DNA$ricombinante$ Possibile$esprimere$prodo4o$genico$di$una$data$specie,$in$una$specie$diversa.$

1

DNA$ricombinante$

Possibile$esprimere$prodo4o$genico$di$una$data$specie,$in$una$specie$diversa.$

Questo$possibile$grazie$ad$universalità$del$codice$gene=co$

2

Conce4o$DNA$ricombinante$diverso$dal$conce4o$di$ricombinazione$

$DNA$ricombinante$prevede$un$ve4ore$ed$un$inserto.$

Inserto$con=ene$DNA$di$interesse$(un$gene,$una$funzione,$ecc.)$

Ve4ore$con=ene$sequenze$di$regolazione,$origine$di$replicazione,$si=$di$clonaggio,$

ecc.$

3

Esempio$DNA$ricombinante:$un$frammento$di$DNA$di$un$anfibio,$inserito$in$un$

ve4ore$plasmidico$ba4erico$(conce4o$di$origine$da$organismi$diversi)$

4

DNA$principio$trasformante.$Quindi$depositario$informazione$gene=ca$

5

Perchè$trasformazione$da$ceppo$non$patogeno$ruvido,$a$ceppo$patogeno$liscio?$

Frammento$codificante$gene$capsula,$poteva$trasformare$cellule$non$patogene,$

rendendole$patogene$

6

DNA$trasformante,$se$entra$in$cellula$ricevente,$può$ricombinare$ed$entrare$a$far$

parte$del$genoma$della$cellula$trasformata$

Ovviamente$è$possibile$trasformare$ba4eri$con$una$molecola$di$DNA$autonoma,$ossia$

un$“miniOcromosoma”$circolare$(in$genere$un$plasmide)$che$porta$i$geni$di$interesse$

7

Modalità$di$scambio$di$materiale$gene=co$più$“fisiologica”,$a4raverso$coniugazione$

8

Coniugazione$passa$a4raverso$una$funzione$codificata$da$una$molecola$di$DNA$

extracromosomica$de4a$plasmide$

Si$duplica,$ssDNA$passa$nel$pilus,$e$la$cellula$ricevente$oUene$copia$plasmide$

9

In$natura,$problema$legato$ad$insorgenza$RESISTENZE$ad$an=bio=ci$

Tra4amento$massivo$animali$da$allevamento$con$an=bio=ci,$favorisce$selezione$

ceppi$resisten=$

Plasmidi$possono$essere$scambia=$a$volte$anche$fra$specie$diverse$compa=bili,$sia$

dire4amente,$sia$a4raverso$trasformazione$

10

Plasmide$classico,$fa4ore$F,$ossia$fa4ore$di$Fer=lità$

Se$fa4ore$F$è$integrato$nel$genoma$della$cellula$donatrice,$quando$avviene$scambio,$

possono$essere$trasferi=$anche$frammen=$del$cromosoma$della$cellula$donatrice$

11

Il$plasmide$circolare$viene$tagliato.$Un$filamento$migra,$l’altro$rimane.$

Ciascuno,$nel$donatore$e$nel$ricevente,$fa$da$stampo$per$l’elica$complementare$

12

13

Materiale$gene=co$può$passare$da$na$cellula$all’altra$anche$a4raverso$tradsduzione$

Ciclo$infeUvo$virus$ba4erico,$o$fago$

14

Ciclo$li=co,$lisi$della$cellula$e$liberazione$nuova$progenie$virale$

$

15

Ciclo$lisogeno,$virus$integra,$ma$non$replica$

In$seguito$ad$induzione,$virus$quiescente$può$reaUvarsi.$

16

Se$in$seguito$ad$infezione,$si$ha$degradazione$del$DNA$cellulare,$alcune$par=celle$

virali$possono$incorporare$DNA$della$cellula…$

…e$quindi$trasdurre$questo$DNA$in$una$nuova$cellula,$al$momento$dell’infezione$

17

Visualizzazione$infezione$fagica:$piastra$di$Petri$con$terreno$di$coltura.$

Ba4eri$vi$crescono,$formando$una$pa=na$opaca$

Nei$pun=$in$cui$è$in$corso$infezione$fagica,$si$ha$lisi,$e$quindi$compaiono$zone$“chiare”$

sulla$pa=na$di$cellule$ba4eriche$

18

Zone$“chiare”$non$contengono$cellule,$perchè$lisate$dal$virus$

19

Quindi$sia$i$plasmidi,$sia$i$fagi,$possono$essere$u=lizza=$come$ve4ori$di$DNA$

ricombinante$

20

Per$“clone”$si$intende$una$popolazione$di$cellule$od$organismi$gene=camente$iden=ci$

e$derivan=$da$un$singolo$progenitore$

In$biologia$molecolare,$indica$una$popolazione$di$molecole$ricombinan=$aven=$lo$

stesso$inserto,$o$una$colonia$di$microrganismi$che$ospita$una$specifica$sequenza$di$

