2.1 MATERIALI
• Il cDNA codificante per la forma bovina della 5’-nucleotidasi citosolica II, clonato a partire dall’RNA estratto dal timo di vitello, inserito nel vettore plasmidico pET 28C e fatto esprimere in E. coli come descritto da Allegrini e coll. (1997).
• Luria Broth e Luria Agar, kanamicina, imidazolo, ATP, IMP, inosina, ammonio formiato e albumina di siero bovino (BSA) sono stati acquistati dalla Sigma
Aldrich, St. Louis MO. USA.
• SDS, cloruro di magnesio, cloruro di sodio, β-mercaptoetanolo sono stati acquistati dalla BDH Chemicals.
• Ammonio persolfato, acrilammide e bis-acrilammide, TEMED, colorante Comassie Brillant Blue G250, agarosio, TBE buffer sono stati acquistati dalla ditta BioRad. • Resina agarosio Ni-NTA, QIAEX II agarose gel extraction kit, QIAprep Miniprep
kit per la purificazione del plasmide sono stati acquistati dalla Qiagen S.p.A. • Ditiotreitolo (DTT) è stato acquistato dalla Sigma Chemical Co.
• [8-14C] inosina e [8-14C] IMP sono stati acquistati dalla Moravek Biochemical.
• Fogli di carta cromatografica DE-81 sono stati acquistati dalla Whatman,
Maidstone, England.
• Lastre di PEI-cellulosa sono state acquistate dalla Merck (prima di essere utilizzate vengono pre-lavate una volta con 10% NaCl e tre volte con acqua demonizzata). • Liquido di scintillazione Hi safe II è stato acquistato da Wallac.
• 1 Kb DNA ladder, enzima di restrizione DpnI, dNTP mix, Pfu DNA polimerasi, soluzione di bromuro di etidio sono stati acquistati dalla Promega.
• Primers sono stati acquistati dalla Invitrogen.
• Amicon Ultra Centrifugal Filter Devices è stata acquistata dalla MILLIPORE. • Tris (base), glicerolo sono stati acquistati dalla J.T. Baker.
• Là dove si richiedeva acqua estremamente pura è stata preparata, mediante il sistema Millipore, acqua Milli Q.
Tutti gli altri reagenti chimici usati sono della migliore qualità e del massimo grado di purezza.
2.2 METODI
2.2.1 MUTAGENESI SITO-DIRETTA
I mutanti puntiformi sulla glicina 99, localizzata in una lunga sequenza aminoacidica tra il motivo I e II, sono stati ottenuti con due reazioni di PCR. Nella prima PCR vengono utilizzati due primer, uno mutagenico e uno specifico, per amplificare una corta sequenza di 360 bp; questo tratto di DNA, detto megaprimer, contiene la mutazione desiderata e viene utilizzato nella seconda PCR per amplificare l’intera sequenza.
La prima PCR contiene 30 ng del plasmide pET 28c+5’-N, 0.6 µM di ciascun primer (mutagenico e specifico), 0.8 mM dNTPs e 1.5 U Pfu DNA polimerasi nel suo buffer 10X in un volume totale di 25 µl. Il programma di PCR utilizzato prevede una iniziale denaturazione a 94 °C per 1 minuto, seguito da 35 cicli di 94 °C per 3 secondi, 48 °C per 30 secondi e 72 °C per 2 minuti, infine si ha un ultimo passaggio a 4 °C. Il prodotto di questa PCR è stato isolato con una elettroforesi su gel di TBE agarosio all’1% ed estratto dal gel con il kit di estrazione della QUIAGEN.
PRIMER SEQUENZA G99P_F 5’-TTCCCTACCAGGCCACTAGT-3’ G99A_F 5’-TTCCCTAGCAGGCCACTAGT-3’ G99V_F 5’-TTCCCTAGTAGGCCACTAGT-3’
G99_R 5’-CCCAGTCAACTGCGTCTCTT-3’
Tabella II: SEQUENZE DEI PRIMERS UTILIZZATI NELLA PRIMA PCR
La seconda PCR contiene 30 ng di plasmide wild-type che deve essere mutato, 250 ng del prodotto della prima reazione di PCR in un volume di 10 µl, 0.8 mM dNTPs e 1.5 U
Pfu DNA polimerasi nel suo buffer 10X in un volume totale di 25 µl. Il programma utilizzato per questa seconda reazione prevede una iniziale denaturazione a 94 °C per 1 minuto, seguito da 17 cicli di 95 °C per 30 secondi, 50 °C per 30 secondi e 72 °C per 2X minuti, dove X è la lunghezza in kb del plasmide; alla fine i campioni vengono tenuti a 4°C. Per verificare la corretta riuscita di questa seconda PCR si prepara un gel di agarosio allo 0.7% su cui viene caricato il prodotto della reazione. Una volta appurato il buon esito, l’amplificato viene trattato con 5 unità dell’enzima di restrizione DpnI ed incubato a 37 °C
per un’ora. L’enzima di restrizione digerisce il DNA batterico metilato del plasmide alla sequenza 5’-GATC-3’ e lascia intatto il DNA di nuova sintesi non metilato [West and
Wilson 2002].
