CAPITOLO 4 – RISULTATI
4.1 DISEGNO SPERIMENTALE
Al fine di costruire un clone molecolare replicazione-competente dell’isolato M2 di FIV, è stata disegnata e seguita la seguente strategia: il DNA provirale è stato estratto da tessuti prelevati da un gatto infettato da FIV M2; dopodiché, sono stati disegnati opportuni primer con i quali ottenere cinque frammenti parzialmente sovrapposti dell’intero genoma provirale. Ogni frammento è stato poi amplificato, subclonato nel vettore pCRII-TOPO e sequenziato; mediante appropriati enzimi di restrizione, i frammenti sono stati recuperati e ligati nel plasmide pUC19 con lo scopo di ricostruire il genoma di FIV M2. E’ stata quindi testata la capacità replicativa dei cloni prodotti contenenti il DNA provirale ricostituito mediante trasfezione di CrFK ed infezione di MBM con il surnatante delle cellule trasfettate.
4.2 ANALISI QUANTITATIVA DEL CARICO PROVIRALE
4.2.1 Estrazione del DNA
Il DNA genomico è stato estratto da cellule della milza, midollo osseo, timo, linfonodo sottomascellare e linfonodo mesenterico prelevate da un animale deceduto per complicazioni insorte in seguito ad infezione cronica da FIV M2 ed infettato da oltre 10anni.
Da sottolineare che questi tessuti sono stati scelti in considerazione del maggior tropismo del virus verso i compartimenti linfoidi.
L’integrità e la quantità esatta del DNA estratto sono state valutate, rispettivamente, mediante analisi elettroforetica su gel di agarosio all’1% e lettura spettrofotometrica.
Per tutti i campioni è stato possibile escludere la presenza di “smear” di degradazione; quantità di DNA genomico relativamente basse sono state estratte dai campioni linfociti della milza e linfonodo mesenterico (dati non presentati).
4.2.2 Valutazione dell’amplificabilità e della positività per FIV M2 dei DNA estratti
L’amplificabilità del DNA estratto è stata saggiata mediante amplificazione del gene cellulare felino α-TNF (407 bp); come indicato in fig. 4.1, il DNA dei campioni milza e linfonodo sottomascellare è risultato essere non amplificabile.
Dopodiché, al fine di valutare la positività per FIV dei campioni risultati competenti per l’amplificazione, questi sono stati sottoposti ad una reazione di nested-PCR con primer specifici per il gene virale gag codificante per la proteina p25 (346 bp); tutti i campioni sono risultati essere positivi per FIV M2 (Fig. 4.1).
4.2.3 Valutazione del carico provirale
Successivamente, nei campioni positivi per FIV è stato stimato, mediante tecnica TaqMan-PCR, il carico provirale, espresso come numero
di copie di DNA virale per µg di DNA genomico (Tab. 4.1); questo è risultato essere basso in tutti i tessuti di partenza e soprattutto, come atteso, nel timo a causa dell’età adulta dell’animale.
Tuttavia, quantità di DNA provirale idonee per il clonaggio di FIV M2 sono risultate presenti nei campioni midollo osseo, linfonodo mesenterico e linfociti della milza.
4.3 AMPLIFICAZIONE DEL GENOMA PROVIRALE DI FIV M2
Con lo scopo di amplificare l’intero genoma di FIV M2, lungo più di 9 Kb, sono stati disegnati opportuni primer con i quali ottenere cinque frammenti parzialmente sovrapposti dell’intero DNA provirale: LTR5’, gag-pol, pol-env, env e LTR3’ (Fig. 3.1); in particolare, i primer sono stati dedotti dalla sequenza nucleotidica di FIV TM2, ceppo prototipo di sottotipo B di cui si conosce la sequenza dell’intero genoma, e, successivamente, controllati con il programma OLIGO (versione 5.0) per la formazione di dimeri, eterodimeri e harpin intra- ed inter-primer.
