronti per il caricamento dei campioni.
Caricamento dei campioni
A
B
Caricamento dei campioni
Inserimento dei campioni tra le due lastre di vetro mediante puntali monouso
A
B
Fase 4 - Corsa elettroforetica
- connessione all’alimentatore di corrente;
- impostazione dei valori di voltaggio o amperaggio desiderato;
- avvio della corsa;
- arresto della corsa quando si vede che il fronte e’ giunto
alla fine del gel.
Corsa elettroforetica
Stacking gel
pH 6,8
pH 8,8
Resolving gel
pH 6,8 pH 8,8
Corsa elettroforetica
Il pH del gel di caricamento è inferiore di circa 2 unità rispetto a quello del tampone di corsa.
In quest’ultimo il pH è 8,8 e la glicina (acido debole) è quindi presente per il 95%
sotto forma di ione dipolare (zwitterione CH2(NH3+)COO-) e solo per il 5% sotto forma di anione glicinato (CH2(NH2)COO-).
Quando viene applicata la corrente :
• gli ioni di glicina nel tampone di corsa si muovono allontanandosi dal catodo (elettrodo -) per cui si dirigono verso il campione e il gel di caricamento, ma con una mobilità inferiore rispetto allo ione Cl-;
• In quel punto il pH è basso (6.8) per cui gli ioni glicina perdono molta della loro carica e rallentano il loro movimento. In questo modo la glicina non potrà portare efficacemente la corrente e saranno le stesse proteine a portarla, migrando verso l’anodo.
Allo stesso tempo nel gel di caricamento e nel campione:
• gli ioni cloruro altamente mobili si muovono per allontanarsi dal catodo;
• questo crea una zona ristretta nella parte superiore del gel di caricamento in cui la conduttanza è molto bassa (cioè c’è un’alta resistenza);
• come risultato si avrà una concentrazione degli anioni proteici a ridosso degli ioni cloruro in ordine di mobilità ionica decrescente;
Cl-> proteine > glicinato;
• le proteine penetrano nel gel di corsa sotto forma di bande sottilissime al seguito dello ione cloruro. Si concentrano in un volume molto piccolo e nel gel si osserva proprio la formazione di una strato molto sottile al limite tra gel di separazione e il gel di caricamento.
Quando il fronte del colorante, blu di bromofenolo (presente nel campione) raggiunge la prossimità del fondo del gel, è il momento di interrompere la corsa.
Fase 5 - Colorazione
Blue di Coomassie Colorazione con Argento
Poiché le proteine non sono direttamente visibili, il gel deve essere processato. La procedura più comune di rivelazione è la colorazione.
In genere, dopo che le proteine sono state colorate, il gel viene
fotografato o essiccato. Le proteine colorate su gel possono essere
analizzate (PM, quantità) tramite densitometria (scanner, digital
camera, densitometro)
Procedura:
1. rimozione del gel dall’apparato di corsa e inserimento in una vaschetta pulita,
2. trattamento del gel con una soluzione di acido acetico e metanolo per fissaggio delle proteine al gel e rimozione dell’SDS,
3. immersione del gel, da 5 min a 1 h, in una soluzione colorante di Blue Coomassie e acido acetico e metanolo,
4. rimozione del colorante non legato alle proteine tramite immersione del gel Il blue Coomassie si lega alle proteine con forze di Van der Waals e legami ionici tra i gruppi sulfonici del colorante e i gruppi amminici delle proteine
Colorante-SO3-+NH3-L-COOH (proteine basiche)
Blue di Coomassie
Blue di Coomassie
Albumina di siero bovino. SDS-PAGE
SOLUZIONI DA PREPARARE:
•FIXING SOLUTION: 40% etanolo; 10% acido acetico.
•WASHING SOLUTION I: 30% etanolo.
•WASHING SOLUTION II: 20% etanolo.