2.2.2 TRASFORMAZIONE DEI BATTERI XL-1-Blue E BL21
Pochi µl di una coltura preesistente di cellule XL-1-Blue vengono inoculati in 100 ml di terreno Luria Broth (LB) fresco e incubati in agitazione a 37 °C. Quando la coltura batterica raggiunge un’assorbanza di 0.5 a 600 nm, le cellule vengono centrifugate a 1000g per 10 minuti ad una temperatura di 4 °C. Dopo di che i batteri vengono delicatamente risospesi in 12.5 ml di TFBI buffer (30 mM KAc, 50 mM MnCl2, 100 mM RbCl), incubati
in ghiaccio per 10 minuti e centrifugati a 1000g per 10 minuti a 4 °C. Il pellet formato viene nuovamente risospeso in 2 ml of TFBII buffer (10 mM MOPS, 75 mM CaCl2 x
2H2O, 10 mM RbCl, 15% glicerolo). A questo punto aliquote di 100 µl di batteri
competenti vengono trasferite in contenitori contenenti 50 ng del DNA che le cellule devono assorbire; la miscela viene incubata per 1 minuto in ghiaccio, 1 minuto a 42 °C, poi si aggiungono 300 µl di terreno fresco LB e incubato a 37 °C per 1 ora. L’intero volume viene piastrato su piastre Petri contenenti LB agar + kanamicina e queste incubate overnight a 37 °C.
Dalle piastre si prelevano singole colonie che vengono messe a crescere in un terreno LB addizionato con Kanamicina per ottenere delle colture monoclonali; da queste cellule viene purificato il plasmide utilizzando il QIAprep Miniprep kit e per verificare che nel DNA sia presente la mutazione desiderata è stato eseguito il sequenziamento del plasmide dall’istituto ENEA di Roma e dal laboratorio di Biologia Molecolare dell’UCSC di Roma, che hanno confermato il buon esito della mutagenesi.
Il ceppo batterico BL21 viene fatto crescere in 100 ml di terreno LB fino a quando la coltura non raggiunge una assorbanza di 0.3 a 600 nm. Le cellule vengono quindi centrifugate a 1000g per 10 minuti a 4 °C e risospese delicatamente in 5 ml di 1X TSS (10g PEG, 5 ml DMSO, 50 ml 2xLB, 4 ml 1M MgCl2, 31 ml H2O) e incubate in ghiaccio.
100 µl di cellule competenti vengono trasferite in contenitori contenenti 1 µg di DNA e lasciate in ghiaccio per 30 minuti. Trascorso questo tempo sono stati aggiunti 0.9 ml di terreno LB e 20 mM di glucosio e la miscela è stata trasferita a 37 °C per 1 ora in leggera agitazione. 100 µl della miscela sono stati piastrati su piastre Petri contenenti LB agar +
kanamicina, utili per selezionare le colonie contenenti il pET 28c+5’-N; le piastre vengono incubate overnight a 37 °C. Le colonie cresciute sono state utilizzate per ottenere nuove colture monoclonali e preparare degli stocks, ovvero delle aliquote di coltura cellulare conservate a –80 °C in contenitori contenenti l’80% di coltura batterica e il 20% di glicerolo.