4.3.1 Amplificazione dei frammenti gag-pol, pol-env ed env
L’amplificazione dei frammenti gag-pol, pol-env ed env è risultata essere nel complesso piuttosto complicata sia per il basso numero di copie di DNA provirale presenti nei vari campioni di partenza sia per la notevole lunghezza dei frammenti sottoposti ad amplificazione. Poiché le reazioni di PCR in singolo step non sono state sufficienti per amplificare il DNA provirale, per aumentare l’efficienza e la sensibilità della reazione di amplificazione, è stata effettuata una nested-PCR. Inoltre, per la messa a
punto del saggio sono state eseguite, per ciascun frammento, diverse reazioni di amplificazione al fine di ottimizzare i vari parametri di PCR (quantità di templato, temperature di annealing, ecc).
I primer e i profili di amplificazione utilizzati nei due stadi della nested-PCR dei frammenti gag-pol, pol-env ed env sono indicati in tab. 3.3 e 3.4. Con lo scopo di ridurre l’inserimento di mutazioni durante le reazioni di PCR, tutti i saggi sono stati allestiti con la DNA polimerasi proof reading PfuUltra (Stratagene) e tutti i frammenti sono stati amplificati un minimo di due volte in reazioni separate; la loro attendibilità è stata poi testata come descritto nei prossimi paragrafi.
Nonostante varie prove, l’amplificazione dei frammenti gag-pol ed env è risultata essere poco efficiente sia in termini di quantità di amplificato sia perché non è stato possibile ottenere il prodotto da tutti i campioni di partenza.
In particolare, come mostrato in fig. 4.2, il frammento gag-pol (3171 bp) è stato amplificato solo dai tessuti midollo osseo e linfonodo mesenterico mentre l’amplificazione di env è stata ottenuta soltanto dai campioni linfociti della milza e midollo osseo; in quest’ultimo caso, oltre alla banda di interesse di 2645 bp, è stata ottenuta anche una banda aspecifica di 800 bp in tutte le reazioni effettuate (Fig. 4.3).
Al contrario, il frammento pol-env (2576 bp) è stato amplificato in quantità piuttosto soddisfacenti da tutti i campioni (Fig. 4.2).
4.3.2 Amplificazione delle LTR
Date le difficoltà incontrate per amplificare i frammenti gag-pol, pol-env ed env dai tessuti linfonodo mesenterico, midollo osseo e linfociti della
milza a causa prevalentemente dei bassi numeri di copie di DNA provirale in essi presenti, per l’amplificazione delle LTR, oltre ai campioni sopra detti, sono state utilizzate anche cellule MBM infettate con l’isolato M2 di FIV. Come atteso, il carico provirale valutato, mediante tecnica TaqMan-PCR, sul DNA estratto da tali cellule è risultato essere decisamente maggiore rispetto a quello stimato nei campioni autoptici utilizzati (dati non mostrati).
Le due LTR sono state inizialmente amplificate mediante Vectorette-PCR; tuttavia con tale metodica è stato ottenuto soltanto un elevato numero di aspecifici dai quali non è stato possibile distinguere i frammenti contenenti le LTR (Fig. 4.4).
E’ stato quindi effettuato mediante il programma CLUSTAL X (versione 1.8) un allineamento di tutte le sequenze nucleotidiche LTR di ceppi FIV di sottotipo A, B e C disponibili in banca dati. Come indicato in fig. 4.5, LTR di ceppi FIV appartenenti a sottotipi diversi non mostrano differenze significative nella sequenza nucleotidica, mentre nell’ambito di uno stesso sottotipo le LTR sono altamente conservate. Sulla base di queste osservazioni i primer necessari per l’amplificazione delle due LTR sono stati dedotti dalla sequenza nucleotidica dell’isolato TM2.
In conclusione, come i frammenti gag-pol, pol-env ed env, anche le LTR sono state amplificate mediante nested-PCR un minimo di due volte in reazioni separate.
I primer e i profili di amplificazione usati nei due stadi della nested-PCR delle due LTR sono indicati in tab. 3.6 e 3.7. La LTR5’ è stata amplificata solo dalle cellule MBM mentre l’amplificato LTR3’ è stato ottenuto soltanto dai campioni linfociti della milza e cellule MBM (Fig. 4.6).
