_________________________________________________________________ 45
7. Risultati
onsiderando i 5 prelievi fatti nella stazione 0 al momento del posizionamento dei mitili, i prelievi fatti successivamente al posizionamento nelle stazioni 1, 2, 3, 4 e l’unico prelievo fatto nella stazione 5, sono stati eseguiti in totale 18 diversi campionamenti.
Sono stati sottoposti alla ricerca di colifagi somatici e di fagi di Bacteroides
fragilis, 44 campioni di mitili: 6 provenienti dalla stazione 0 (Isola della
Palmaria), 10 dalla stazione 1 (Bocca di Magra), 9 dalla stazione 2 (Viareggio), 6 dalla stazione 3 (Bocca d’Arno), 12 dalla stazione 4 (Livorno) e 1 dalla stazione 5 (Capraia).
Nella tabella 3 vengono riportati i risultati relativi alle positività per colifagi somatici, fagi di HSP40 e fagi di RYC 2056, espressi come percentuale del rapporto fra il numero dei prelievi positivi e il numero dei prelievi eseguiti per ciascuna stazione [21].
_________________________________________________________________ 46 Nelle stazioni di studio 1, 2, 3, 4, sono stati isolati dai mitili, colifagi somatici anche se con frequenza diversa.
Fra i campioni risultati positivi i titoli in UFP/0,2 g di tessuto di mitilo oscillavano da 1 a 500 (Livorno, 11° prelievo del 02/03/2004), e 750 (Viareggio, 11° prelievo del 02/03/2004).
Solo nelle stazioni 2, 3 e 4 invece, sono stati isolati fagi litici per HSP 40, e comunque a titolo inferiore ad 1 UFP/0,2 g di tessuto.
Nelle stazioni 1, 2, 3, 4 sono stati isolati anche fagi litici per RYC 2056, ma i titoli per questi fagi sono stati sempre molto bassi; in 13 casi inferiori ad 1 UFP/0,2 g di tessuto ed in 14 casi variavano da 1 a 10 UFP/0,2 g di tessuto.
Nella stazione 5 (Isola della Capraia), dove sono stati prelevati mitili naturali, non sono stati isolati fagi.
Stazione Numero prelievi Positività* Colifagi Positività * fagi di HSP 40 Positività * fagi di RYC 2056 0 6 83.3% 0 83.3% 1 10 100% 0 80% 2 9 89% 11.1% 44.4% 3 6 83.3% 16.7% 50% 4 12 100% 16.7% 100% 5 1 0 0 0
* % rapporto n° positivi/n° prelievi
_________________________________________________________________ 47 Nella stazione 0 di partenza sono stati eseguiti 6 prelievi, 5 dei quali coincidono con il posizionamento dei mitili nelle stazioni di studio da 1 a 4: è escluso il prelievo del 11/12/2003, per il quale i mitili raccolti dall’isola della Palmaria non sono stati successivamente posizionati nelle stazioni di studio.
Anche dai campioni della stazione 0, (scelta come tale poiché considerata non inquinata), sono stati isolati colifagi somatici e fagi del RYC 2056 in cinque prelievi su sei, con titoli molto bassi: da 1 a 37 UFP/0,2 g di tessuto per i colifagi; da meno di 1a 2 UFP/0,2 g di tessuto per i fagi del RYC.
Prelievo/Posizionamento Data Collifagi (UFP/ml) Fagi HSP (UFP/ml) Fagi RYC (UFP/ml) Virus 1° 05/02/03 27 - + (2 ) + HAV/NLV 2° 08/05/03 0 - + (<1) - 3° 16/09/03 1 - - - 4° 04/11/03 30 - + (<1) - 5° * 11/12/03 6 - + (<1) - 6° 21/01/04 37 - + (<1) + HAV In giallo: - = spot test negativo; + = spot test positivo; fra parentesi = titolo in UFP/ml; * prelievo (tutti gli altri prelievo/posizionamento)
In blu: + = positività virale; - = negatività virale.