2.2.3ESPRESSIONE E PURIFICAZIONE DELLE PROTEINE RICOMBINANTI
Un’ aliquota di cellule BL21, contenenti il plasmide con il gene mutato, viene prelevata dallo stock ancora congelato e aggiunta a 200 ml di terreno LB + Kanamicina incubato overnight in agitazione a 37 °C. La crescita delle cellule renderà il terreno torbido e quando questo raggiunge un’assorbanza di 0.5 a 600 nm viene aggiunto 1 mM di IPTG che induce solo la sintesi della sequenza inserita nel plasmide perché il suo promotore è simile al promotore Lac di E. coli; l’incubazione prosegue per altre tre ore (il tempo che teoricamente è necessario per avere la massima espressione della proteina ricombinante), dopo di che il terreno viene centrifugato a 1000g per 20 minuti a 4 °C. Il sovranatante viene scartato e il pellet (circa 1 gr) viene risospeso in 4 ml di lysis buffer (Tris-HCl 50mM pH 8.0 + NaCl 300mM + 10mM imidazolo), dopo di che si aggiunge 1 mg/ml di lisozima e si lascia in ghiaccio per 30 minuti. Le cellule vengono poi sonicate per 6 cicli di 10 secondi tenendo però i batteri in ghiaccio per evitare che gli ultrasuoni dello strumento riscaldino troppo il campione e quindi denaturino le proteine. Il lisato viene centrifugato a 10000g per 30 minuti a 4°C, affinché le membrane citoplasmatiche e gli organelli possano precipitare e nel sovranatante (estratto grezzo) rimangano tutte le proteine del solubile cellulare.
L’enzima espresso dalle cellule batteriche contiene una sequenza di sei istidine (His-tag) separata dalla sequenza della cN-II dal sito di consenso per la trombina. Questa sequenza presente nel plasmide pET 28c è stata inserita per facilitare la purificazione della proteina, perché la coda di istidine all’estremità N-terminale causa l’adsorbimento dell’enzima con gli ioni nichel della resina per affinità Ni-NTA agarosio, rendendo possibile la purificazione della proteina con un solo e semplice passaggio. Il sovranatante viene trasferito in un piccolo becker contenente 1 ml di resina Ni-NTA agarosio al 50%, la sospensione viene tenuta in agitazione per 1 ora in ghiaccio. La resina viene lavata due volte con 4 ml di wash buffer (Tris-HCl 50mM pH 8.0 + NaCl 300mM + 20mM imidazolo) che rimuove le proteine che non sono legate alla resina; la proteina
ricombinante mutata viene eluita dalla resina con quattro lavaggi di 0.5 ml di elution buffer (250mM imidazolo in Tris-HCl 50mM + NaCl 300mM pH 8.0).
2.2.4 STIMA DELLA CONCENTRAZIONE PROTEICA
Per stimare la concentrazione delle proteine in soluzione si adopera il saggio di Bradford, che prevede l’utilizzo del colorante Coomassie Brillant Blue, in grado di legarsi ai residui basici delle proteine. Poiché il contenuto di aminoacidi basici varia a seconda della proteina, questo metodo fornisce solo una misura relativa della concentrazione proteica. Il reattivo di Bradford è un composto acquoso di Blu di Coomassie allo 0.01%, etanolo al 4.7% e acido fosforico all’8.5%.
Per calcolare la concentrazione proteica è necessario costruire una retta di taratura che esprima l’assorbanza a 595 nm in funzione della concentrazione di una proteina nota, l’albumina di siero bovino (BSA). Vengono preparate delle soluzioni con concentrazioni crescenti e conosciute (comprese tra 0 e 6 µg/µl) di BSA, alle quali viene aggiunto il reattivo di Bradford. Trascorsi 15 minuti a temperatura ambiente, necessari per dare il tempo al colorante di legarsi alla proteina, si registra l’assorbanza e si riporta in grafico. La retta di taratura, così ottenuta, viene utilizzata per interpolare la concentrazione proteica di una qualunque soluzione incognita; quest’ultima è sottoposta allo stesso trattamento, ma deve essere diluita in modo che la sua assorbanza ricada nell’intervallo del grafico. Generalmente si preparano almeno tre campioni della soluzione a concentrazione incognita, per stimare la quantità di proteina come media aritmetica dei tre valori.
2.2.5 ELETTROFORESI SDS-PAGE
La preparazione del gel viene eseguita secondo il protocollo descritto da Laemmli (1970). Il gel al 10% di acrilammide è stato fatto per verificare la corretta purificazione e il grado di purezza dei tre mutanti. La corsa elettroforetica è stata effettuata ad una intensità di 20 mA e dal confronto delle bande dei campioni con quelle degli standard è possibile valutare le masse molecolari relative e quindi verificare se corrisponde a quella dell’enzima ricombinante (Figura 3-B).