•SENSITIZER SOLUTION: 0,02% Na
2S
2O
3 (tiosolfato di sodio)•SILVER STAIN: 0,2% AgNO
3-fotosensibile- (Aggiungere 0,02%
di Formaldeide prima dell’uso).
•SOLUZIONE DI SVILUPPO: 3% Na
2S
2O
3(Aggiungere 0,05%
di Formaldeide prima dell’uso).
•BLOCKING SOLUTION: 0,5% Glicina
Colorazione con l’argento
METODICA:
Incubare il gel nella Fixing solution per almeno 3h Lavare per 20 minuti nella Washing Solution I
Lavare per 20 minuti nella Washing Solution II Lavare per 20 minuti in H2O bd
Incubare il gel nella Sensitizer solution Lavare per 20 secondi in H2O bd (x3) Colorare per 20 minuti con il Silver Stain Lavare per 20 secondi in H2O bd (x3)
Incubare per 3-5 minuti nella soluzione di Sviluppo Lavare per 20 secondi con H2O bd
Incubare per 5 minuti nella Blocking Solution Lavare per 10 minuti in H O bd (x3)
Colorazione con l’argento
Il gel di poliacrilamide ha una capacità limitata e sovraccaricarlo con le proteine può dare risultati di precipitazioni ed aggregazione, produzione di striature e macchie. I risultati migliori si ottengono caricando, per ogni pozzetto, 20 ml di proteina denaturata concentrata 0,5 mg/ml (10 mg per pozzetto).
Problemi di caricamento del gel
troppo
poco giusto
Una volta “colorati” i gel devono essere essiccati per una buona e lunga conservazione
Essiccamento del gel
La massa molecolare relativa (Mr) di una proteina può essere determinata confrontando la sua mobilità con quella di una serie di proteine “standard”, delle quali si conosce la massa molecolare relativa, separate sullo stesso gel.
E’ da tenere presente che tramite questa metodica si determina il peso molecolare apparente di una proteina, in quanto alcune proteine, per loro natura (composizione aminoacidica, modificazioni, ecc.) migrano in modo anomalo, non rispecchiando il loro effettivo peso molecolare.
Fase 6 - Studio dell’immagine ottenuta
In commercio sono disponibili diversi standard proteici che coprono un'ampia gamma di pesi molecolari (PM) diversi.
Ve ne sono per tutte le applicazioni:
- per determinare con la massima approssimazione il peso molecolare,
- per verificare l'efficienza di trasferimento su membrana.
I marker possono essere non colorati oppure pre-colorati
I primi permettono una determinazione più accurata del PM, mentre i secondi sono più adatti per la conferma dell'andamento dell'elettroforesi e del trasferimento su membrana.
La maggior parte dei marker pre-colorati in commercio produce 6-12 bande che possono essere tutte dello stesso colore oppure di colori diversi. L’uso di colori differenti facilita l'identificazione del PM di
Standard proteici:
Standard (low range) MM
A- Fosforilasi B 97.400
B- BSA 66.200
C- Ovalbumina 45.000
D- Anidrasi carbonica 31.000
E- Inibitore della tripsina 21.500
F- Lisozima 14.400
1, 2, 3, 4, 5, 6 = campioni di albumina
A B C D
E F
1 2 3 4 5 6
6 - Studio dell’immagine ottenuta
Determinazione della massa molecolare di catene polipeptidiche
Mobilità relativa di ciascuna proteina
Standard in nero, campione in blu
4 4,2 4,4 4,6 4,8 5
0 1 2 3 4 5
y = 5,0635 - 0,19269x R= 0,99031
Log PM
Mobiltà relativa
Standard Campione
Log PM
Mobilità relativa
Standard e Campione
Dopo la colorazione, si misura la distanza di migrazione di ciascuna proteina dalla sommità del gel risoluzione fino alla distanza di migrazione del colorante (fronte della corsa)
distanza di migrazione del colorante
Fronte della corsa distanza di migrazione