4.3.3 Digestione enzimatica degli amplificati LTR, gag-pol, pol-env ed env
Al fine di verificare, prima del clonaggio, che gli amplificati ottenuti fossero realmente il ceppo FIV M2 e non altri ceppi FIV quali Petaluma (ceppo prototipo di sottotipo A ampiamente utilizzato nel laboratorio da cui potrebbe derivare una contaminazione) o frammenti di genoma cellulare, è stata effettuata una digestione degli amplificati con specifici enzimi; questi sono stati scelti in riferimento alle mappe di restrizione degli isolati TM2 e Petaluma in modo da ottenere due distinti pattern di restrizione (Tab. 3.8).
4.3.3.1 Digestione enzimatica dei frammenti gag-pol, pol-env ed env
L’amplificato gag-pol (3171 bp), ottenuto dai campioni linfonodo mesenterico e midollo osseo, è stato digerito con l’enzima PacI o, in alternativa, con NheI (Fig. 4.7). Entrambi gli enzimi tagliano sul frammento gag-pol di Petaluma (ma non sul TM2) in un unico sito: PacI in 3545 bp e NheI in 3133 bp; quindi dalla digestione si generano in entrambi i casi due frammenti: 2461 bp e 710 bp (PacI) o 2049 bp e 1122 bp (NheI). Come atteso, gli amplificati gag-pol ottenuti dai campioni sopra detti sono risultati essere l’isolato M2 di FIV; in fig. 4.7 viene riportata solo la digestione del frammento gag-pol amplificato dal midollo osseo ma identici risultati sono stati evidenziati per l’amplificato gag-pol ottenuto dal linfonodo mesenterico.
Per verificare l’attendibilità degli amplificati pol-env, questi sono stati digeriti con l’enzima PstI il quale possiede 3 siti di taglio sul TM2 (4071 bp, 4692 bp e 6263 bp) e nessun sito su Petaluma (Fig. 4.8); dalla digestione
di pol-env/TM2 si generano quindi 4 frammenti (80 bp, 621 bp, 1571 bp e 304 bp) mentre un non digerito di 2571 bp è atteso dalla digestione di pol-env/Petaluma. Degno di nota che dalla digestione dei frammenti pol-env amplificati dai campioni midollo osseo, linfociti della milza e linfonodo mesenterico, sono stati ottenuti 3 frammenti (80 bp, 621 bp e 1875 bp) e non i 4 attesi.
Tuttavia, questo pattern di restrizione è spiegato con l’assenza del sito di taglio in 6263; infatti, TM2 e M2 sono isolati diversi di sottotipo B e quindi possono presentare piccole differenze nella sequenza nucleotidica del genoma. Sulla base di tale ipotesi, poi confermata mediante sequenziamento, è stato concluso che tutti gli amplificati pol-env ottenuti sono parte del ceppo FIV di interesse.
Successivamente, gli amplificati env ottenuti dai linfociti della milza e dal midollo osseo sono stati digeriti con l’enzima AclI il quale taglia sul TM2 (ma non su Petaluma) in un unico sito (7542 bp) generando due frammenti di 1345 bp e 1300 bp. Come è possibile osservare in figura 4.9, tutti gli amplificati env sono risultati essere il ceppo M2.
4.3.3.2 Digestione enzimatica delle LTR
Infine, anche gli amplificati LTR5’ e LTR3’ sono stati sottoposti a digestione enzimatica, rispettivamente, con StuI e TaqII i quali possiedono un solo sito di taglio sul TM2 ma non su Petaluma.
Come indicato in fig. 4.10 anche gli amplificati LTR sono risultati essere del ceppo FIV di interesse.
4.4 DETERMINAZIONE DELLA SEQUENZA DEGLI AMPLIFICATI GAG-POL, POL-ENV, ENV E LTR
Come già detto, per valutare il possibile inserimento di mutazioni durante il processo di PCR, i frammenti gag-pol, pol-env, env e LTR sono stati amplificati un minimo di due volte in reazioni separate; dopodiché, tutti gli amplificati ottenuti sono stati interamente sequenziati con specifici primer dedotti dalla sequenza nucleotidica del ceppo TM2 e controllati poi per formazione di dimeri e hairpin (Tab.3.9 e 3.10).
Mediante programma CLUSTAL X (versione 1.8) le relative sequenze nucleotidiche sono state allineate e comparate; nell’esempio di fig. 4.11 è riportato l’allineamento delle sequenze degli amplificati env ottenuti dai linfociti della milza.