DNA$inserita$in$un$ve4ore.$

21

Se$dei$ba4eri$vengono$trasforma=,$in$ognuno$viene$inserita$una$diversa$molecola$di$

DNA$ricombinante$(ve4ore$+$inserto)$

Crescendo,$ogni$singola$cellula$forma$una$colonia$di$organismi$iden=ci,$ossia$dei$cloni$

22

23

Frammen=$di$DNA$deriva=$da$specie$diverse,$possono$essere$“taglia=”$e$“ricuci=”$

insieme,$grazie$all’impiego$degli$enzimi$di$restrizione$

24

Alcuni$enzimi$di$restrizione$creano$dei$frammen=$di$DNA$le$cui$estremità$sono$

“coesive”:$$

Taglio$“sfalsato”$sulle$due$eliche,$lascia$piccolo$tra4o$di$DNA$a$singola$elica.$Un$

frammento$di$DNA$iverso$tagliato$con$lo$stesso$enzima,$crea$una$estremità$

complementare,$che$quindi$perme4e$l’appaiamento$delle$singole$eliche$

complementari$presen=$su$frammen=$diversi,$e$la$loro$ricongiunzione$

$

25

Quando$estremità$non$sono$sfalsate,$ma$il$taglio$è$“pia4o”,$le$estremità$non$sono$

coesive.$Taglio$de4o$“blunt”$

Diversi$enzimi$riconoscono$sequenze$di$restrizione$diverse$

Si$può$avere$sia$5’$protruding$(EcoRI,$HindIII)$sia$3’$protruding$(PstI)$

26

Nome$enzimi:$da$microorganismo$nel$quale$è$stato$iden=ficato.$

Ad$esempio,$EcoRI$significa$“Escherichia$coli$Restric=on$(enzyme)$I$

$

27

Perchè$gli$enzimi$di$restrizioni$u=lizza=$per$la$creazione$di$molecole$di$DNA$

ricombinante,$formano$estremità$coesive,$compa=bili$quando$il$taglio,$sulle$diverse$

molecole$di$DNA,$viene$fa4o$con$lo$stesso$enzima?$Perchè$la$sequenza$target$è$

palindromica$

$

Quadrato$SATOR,$Ercolano,$79$DC$

28

Una$stessa$sequenza,$le4a$nella$stessa$direzione$(5’=>3’)$su$entrambe$le$eliche$

$

29

Enzima$riconosce$sequenza$palidroma,$e$la$taglia$

30

Se$due$molecole$di$DNA$diverse$vengono$tagliate$con$lo$stesso$enzima$di$restrizione,$

formano$estremità$coesive$

Queste$possono$legarsi$solo$a$molecole$che$hanno$estremità$compa=bili$

31

Ve4ore$(nero)$tagliato$con$un$enzima$di$restrizione$

Inserto$(colore)$tagliato$con$lo$stesso$enzima$di$restrizione$

$estremità$sono$compa=bili,$possono$legarsi$grazie$a$complementarietà$fra$le$basi$

Se$ligate,$formano$una$nuova$molecola$di$DNA$ricombinante$

32

33

Enzima$di$restrizione$taglia$legame$fosfodiesterico$

34

Esistono$diversi$enzimi$di$restrizione$

Quelli$che$creano$estremità$coesive$compa=bili,$sono$deU$di$Tipo$II$

Altri$enzimi$(di$=po$I$e$di$=po$III)$invece$possono$tagliare$in$posizioni$diverse$rispe4o$

al$sito$di$riconoscimento.$Ques=$non$possono$essere$u=lizza=$per$formare$estremità$

coesive$

35

Quale$è$significato$biologico$della$restrizione$

DNA$esogeno$può$appartenere$ad$un$patogeno.$Questo$viene$riconosciuto$da$

nucleasi$di$restrizione$(gli$enzimi$di$restrizione$sono$delle$endonucleasi)$che$lo$

degrada$

$

36

Come$fa$enzima$di$restrizione$a$riconoscere$DNA$della$cellula$e$a$non$tagliarlo?$