Standard a PM noto Campioni
distanza di migrazione del campione
la distanza di migrazione del colorante è 5,8
Dopo la colorazione, si misura la distanza di migrazione di ciascuna proteina dalla sommità del gel risoluzione fino alla distanza di migrazione del colorante
Rf = distanza di migrazione della proteina distanza di migrazione del colorante
Mobilità Relativa 1,4
1,9 2,5 3,5 4,4 5,3 PM
Fosforilasi B 94700
BSA 66200
Ovalbumina 45000
Anidrasi carbonica 31000 Inibitore della Tripsina 21500
lisozima 14400
Log10
4,976349979 4,820857989 4,653212514 4,491361694 4,33243846 4,158362492
y = -0,2016x + 5,2104 R² = 0,9877
4 4,2 4,4 4,6 4,8 5 5,2
0 1 2 3 4 5 6
log10PM
Principali impieghi di una SDS-PAGE
Controllo di omogeneità (purificazione di una proteina)
Caratterizzazione (determinazione del peso molecolare)
Proteomica (analisi dell’insieme di proteine di una cellula)
Analisi con anticorpi (Western Blotting)
ELETTROFORESI BIDIMENSIONALE:
è la combinazione di IEF e SDS-PAGE
Le fasi dell’elettroforesi bidimensionale Le fasi dell’elettroforesi bidimensionale
Prima dimensione: IEF Equilibratura della Strip
Seconda dimensione: SDS-PAGE
Colorazione e studio dell’immagine
●
●●
●
●
●● ●
Prima dimensione Isoelettofocalizzazione
(IEF)
ISOELETTROFOCALIZZAZIONE
pI: pH al quale la carica netta della proteina = 0
Se sottoposta all’azione di un campo elettrico non si muove
2
+
1
-
+ -
Una proteina dispersa in un gradiente di pH, si troverà ad avere carica netta positiva, negativa oppure nulla. Sottoposta all’azione di un campo elettrico opportunamente orientato essa si muoverà, a seconda della carica che ha verso l’elettrodo di segno opposto, fino a raggiungere il pH pari al suo pI. In questo punto essa assume carica netta nulla e non è più sottoposta all’azione del campo elettrico.
Più distante una proteina si trova dal suo pI maggiore sarà la sua carica e dunque anche la sua mobilità elettroforetica, mano a mano che essa si avvicina al pH pari al suo pI, la sua carica netta diminuisce e di
+
pH3 pH10
pH=7.4 pI=7.4
+ 0
0
pH=8.4 pI=8.4
0
-
0
- +
ddp
Gradienti di pH
anfoliti o sostanze anfiprotiche
Immobilizzati
Questi derivati dell’acrilammide sono noti come Immobilines. I gruppi R possono essere gruppi carbossilici o amminici (pKa da 0.8 a 4.6/ pKa da 6.2 a 12).
Ciascuna molecola ha un suo pI, se sottoposte all’azione di un campo elettrico migrano a seconda della propria carica netta. [soluzione acida all’anodo (+) e basica al catodo (-)] Hanno la caratteristica di avere un’alta capacita tamponante al loro pI.
SVANTAGGI: Il gradiente non è stabile nel tempo (spostamento) e la forma del gradiente è influenzabile dalle molecole che vengono analizzate.
+ Soluzione acida
-
Native IEF
X 1 gel (volume 12.07 ml) 7 ml di H
2O
2 ml di acrilamide al 30%
2.4 ml di glicerolo al 50%
0.6 ml di anfoliti
50 ml di ammonio persolfato al 10 % 20 ml di TEMED
Tempo di solidificazione: 1 h circa
Protocollo per la preparazione del gel
Colorazione
Coomassie Brillant Blue R-250 Nitrato di Argento
Prima della colorazione è necessario lavare il gel con una soluzione di TCA al 10% per precipitare le proteine e lavare via gli anfoliti
Vantaggi dei gradienti di pH immobilizzato
● possibilità di reperire in commercio gel preformati, minimizza variazioni dovute alla preparazione dei gel;
● I gradienti di pH sono stabili nel tempo e non subiscono alterazioni dovute alla presenza del campione stesso.