_________________________________________________________________ 48 Questo fatto ha reso più difficile la valutazione di contaminazione delle stazioni di studio relativamente a questi fagi.
Non sono stati isolati fagi di HSP 40.
Il grafico 1 riassume la situazione della stazione in esame.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 UFP/ml 1 2 3 4 5 6 prelievo/posizionamento Grafico 1 - Stazione 0
_________________________________________________________________ 49 Nella stazione 1, Bocca di Magra, sono stati eseguiti 10 prelievi.
Posiziona -mento Data posizionamento Prelievo Data prelievo Colifagi Somatici (UFP/ml) Fagi HSP (UFP/ml) Fagi RYC (UFP/ml) Virus 1° 05/02/2003 1° 05/03/03 NP NP NP NP 2° 03/04/03 NP NP NP NP 2° 08/05/2003 3° 22/05/03 20 - + (<1) + HAV 4° 09/06/03 15 - + (<1) + HAV/HEV 5° 25/06/03 7 - - + HAV 6° 11/07/03 35 - + (<1) - 7° 22/07/03 9 - - - 3° 16/09/2003 8° 01/10/03 26 - + (10) + HAV 4° 04/11/2003 9° 24/11/03 70 - + (1) + HAV 10° 11/12/03 3 - + (2) + HAV 5° 21/01/2004 11° 02/03/04 70 - + (6) - 12° 14/04/04 80 - + (<1) -
Dai mitili prelevati sono stati isolati colifagi somatici % dei cas
Dai mitili prelevati sono stati isolati colifagi nel 100% dei casi. I titoli oscillano da 3 a 80 UFP/0,2 g di tessuto di mitile.
In giallo: - = spot test negativo; + = spot test positivo; fra parentesi = titolo in UFP/ml; NP = non pervenuto; in blu: + = positività virale; - = negatività virale.
_________________________________________________________________ 50 Non sono stati isolati fagi di HSP 40, mentre si sono rilevati titoli di fagi RYC 2056 che oscillano da < 1 a 10 UFP/0,2 g di tessuto di mitile.
Il grafico 2 riassume la situazione in esame.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 UFP/ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 prelievo/posizionamento Grafico 2 - Stazione 1
_________________________________________________________________ 51 Per la stazione 2 di Viareggio sono stati eseguiti 9 prelievi.
Sono stati isolati colifagi somatici nell’89% dei prelievi, con un titolo che oscilla da 2 a 750 UFP/0,2 g di tessuto di mitile.
Posiziona-mento Data posizionamento Prelievo Data prelievo Colifagi Somatici (UFP/ml) Fagi HSP (UFP/ml) Fagi RYC (UFP/ml) Virus 1° 05/02/03 1° 05/03/03 20 - + (1) - 2° 03/04/03 12 - + (<1) - 2° 08/05/03 3° 22/05/03 3 - - + HAV 4° 09/06/03 0 - - - 5° 25/06/03 2 - - NP 6° 11/07/03 NP NP NP NP 7° 22/07/03 NP NP NP NP 3° 16/09/03 8° 01/10/03 100 - + (<1) + HAV 4° 04/11/03 9° 24/11/03 15 - - - 10° 11/12/03 30 - - - 5° 21/01/04 11° 02/03/04 750 + (<1) + (7) - 12° 14/04/04 NP NP NP NP Tabella 6 – Viareggio (Stazione 2)
- = spot test negativo; + = spot test positivo; fra parentesi = titolo in UFP/ml; NP = non pervenuto; in blu: + = positività virale; - = negatività virale.
_________________________________________________________________ 52 Fagi di HSP 40 sono stati rilevati in un prelievo su 9 totali con un titolo < 1 UFP/0,2 g di tessuto, mentre fagi di RYC 2056 sono stati rilevati in 4 prelievi su 9, con un titolo che oscilla da < 1 a 7 UFP/0,2 g di tessuto di mitile.
Il grafico 3 riassume la situazione.