Sequenza$bersaglio$dell’enzima$di$restrizione$può$essere$modificata,$ad$esempio$

mediante$me=lazione$di$alcune$basi$

37

38

Se$estremità$sono$coesive,$frammen=$possono$essere$salda=$da$ligasi$

Se$sono$pia4e,$ligazione$possibile$grazie$ad$una$par=colare$ligasi,$derivata$dal$fago$T4$

39

40

In$diagnos=ca:$

Paziente$con$anemia$falciforme,$mutazione$che$determina$perdita$di$un$sito$MstII$

Restrizione$crea$frammento$più$grande$in$paziente$con$mutazione,$frammento$

piccolo$in$paziente$normale$

Frammento$grande:$sogge4o$S/S$

Frammento$piccolo:$sogge4o$A/A$

Entrambi:$portatore$A/S$

41

42

In$seguito$a$trasformazione,$si$inserisce$molecola$ricombinante$in$cellula$ba4erica$

Crescita$in$terreno$di$coltura,$mol=plicazione.$DNA$può$essere$estra4o$da$cellule$

ba4eriche$in$numerose$copie$

43

Se$taglio$una$grande$molecola$di$DNA$con$un$dato$enzima,$si$producono$frammen=$

diversi$

Se$tuU$vengono$clona=,$ogni$ba4erio$riceve$un$frammento$diverso$

Facendo$crescere$le$colonie,$ogni$colonia$porta$un$frammento$diverso$

DILUIZIONE$delle$cellule$ba4eriche$dopo$trasformazione,$in$modo$da$averne$poche$e$

separate$fra$di$loro$sulla$piastra$

Crescendo,$formano$colonie$dis=nte$e$separate$

44

Se$voglio$individuare$colonia$che$con=ene$uno$specifico$frammento,$posso$u=lizzare$

delle$sonde.$

Una$sonda$è$una$molecola$di$DNA$complementare$alla$molecola$che$sto$cercando$

nelle$diverse$colonie$ba4eriche$

Marco$DNA,$lisi,$ibridazione,$e$la$sonda$marcata$si$lega$in$corrispondenza$della$

colonia$che$con=ene$DNA$complementare$

45

Non$tuU$i$ba4eri$ricevono$il$plasmide.$Come$separare$ba4eri$trasforma=$da$ba4eri$

non$trasforma=?$

Si$u=lizza$un$plasmide$che$porta$un$gene$per$la$res=stenza$ad$un$dato$an=bio=co.$

Facendo$crescere$i$ba4eri$in$presenza$di$an=bio=co,$solo$quelli$trasforma=$potranno$

crescere$e$duplicarsi$

46

Negli$anni$sono$sta=$messi$a$punto$diversi$ve4ori$di$clonaggio,$con$diverse$

cara4eris=che:$gene$per$la$resistenza,$gene$per$la$betaOla4amasi$(LacZ),$ve4ori$di$

espressione$se$hanno$sequenze$regolatrici,$resistenze$mul=ple.$

TuU$hanno$originedi$replicazione$

47

Una$lbreria$genomica$consiste$in$un$insieme$di$cloni,$ciascuno$contenente$un$diverso$

inserto$di$DNA.$Ciascun$frammento$ha$la$stessa$origine.$

Libreria$genomica$di$un$dato$organismo,$o$di$un$dato$cromosoma,$o$di$un$altro$

microorganismo,$ecc.$

48

Genoteca$e$libreria$gene=ca$sono$sinonimi$

49

In$seguito$a$trasformazione,$posso$avere:$

$Ba4eri$non$trasforma=$=>$nessun$plasmide$

Ba4eri$trasforma=$con$plasmide$senza$inserto$=>$resisten=$

Ba4eri$trasforma=$con$plasmide$con$inserto$=>$resisten=$

$$

50

Quindi$selezione$non$solo$dei$ba4eri$trasforma=,$ma$anche$di$quelli$trasforma=$che$