Dopo aver analizzato con attenzione tutte le sequenze effettuate, è stato possibile escludere l’inserimento di mutazioni e quindi confermare l’attendibilità degli amplificati gag-pol, pol-env, env e LTR ottenuti.
Inoltre, per verificare che i prodotti di PCR fossero realmente il ceppo M2 di FIV (ovvero per confermare i risultati ottenuti mediante digestione enzimatica), le sequenze nucleotidiche degli amplificati gag-pol, pol-env, env e LTR sono state allineate con i relativi frammenti degli isolati Petaluma e TM2 di FIV.
Negli esempi di fig. 4.12 e 4.13 sono riportati gli allineamenti delle sequenze dei frammenti gag-pol e pol-env, di Petaluma, TM2 e M2.
Poiché le sequenze nucleotidiche degli amplificati sono del tutto simili all’isolato TM2 mentre mostrano differenze significative quando confrontate con il ceppo Petaluma, è stato possibile concludere che gli
amplificati ottenuti sono realmente il ceppo M2 come dimostrato in precedenza mediante digestione enzimatica.
4.5 SUBCLONAGGIO DEGLI AMPLIFICATI GAG-POL, POL-ENV, ENV E LTR NEL VETTORE pCRII-TOPO
Una volta verificata l’attendibilità di tutti gli amplificati ottenuti, questi sono stati clonati nel vettore pCRII-TOPO sfruttando l’appaiamento T-A alle estremità di vettore e amplificato (Fig. 3.2).
Tutte le reazioni di clonaggio sono risultate essere poco efficienti a causa della notevole lunghezza degli inserti; in particolare, il clonaggio di env è risultato essere il più complicato poiché la banda aspecifica (presente nella miscela di reazione), essendo molto più corta (800 bp) del frammento di interesse (2645 bp), è stata clonata con maggiore facilità. A causa di questi inconvenienti, è stato necessario analizzare un elevato numero di colonie al fine di trovare cloni contenenti l’inserto; lo screening è stato effettuato mediante PCR come descritto in § 3.4.1 (dati non mostrati).
Tutti i plasmidi, estratti dalle colonie risultate buone tramite amplificazione, sono stati poi accuratamente controllati mediante digestione con l’enzima EcoRI che taglia sul pCRII-TOPO ai due lati dell’inserto (dati non mostrati).
In conclusione, per il frammento gag-pol è stato ottenuto un solo clone sia dal linfonodo mesenterico che dal midollo osseo; per il frammento pol-env sono stati invece trovati 3 cloni dai linfociti della milza, 4 dal linfonodo mesenterico ed un solo clone dal midollo osseo. Per env sono risultati
essere buoni 4 cloni dai linfociti della milza mentre nessun clone è stato ottenuto dal midollo osseo.
Infine, 2 cloni sono stati ottenuti dalle cellule MBM per la LTR5’ mentre per la LTR3’ sono stati trovati 7 cloni dalle MBM e nessun clone dai linfociti della milza (Tab. 4.2).
4.6 RICOSTITUZIONE DELL’INTERO GENOMA DI FIV M2 NEL VETTORE pUC19
4.6.1 Sequenziamento dei cloni contenenti i frammenti gag-pol, pol-env, env e LTR e costruzione delle mappe di restrizione
A questo punto, tutti i cloni ottenuti contenenti i frammenti gag-pol, pol-env, env e LTR (Tab. 4.2), sono stati interamente sequenziati come descritto in precedenza (§ 3.3.5); dopodichè, mediante programma CLUSTAL X (versione 1.8) le relative sequenze nucleotidiche sono state allineate. Negli esempi di fig. 4.14 e 4.15 sono riportati gli allineamenti delle sequenze di tutti i cloni contenenti i frammenti pol-env ed env.
Successivamente, mediante programma BIOEDIT (versione 7.0.4.1) dalle sequenze nucleotidiche dei frammenti gag-pol, pol-env ed env sono state ricavate le relative sequenze aminoacidiche al fine di individuare ulteriori codoni di stop oltre a quelli normalmente presenti nella sequenza. Negli esempi di fig. 4.16 e 4.17 sono riportati gli allineamenti delle sequenze aminoacidiche di tutti i cloni contenenti i frammenti pol-env ed env. Tutti i cloni sono risultati possedere solo i codoni di stop attesi sulla base della organizzazione genomica di FIV.