0 100 200 300 400 500 600 700 800 UFP/ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 prelievo/posizionamento Grafico 3 - Stazione 2
colifagi somatici fagi HSP fagi RYC
_________________________________________________________________ 53 Nella stazione 3, Bocca d’Arno, sono stati eseguiti sei prelievi.
Posiziona-mento Data posizionamento Prelievo Data prelievo Colifagi Somatici (UFP/ml) Fagi HSP (UFP/ml) Fagi RYC (UFP/ml) Virus 1° 05/02/03 1° 05/03/03 NP NP NP NP 2° 03/04/03 NP NP NP NP 2° 08/05/03 3° 22/05/03 13 - - + HAV 4° 09/06/03 10 - + (<1) + HAV 5° 25/06/03 0 - - + HAV 6° 11/07/03 NP NP NP NP 7° 22/07/03 NP NP NP NP 3° 16/09/03 8° 01/10/03 2 - - - 4° 04/11/03 9° 24/11/03 NP NP NP NP 10° 11/12/03 4 - + (9) - 5° 21/01/04 11° 02/03/04 150 + (<1) + (3) - 12° 14/04/04 NP NP NP NP
I colifagi sono stati rilevati i 5 prelievi su 6, con un titolo che oscilla da 0 a 150 UFP/0,2 g di tessuto di mitile.
Tabella 7 – Bocca d’Arno (Stazione 3)
- = spot test negativo; + = spot test positivo; fra parentesi = titolo in UFP/ml; NP = non pervenuto; in blu: + = positività virale; - = negatività virale.
_________________________________________________________________ 54 Fagi di HSP 40 sono stati rilevati in un prelievo su 6 totali con un titolo < 1 UFP/0,2 g di tessuto, mentre fagi di RYC sono stati rilevati in 3 prelievi su 6, con un titolo che oscilla da < 1 a 9 UFP/0,2 g di tessuto di mitile.
Il grafico 4 riassume la situazione della stazione considerata.
0 20 40 60 80 100 120 140 UFP/ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 prelievo/posizionamento Grafico 4 - Stazione 3
_________________________________________________________________ 55 Infine, nella stazione 4, Livorno, sono stati eseguiti 12 prelievi.
Nel 100% dei casi i prelievi s sono rilevati positivi per colifagi somatici, con un titolo che oscilla da 10 a 500 UFP/0,2 g di tessuto di mitile.
Posiziona -mento Data posizionamento Prelievo Data prelievo Colifagi Somatici (UFP/ml) Fagi HSP (UFP/ml) Fagi RYC (UFP/ml) Virus 1° 05/02/03 1° 05/03/03 24 - + (3) - 2° 03/04/03 27 - + (7) + NLV ggI 2° 08/05/03 3° 22/05/03 70 - + (1) + HEV 4° 09/06/03 13 - + (<1) + HAV 5° 25/06/03 145 + (<1) + (<1) + HAV/HEV 6° 11/07/03 265 - + (<1) + HAV/HEV 7° 22/07/03 280 - + (<1) + HAV 3° 16/09/03 8° 01/10/03 90 - + (2) - 4° 04/11/03 9° 24/11/03 180 - + (<1) - 10° 11/12/03 380 - + (3) - 5° 21/01/04 11° 02/03/04 500 + (<1) + (1) - 12° 14/04/04 11 - + (<1) - Tabella 8 – Livorno (Stazione 4)
- = spot test negativo; + = spot test positivo; fra parentesi = titolo in UFP/ml; NP = non pervenuto; in blu: + = positività virale; - = negatività virale.
_________________________________________________________________ 56 Solo due prelievi (16,7%) sono risultati positivi per fagi di HSP 40, ma con un titolo < 1 UFP/0,2 g di tessuto; mentre in tutti i prelievi sono stati isolati fagi di RYC 2056, ma con un titolo molto basso (da <1 a 7 UFP/0,2 g di tessuto) [21].
Il grafico 5 riassume la situazione in esame.
0 20 40 60 80 100 120 140 UFP/ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 prelievo/posizionamento Grafico 5 - Stazione 4
_________________________________________________________________ 57 I grafici 6, 7, 8, descrivono invece separatamente, la percentuale di contaminazione da parte di un determinato fago nelle diverse stazioni di studio.