● I gradienti sono praticamente continui e possono essere costruiti secondo diverse esigenze: lineari/non lineari; ampi (ad esempio pH 3-10)/molto ristretti (anche pH 4-5)
Questi gel vengono solitamente venduti deidratati, e possono essere conservati a -20 °C per periodi molto lunghi (anche 1 anno).
Immobilized pH Gradient strip (IPG strip)
Gradienti di pH immobilizzati: reidratazione
I gel recanti i gradienti di pH immobilizzati sono di solito deidratati e devono essere reidratati in opportune condizioni:
Il metodo più comunemente usato prevede che i gel vengano messi a contatto con un volume (a seconda delle loro dimensioni) di una soluzione di reidratazione, cosi composta:
8 M Urea, 4-0,5 % CHAPS, 0,2 % DTT (o altri agenti riducenti), 0,5% (fino a 2% nel caso di strip da 24 cm) IPG buffer, 10% glicerolo.
Fenomeno dell’ elettroendoosmosi: Nel caso ci siano cariche fisse sulla matrice che forma il gel, in particolare cariche negative (-), queste non possono migrare in un campo elettrico ma hanno solitamente dei contro ioni (possono essere dei cationi con la loro sfera d’idratazione o stessi H3O+) che migrano verso il catodo creando un vero e proprio flusso di acqua. (fenomeno che porta a dei problemi notevoli utilizzando gradienti di pH non immobilizzati, distorsione/spostamento del gradiente di pH). Il glicerolo aumenta la densità del mezzo e diminuisce/minimizza questo effetto.
+
anodo
catodo
-
- - - - - - - - - - - - - - - + + + + + + + + + + + + + + +
flusso di acqua
Rehydration loading
Il campione si trova in buffer e viene diluito in rehydration buffer (calcolo di mg da utilizzare nella IEF, tutti i campioni devono essere normalizzati:
stessa quantità di campione e stesse proporzione buffer/rehydration buffer nel caso questi due fossero diversi). Il campione così preparato viene lasciato 1h ad equilibrare. Il campione viene applicato nello strip holder (contenitore delle stesse dimensioni della strip serve a minimizzare volumi). Il gel viene applicato in giù in modo che si stabilisca un contatto con gli elettrodi. Il gel viene lasciato in queste condizioni per 12 h con applicata una ddp di 50 V. Dal momento che il gel era secco, esso si rigonfia alle sue dimensioni originarie e nello stesso tempo le proteine, presenti in soluzione, vengono “aspirate” assieme al liquido. Il voltaggio favorisce l’entrata delle proteine ed il gel ha delle maglie (C e T) tali da consentire una loro agevole entrata. Il gel viene coperto con un apposito olio (cover fluid) per fare in modo che durante la corsa il campione non evapori
Focalizzazione
Il voltaggio può essere aumentato sia in modo lineare (ramping) che in modo brusco (step and hold). Importante è impostare un amperaggio massimo per ciascuna strip (50 mA , importante impostare il n° di strip che vengono corse in parallelo poiché la corrente massima sarà diversa: 1 strip 50 mA max per 2 strip 100 mA max).
Termine focalizzazione:
a) Strip possono essere lavate in acqua, scolate su un pezzo di carta e messe a congelare (-80 °C) in un contenitore dove vengono fatte appoggiare sul loro supporto di plastica - IMPORTANTE PER NON ROVINARE IL GEL.