Le sequenze nucleotidiche, così come quelle aminoacidiche, appartenenti ad uno stesso frammento sono risultate essere pressocchè identiche anche se provenienti da diversi tessuti. Questo aspetto ha indubbiamente facilitato il nostro lavoro in quanto non è stato possibile amplificare i frammenti comprendenti l’intero genoma da uno stesso tessuto. L’identità di sequenza ci ha permesso quindi di clonare frammenti da tessuti diversi e di ricostruire un genoma provirale rappresentativo, in linea di massima, del ceppo circolante.
Dopodichè, mediante programma BIOEDIT (versione 7.0.4.1), dalle sequenze nucleotidiche dei frammenti gag-pol, pol-env ed env e LTR sono state ricavate le mappe di restrizione; in riferimento a queste sono stati scelti gli appropriati enzimi per il recupero e la ligazione dei vari frammenti (Fig. 3.3, Tab. 3.11).
Da sottolineare che è stato possibile individuare enzimi con siti di taglio unici sui singoli frammenti (in particolare sulle regioni di sovrapposizione) ma non sempre sull’intero genoma di M2 e questo ha condizionato l’ordine con il quale i singoli frammenti sono stati poi ligati.
Poiché gli enzimi utilizzati per la rimozione e ligazione dei frammenti non devono tagliare sul vettore scelto per la ricostruzione dell’intero DNA provirale, dopo un’attenta analisi delle mappe di vari plasmidi, è stato selezionato il vettore pUC19.
4.6.2 Ligazione dei frammenti nel vettore pUC19
Anche in questo caso tutte le ligazioni sono risultate essere poco efficienti a causa prevalentemente della notevole lunghezza degli inserti ed è stato quindi necessario analizzare mediante PCR un elevato numero di colonie al fine di trovare cloni contenenti il frammento di interesse. Tutti i
plasmidi estratti dalle colonie risultate positive per amplificazione sono stati opportunatamente controllati mediante sequenziamento (§ 3.3.5).
4.6.2.1 Clonaggio di env nel vettore pUC19
Env è stato il primo frammento ad essere recuperato dal pCRII-TOPO e clonato nel pUC19 mediante gli enzimi SacI e XbaI (Fig. 4.18).
Poichè le sequenze nucleotidiche e aminoacidiche dei 4 cloni pCRII-TOPO/env sono risultate essere del tutto simili, per recuperare env, è stato scelto in modo del tutto casuale, il clone 8 (Tab. 4.2).
Dalla digestione di pCRII-TOPO/env (clone 8) e pUC19 con gli enzimi sopra detti sono stati generati, rispettivamente, un inserto di 2740 bp ed un vettore linearizzato di 2645 bp (Fig. 4.18).
Lo screening delle colonie è stato effettuato mediante PCR con primer M13 S e AS presenti sul pUC19 ai due lati dell’inserto che amplificano un frammento di 2808 bp (dati non presentati).
Da questa ligazione sono stati ottenuti soltanto due cloni buoni, denominati pUC19/env (Tab. 4.3).
L’enzima XbaI, che taglia sul polylinker del pCRII-TOPO ad una estremità dell’inserto, è stato specificatamente scelto per inserire nel pUC19 nuovi siti di restrizione, quali NsiI e XhoI, che sono risultati essere utili per il clonaggio dei rimanenti frammenti (Fig. 4.18).
4.6.2.2 Clonaggio della LTR3’ nel vettore pUC19/env
La tappa successiva nella ricostruzione del genoma di M2 è stato il clonaggio della LTR3’ nel pUC19/env (Fig. 4.19).
Come per env, le sequenze nucleotidiche dei 7 cloni pCRII-TOPO/LTR3’ sono risultate essere pressocchè identiche e quindi, per la rimozione della LTR3’, è stato scelto casualmente il clone 1 (Tab. 4.2).