Grafico 6 - Contaminazione da colifagi
9%
26%
5% 57%
3%
stazione 0 stazione 1 stazione 2 stazione 3 stazione 4
Grafico 7 - Contaminazione da fagi di HSP
25% 25%
50%
_________________________________________________________________ 58
Grafico 8 - Contaminazione da fagi di RYC
31%
14% 19%
30%
6%
stazione 0 stazione 1 stazione 2 stazione 3 stazione 4
Nel grafico 9 sono riassunti i risultati del secondo posizionamento dei mitili nelle stazioni da 1 a 4 per quanto attiene alla ricerca di colifagi somatici.
20 3 13 70 15 0 10 13 7 2 0 35 9 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 pr 1 staz 1 pr 1 staz 2 pr 1 staz 3 pr 1 staz 4 pr 2 staz 1 pr 2 staz 2 pr 2 staz 3 pr 2 staz 4 pr 3 staz 1 pr 3 staz 2 pr 3 staz 3 pr 3 staz 4 pr 4 staz 1 pr 4 staz 4 pr 5 staz 1 pr 5 staz 4
Grafico9 - Risultati colifagi somatici (UFP/0,2 g) nei 5 prelievi (pr 1- 5)
_________________________________________________________________ 59
Tale posizionamento è stato quello che ha consentito un numero di prelievi maggiore e più esteso nel tempo.
Il prelievo nella stazione 0 fatto al momento del posizionamento aveva fornito risultati negativi per colifagi somatici per cui è stato possibile valutare le variazioni durante i successivi prelievi. Dai risultati si deduce che la stazione 4 è risultata la più contaminata in assoluto nel corso dei 5 prelievi eseguiti, seguita in ordine, dalle stazioni 1, 3 e 2.
Nella stessa campagna di prelievi la stazione 4 è risultata positiva al terzo prelievo anche per fagi di HSP 40, mentre per i fagi di RYC isolati a più riprese nelle stazioni 4, 3 ed 1, i risultati non possono essere considerati significativi in quanto il fago era già presente nei mitili prelevati dalla stazione 0 al momento del posizionamento. E’ molto probabile infatti che l’infezione si sia mantenuta nelle stesse stazioni di studio come in questo caso, e/o sia stata acquisita, come è successo invece nella campagna seguita al terzo posizionamento. Durante quest’ultimo, il prelievo effettuato dalla stazione 0 infatti ha messo in evidenza che i mitili di partenza non contenevano fagi di RYC.
La ricerca dei coliformi fecali sulle acque delle stazioni di studio è stata eseguita a partire dal 7° prelievo fino al 18°.
Nella tabella 9 sono riportati i risultati cumulativi limitatamente alle determinazioni per colifagi e coliformi eseguite sui prelievi di mitili e di acqua fatti contemporaneamente.
_________________________________________________________________ 60 Rilevamento Colifagi UFP/ml Coliformi UFC/ml 1 1 0 2 30 8 3 6 0 4 37 2 5 7 10 6 35 24 7 9 53 8 26 22 9 70 600 10 3 300 11 70 8 12 80 1 13 2 9 14 100 23 15 15 0 16 30 1000 17 750 110 18 0 300 19 2 30 20 4 200 21 150 500 22 145 8 23 265 17 24 280 20 25 90 102 26 180 51 27 380 0 28 500 50 29 11 10 30 0 0
_________________________________________________________________ 61
Per ciò che riguarda la ricerca di virus enterici umani sono stati sottoposti ad analisi virologica 43 campioni di mitili: 6 provenienti dalla stazione 0 (Isola della Palmaria), 10 dalla stazione 1 (Bocca di Magra), 8 dalla stazione 2 (Viareggio), 6 dalla stazione 3 (Bocca d’Arno), 12 dalla stazione 4 (Livorno) e 1 dalla stazione 5 (Capraia).