Incrementi voltaggi per isoelettrofocalizzazione
Dopo Isoelettrofocalizzazione
pH 4 pH 7
Standard a diversi valori di pH
Std
IEF su gel
pI 8,8 7,5 7,0 6,0 5,0 PM
97,400 66,200 45,000 31,000 21,500 14,400
LOX-1 soia PM ~ 94,000
SDS-PAGE IEF su gel
Campione: LOX-1 di soia purificata
HPCE: isoelettrofocusing
Elettroferogramma delle frazioni proteiche purificate dalla soia
0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
10 15 20 25 30 35 40
Taratura standard pI
y = 1,149 - 0,01674x R= 0,99798
log pI
Tempo di migrazione (min)
pI fraz
6,10 F1
5,91 5,05
6,81 G1
5,93 6,76 6,24
7,08 G2
6,35
6,38 G3
5,42
6,29 G4
6,17 6,15
6,24 G5
5,46
Seconda dimensione: SDS-PAGE
Equilibratura delle IPG strip
-10 minuti nel SDS-PAGE Equilibration Buffer I (6 M Urea, 0.735 M Tris/HCl pH 8.8, 2% SDS, 20 % Glicerolo, 2% DTT);
-10 minuti nel SDS-PAGE Equilibration Buffer II (6 M Urea, 0.735
M, Tris/HCl pH 8.8, 2% SDS, 20 % Glicerolo, 2,5 %
iodoacetamide
-Aggiunta di gel di agarosio sopra il gel di risoluzione;
- Inserimento delle IPG strip.
Gel di agarosio: 0.5% low melting point agarose in 1x Tris/glycine/SDS
and 0.003% bromophenol blue
Colorazione
Coomassie Brillant Blue R-250
Nitrato di Argento
pH 4 pI pH 8,5
pI MM
1- Conalbumina di uovo di gallina 6.0-6.3-6-6 76.000
2- BSA 5.5 66.200
3- Actina di muscolo di bovino 5.1 43.000 4- GAPDH di muscolo di coniglio 8.3 36.000 5- Anidrasi carbonica di bovino 6.0 31.000 6- Inibitore della tripsina di soia 4.5 21.500
1
4
5
7 6
Schema completo di una 2D-PAGE
SDS-PAGE dell’omogenato di soia varietà Dolores
SDS-PAGE dell’omogenato di soia varietà Dolores
PM 97,400 66,200 45,000
31,000
21,500
14,400
97 66 45
31
25
14
+ pI 3 4 5 6 7 pI - PM kDa
omogenato di soia varietà Dolores caricato nella strip pI 4-7
pH
Esempio pratico di una 2D-PAGE
IEF
Studio della LOX-2 in Arabidopsis thaliana,
nome comune: Arabetta comune
Per ricercare la sequenza, peso molecolare, pI delle proteine nei database di sequenza primaria SWISS PROT (SP) o Tr EMBL nel server ExPASy Proteomics Server: www.expasy.org
Volete identificare una particolare proteina nel vostro gel 2D. Si ritaglia lo spot di interesse dal gel, e si sottopone ad analisi degli
amminoacidi e a
sequenziamento dell’N-
•SPOT 2D-001JZ9:
pI=5.08;
Mw=98398
MAPPING (identification):
MASS SPECTROMETRY .
LOX-2
Experimental design for protein identification analyses using MALDI-TOF-MS (mass spectrometry). Protein spots with expression profiles were excised from reference (pooled) gels from pH ranges 3 to 10 and 4 to 7. Each spot was trypsin digested, and peptides were analyses using MALDI-TOF-MS. Resultant spectra were searched against the NCBI
● Grande capacità di separazione e risoluzione di miscele proteiche (2.000–3.000 proteine)
● Riproducibilità e affidabilità dei risultati
● Possibilità di confronto dei dati tra laboratori differenti
● Capacità di rilevazione di modificazioni post-traduzionali delle proteine:
Fosforilazione Glicosilazione Tagli proteolitici
● Possibilità costruire e/o usufruire di mappe di riferimento disponibili in rete