Dalla digestione di pCRII-TOPO/LTR3’ (clone 1) e pUC19/env (clone 27) mediante gli enzimi PflMI e SacI sono stati ottenuti, rispettivamente, un frammento di 1111 bp e la linearizzazione del vettore mediante distacco di una banda di 482 bp.
Le colonie sono state analizzate mediante PCR con primer ENV I S e LTR3 AS (Tab. 3.6) che amplificano un frammento di 1770 bp (dati non mostrati).
La reazione di clonaggio è risultata essere piuttosto efficiente in quanto sono stati ottenuti 10 cloni indicati come pUC19/env + LTR3’ (Tab. 4.3).
4.6.2.3 Clonaggio del frammento pol-env nel vettore pUC19/env+LTR3’
Una volta ottenuto il pUC19 contenente env ligato alla LTR3’, in esso è stato clonato il frammento pol-env utilizzando gli enzimi BglII e XhoI il cui sito di taglio è stato, come già detto, opportunatamente inserito sul pUC19 (§ 4.6.2.1).
Poichè le sequenze aminoacidiche pol-env ottenute dai campioni midollo osseo e linfociti della milza sono risultate essere più simili tra loro rispetto a quelle ottenute dal linfonodo mesenterico, per recuperare il frammento pol-env è stato scelto il pCRII-TOPO/pol-env, midollo osseo, clone 21 (Tab. 4.2).
Dalla digestione del pCRII-TOPO/pol-env con gli enzimi sopra detti sono stati generati un frammento di interesse di 2493 bp ed una banda di 949 bp, mentre il pUC19/env+LTR3’ (clone 11) digerito con gli stessi enzimi è stato linearizzato staccando un frammento di 287 bp (Fig. 4.20).
Lo screening delle colonie è stato effettuato mediante PCR con primer ORFA-FI S e fPol-ORFA II AS (Tab. 3.3 e 3.10) che danno origine ad un frammento di 721 bp (dati non mostrati).
Da questa ligazione sono stati ottenuti solo 2 cloni denominati pUC19/pol-env+env+LTR3’ (Tab.4.3).
4.6.2.4 Clonaggio della LTR5’ nel vettore pUC19/pol-env+env+LTR3’
A questo punto, nel pUC19/pol-env+env+LTR3’ così ottenuto è stata inserita la LTR5’ (Fig. 4.21).
Per recuperare questo frammento, tra i due cloni pCRII-TOPO/LTR5’ ottenuti dalle MBM è stato scelto, per le stesse ragioni esposte per env e la LTR3’, il clone 18 (Tab. 4.2); questo è stato digerito con l’enzima NsiI il quale taglia sul plasmide ai due lati dell’inserto generando un frammento di 2068 bp; successivamente, il pUC19/pol-env+env+LTR3’ (clone 28) è stato linearizzato mediante digestione con lo stesso enzima il cui sito di taglio è stato specificatamente inserito nel pUC19 come descritto in § 4.6.2.1.
In questo caso la reazione di clonaggio è risultata essere piuttosto complicata a causa sia del doppio orientamento con il quale l’inserto poteva ligarsi sia per la comparsa di plasmidi ricombinanti (ovvero sono possibili eventi di ricombinazione a livello delle LTR).
Le colonie sono state analizzate mediante PCR con primer LTR5 S e GAG II AS (Tab. 3.3 e 3.6) che amplificano un frammento di 2338 bp (dati non mostrati).
A causa degli inconvenienti sopra detti sono stati ottenuti solo 2 cloni denominati pUC19/LTR5’, pol-env+env +LTR3’ (Tab.4.3).
4.6.2.5 Clonaggio del frammento gag-pol nel vettore pUC19/LTR5’, pol-env+env+LTR3’
Il DNA provirale di FIV M2 è stato, infine, interamente ricostruito clonando il frammento gag-pol nel pUC19/LTR5’, pol-env+env +LTR3’. Alcune difficoltà sono state incontrate nel ligare tale frammento alla LTR5’ e al frammento pol-env già inseriti nel pUC19; in particolare, l’enzima BpmI, l’unico a disposizione per ligare i frammenti gag-pol e pol-env, possiede siti di taglio sia sul pUC19 nel gene di resistenza all’ampicillina sia su tutti gli altri frammenti in cui il genoma di FIV è stato suddiviso (Tab. 3.11).