Doppie infezioni si sono verificate in 3 campioni (2 HAV/HEV, 1 HAV/NLV ggI), mentre monoinfezioni si sono verificate in 16 campioni.
Dei campioni sottoposti ad analisi virologica, il 51,2% è risultato positivo per i virus enterici (grafico 11).
Grafico 10 - Risultati complessivi dell'analisi
virologica
51,20% 48,80%
_________________________________________________________________ 62
La positività virale è distribuita come in tabella 10:
17 campioni su 43 analizzati sono risultati positivi per il virus dell’epatite A, pari al 39,6%. Inoltre 3 campioni, uno proveniente dalla stazione (Bocca di Magra) e due dalla stazione 4 (Livorno), sono risultati positivi per il virus dell’epatite E (7%).
I virus Norwalk genotipo I sono stati evidenziati in 2 campionamenti su 43 (4,6%). Non sono stati rilevati campioni positivi per Norwalk virus genotipo II.
Nessuno dei campioni analizzati è risultato positivo per Enterovirus, Rotavirus e Astrovirus [21].
Questi dati, gentilmente forniteci dal Dipartimento di Sanità Pubblica della Facoltà di Medicina di Roma Tor Vergata, ci sono serviti per effettuare una analisi statistica sulla possibile correlazione tra presenza di fagi e virus nei mitili, e di conseguenza nell’ambiente.
In tabella 11 sono riportati i risultati cumulativi per ciascuna stazione
relativi alla presenza/assenza di fagi e virus a cui si è fatto riferimento ai fini della suddetta analisi. N. di campioni positivi Positività virale % 17 HAV 39,6 3 HEV 7 2 NLV ggI 4,6
_________________________________________________________________ 63
PALMARIA BOCCA DI MAGRA VIAREGGIO BOCCA D'ARNO LIVORNO CAPRAIA Colifagi Fagi di
B.fragilis Virus Colifagi
Fagi di
B.fragilis Virus Colifagi
Fagi di
B.fragilis Virus Colifagi
Fagi di
B.fragilis Virus Colifagi
Fagi di
B.fragilis Virus Colifagi
Fagi di B.fragilis Virus 1 Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Pos Neg Pos Neg Pos Pos Pos Neg Neg Neg Neg 2 Neg Pos Neg Pos Pos Pos Pos Pos Neg Pos Pos Pos Pos Pos Pos 3 Pos Neg Neg Pos Neg Pos Pos Neg Pos Neg Neg Pos Pos Pos Pos 4 Pos Pos Neg Pos Pos Neg Neg Neg Neg Pos Neg Neg Pos Pos Pos 5 Pos Pos Neg Pos Neg Neg Pos Pos Pos Pos Pos Neg Pos Pos Pos 6 Pos Pos Neg Pos Pos Pos Pos Neg Neg Pos Pos Neg Pos Pos Pos 7 Pos Pos Pos Pos Neg Neg Pos Pos Pos 8 Pos Pos Pos Pos Pos Neg Pos Pos Neg 9 Pos Pos Neg Pos Pos Neg 10 Pos Pos Neg Pos Pos Neg 11 Pos Pos Neg 12 Pos Pos Neg
_________________________________________________________________ 64
I dati della tabella sono stati considerati “appaiati” in questo modo: colifagi - fagi di Bacteroides fragilis, colifagi - virus, fagi di Bacteroides fragilis - virus, ed analizzati successivamente con χ2 di Mc Nemar.
I risultati mostrano che non abbiamo nessuna concordanza tra le frequenze di colifagi e fagi di Bacteroides fragilis, e tra colifagi e virus, visto il valore del k molto basso con intervallo di confidenza molto alto. Ad ogni modo i colifagi somatici risultano significativamente più frequenti statisticamente (χ2 di Mc Nemar alto) dei fagi del B. fragilis e dei virus.
Esiste invece, una concordanza tra frequenza dei fagi del B. fragilis e quella dei virus. Anche da questo confronto comunque, i fagi risultano essere, da un punto di vista statistico, significativamente più frequenti dei virus.