hanno$l’insrto$(rispe4o$a$ba4eri$trasforma=$solo$con$il$ve4ore$plasmidico)$

51

Devo$u=lizzare$un$sistema$che$perme4a$soltanto$la$crescita$di$cellule$ba4eriche$

trasformate$con$plasmide$che$con=ene$l’inserto.$

52

Primi$sistemi:$doppia$resistenza$

Plasmide$di$E.$coli,$pBR322.$

Resistenza$ad$Ampicillina$e$a$Tetraciclina$

Taglio$in$un$gene$per$la$resistenza$(ad$es.$Ampicillina),$e$inserisco$inserto$

$

Plasmide$non$modificato$porta$entrambe$le$resistenze$

Plasmide$con$iserto$porta$solo$la$resistenza$alla$tetraciclina$(gene$ampicillina$

inaUvato$da$inserzione$del$frammento$clonato)$

53

Inserzione$del$frammento$inaUva$il$gene$per$la$resistenza$

54

55

3$=pi$di$ba4eri:$

Resisten=$a$tetraciclina$e$ad$ampicillina:$ve4ore$senza$inserto$

Resisten=$solo$a$tetraciclina:$ve4ore$con$inserto$(gene$ampicillina$inaUvato)$

Sensibili:$non$è$stato$trasformato$dal$plasmide$

56

Ba4eri$vengono$piastra=$su$due$diverse$Petri$

Una$con=ene$solo$tetraciclina,$l’altra$entrambi$gli$an=bio=ci$

Ba4eri$$che$crescono$su$piastra$Tet+$ma$non$su$piastra$Tet+Amp+,$sono$quelli$che$

hanno$l’inserto$

Possono$essere$recupera=$dalla$piastra$corrispondente$Tet+$AmpO$$

57

Successivo$sistema$di$selezione:$gene$LacZ$produce$BetaOgala4osidasi$(Lac$Operon)$

58

Prodo4a$subunità$alfa$lacZ$in$ceppo$ba4erico$che$non$la$produce$(mutante).$

Quindi$solo$i$ba4eri$trasforma=$da$plasmide$che$con=ene$gene$LacZOalfa,$possono$

produrre$l’enzima$

$Clonaggio$nella$sequenza$codificante$per$LacZ.$

$

59

Nel$gene$LacZ,$si=$per$diversi$enzimi$di$restrizione$

60

$Se$gene$integro$(non$si$ha$inserto),$betaOgal$prodo4a$

Se$gene$interro4o$da$inserto,$betaOgal$non$prodo4a$

61

In$presenza$di$XOgal$(analogo$del$la4osio),$cellule$che$non$hanno$inserto,$producono$

betaOgal$

Cellule$con$inserto,$non$la$producono$

BetaOgal$scinde$XOgal,$e$il$prodo4o$processato$determina$colorazione$blu$colonie$

$

Colonie$blu:$hanno$plasmide$ma$non$hanno$inserto$

Colonie$bianche:$hanno$plasmide$con$inserto$

$

62

Ba4eri$non$trasforma=:$non$crescono,$perchè$plasmide$con=ene$anche$gene$per$

resistenza$ad$an=bio=co$

$

63

Ba4eri$non$trasforma=:$non$crescono,$perchè$plasmide$con=ene$anche$gene$per$

resistenza$ad$an=bio=co$

$

64

Ogni$ba4erio$porta$un$frammento$diverso$del$genoma$originario$

65

66

Se$voglio$individuare$colonia$che$con=ene$uno$specifico$frammento,$posso$u=lizzare$

delle$sonde.$

Una$sonda$è$una$molecola$di$DNA$complementare$alla$molecola$che$sto$cercando$

nelle$diverse$colonie$ba4eriche$

Marco$DNA,$lisi,$ibridazione,$e$la$sonda$marcata$si$lega$in$corrispondenza$della$

colonia$che$con=ene$DNA$complementare$

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68

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Con$le$sonde,$posso$ricostruire$con=guità$fra$frammen=$clona=$in$cloni$ba4erici$

diversi$

Individuo$un$frammento.$Faccio$una$sonda$da$sequenza$all’estremità$

U=lizzo$questa$sonda$per$trovare$molecola$adiacente,$ecc.$Ecc.$

71

72

Taglia$più$frequentemente$un$enzima$di$restrizione$che$riconosce$4$bp,$o$un$enzima$

che$riconosce$6$pb?$

Perchè?$

Quale$è$la$dimensione$media$dei$frammen=$o4enu=$tagliando$con$un$ER$4$bp$e$con$

un$ER$6$bp?$

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