Al fine di clonare gag-pol nel pUC19/LTR5’, pol-env+env+LTR3’, è stata disegnata una strategia basata su due PCR successive e mostrata in fig. 4.22. In particolare, i frammenti gag-pol e pol-env subclonati nel pCRII-TOPO sono stati amplificati, rispettivamente, con i primer M21 S/GAG II AS e fPol-ORFA II S e AS (Tab. 3.3). Come target per la reazione di PCR sono stati scelti i plasmidi pCRII-TOPO/gag-pol, midollo osseo, clone 14 e pCRII-TOPO/pol-env, midollo osseo, clone 21. Gli amplificati delle due PCR sono stati poi mescolati e sottoposti ad una seconda amplificazione con i primer M21 S e fPol-ORFA II AS al fine di ottenere un unico amplificato gag-pol + pol-env di 5.5 kb.
Il prodotto della PCR è stato controllato mediante sequenziamento e quindi digerito con gli enzimi AvrII e SacII generando un frammento di 3862 bp; dopodiché, con lo scopo di linearizzare il vettore pUC19/LTR5’, pol-env+env+LTR3’ (clone 24), questo è stato digerito con gli stessi enzimi staccando una banda di 1939 bp (Fig. 4.23).
Lo screening delle colonie è stato effettuato mediante PCR con primer hp S e fPol-ORFA FI AS (Tab. 3.3 e 3.10) che amplificano un frammento di 1512 bp (dati non mostrati).
Dalla ligazione è stato ottenuto un solo clone denominato pUC19/LTR5’+gag-pol+pol-env+env+LTR3’, ovvero il plasmide pUC19 contenente l’intero DNA provirale di FIV M2.
4.7 VERIFICA DELLA CAPACITA’ REPLICATIVA DEL CLONE PRODOTTO CONTENENTE IL GENOMA DI FIV M2 RICOSTITUITO
4.7.1 Co-colture CrFK e MBM
Per saggiare la capacità replicativa del clone prodotto contenente il genoma ricostituito di FIV M2, questo è stato trasfettato sulla linea cellulare di fibroblasti renali felini CrFK ed il virus rilasciato nel surnatante di coltura è stato raccolto ed utilizzato per infettare la linea di linfoblasti T MBM.
A tal scopo co-colture CrFK e MBM sono state allestite come descritto in § 3.6. Sono stati seguiti due diversi protocolli di infezione delle MBM, effettuati in parallelo, consistenti nell’utilizzo o meno di un appropriato filtro per mantenere le due popolazioni cellulari separate.
Come controllo positivo è stato utilizzato il clone molecolare KKS. L’infezione è stata valutata monitorando il rilascio della proteina virale p25 nel surnatante a diversi giorni dall’infezione per circa due settimane. Il rapido e costante aumento della p25 nel surnatante suggerisce che il clone molecolare prodotto è replicazione competente (Fig. 4.24 e 4.25).
4.7.2 Infezione delle cellule MBM con il surnatante della co-coltura
Per confermare la capacità replicativa dei cloni molecolari contenenti l’intero genoma di FIV M2 ricostituito, il surnatante della co-coltura è stato raccolto a 7 giorni ed inoculato su colture fresche di MBM (§ 3.6.2). Come controllo positivo nel saggio di infezione è stato utilizzato il clone molecolare KKS.
La produzione virale è stata monitorata periodicamente per 2 settimane misurando il rilascio di antigene p25 nel surnatante di coltura.
Il rapido e costante aumento della p25 nel surnatante ha confermato la capacità replicativa del clone molecolare prodotto (Fig. 4.26).
4.8 SEQUENZIAMENTO DEL CLONE MOLECOLARE CONTENENTE L’INTERO GENOMA DI FIV M2 RICOSTITUITO
Il clone molecolare contenente l’intero DNA provirale di FIV M2 è stato interamente sequenziato come descritto in precedenza (§ 3.3.5) ed utilizzando i primer indicati in tab. 3.9 e 3.10.
L’analisi della sequenza nucleotidica e la traduzione nelle rispettive proteine codificate non hanno evidenziato stop codon o altre mutazioni missenso, a conferma di una completa capacità codificante (dati non mostrati).