2.2.6 DOSAGGIO DELL’ATTIVITA′ FOSFOTRANSFERASICA
Con il dosaggio radiochimico l’attività PHT della cN-II viene stimata misurando la quantità di [8-14C] IMP prodotto a partire dalla [8-14C] inosina al passare del tempo.
La miscela di reazione contiene 5mM ATP, 20 mM MgCl2, 2 mM IMP, 1mM DTT, 100
mM Tris-HCl pH 7.4, 1.4 mM [8-14C] Ino (3500 dpm/nmol); quando si vuole dare inizio alla reazione (tempo 0’) si aggiunge una quantità sufficiente di enzima (in genere circa 5 o 10 ng), in modo che il volume finale sia 50 µl. Dalle miscele incubate a 37 °C si prelevano ai tempi 0’, 10’, 20’ e 30’aliquote di 10 µl e si depositano su deschetti di carta a scambio ionico DE-81 carichi positivamente e quindi in grado di legare, mediante forze ioniche, l’IMP prodotto carico negativamente. I dischetti vengono sottoposti a tre lavaggi: il primo della durata di 15 minuti in ammonio formiato 1 mM, gli altri due di 10 minuti ciascuno in acqua deionizzata. Dopo essere stati asciugati, questi dischetti vengono depositati in apposite fiale con 8 ml di liquido di scintillazione Hi safe II e inseriti nello scintillatore per stimare l’emissione di radioattività [Tozzi et al., 1991].
Per calcolare la Km per l’inosina sono state preparate otto diverse miscele di reazione
contenenti le stesse concentrazioni di ATP, MgCl2, IMP, DTT e TRIS-HCl descritte sopra
e le stesse quantità di enzima, ma ad ogni miscela viene aggiunta una quantità di [8-14C] inosina diversa, in modo che le concentrazioni finali siano crescenti e comprese nell’intervallo in cui si trova la Km. Per stimare la K50 per l’ATP e per il Mg2+ si utilizza la
stessa procedura descritta sopra, ma in questi casi si fa variare l’ATP o il MgCl2 a seconda
del parametro da misurare.
2.2.7 DOSAGGIO DELL’ATTIVITA′ 5’-NUCLEOTIDASICA
L’attività 5’-nucleotidasica viene stimata misurando la quantità di [8-14C] inosina prodotta a partire dal [8-14C] IMP al passare del tempo. La miscela di reazione contiene 5mM ATP, 20 mM MgCl2, 1.4 mM inosina, 1mM DTT, 100 mM Tris-HCl pH 7.4, 2 mM
[8-14C] IMP (4300 dpm/mol); quando si vuole far partire la reazione (tempo 0’) si aggiunge una quantità sufficiente di enzima in modo che la miscela completa abbia un volume finale di 50 µl. La miscela viene incubata a 37 °C e ai tempi 0’, 10’, 20’ e 30’ si prelevano aliquote di 10 µl che vengono deposte su una lastra per cromatografia su strato sottile di polietileneimmina cellulosa (PEI-cellulosa) in corrispondenza di punti già stabiliti su cui sono state precedentemente deposte 30 nmoli di inosina fredda (non marcata) usata
come standard interno. Alla fine le lastre vengono collocate verticalmente su un sottile strato di H2O milliQ in modo che l’IMP marcato, non utilizzato dall’enzima, e l’inosina
possano separarsi. Quando il fronte di migrazione del solvente ha percorso la lastra, questa viene asciugata e con l’utilizzo di una lampada ad UV vengono individuate le macchie corrispondenti all’inosina, ritagliate ed inserite in fiale con 8 ml di liquido di scintillazione Hi safe II affinché l’emissione di radioattività possa essere letta dallo scintillatore.
Per stimare la Km per l’IMP si preparano otto diverse miscele di reazione con
concentrazioni crescenti di IMP marcato, comprese nell’intervallo che include il valore della costante.
2.2.8 DOSAGGIO COLORIMETRICO DEL FOSFATO LIBERO CON IL METODO DI CHIFFLET
La velocità dell’effettiva fosforolisi dell’IMP può essere monitorata con il metodo di Chifflet, un dosaggio colorimetrico usato per misurare il fosfato inorganico presente in soluzione [Chifflet et al., 1988]. Per eseguire questo saggio sono state utilizzate quattro soluzioni:
Soluzione A: 12% SDS
Soluzione B: 6% acido ascorbico in 1 M HCl (questa soluzione deve essere preparata al momento dell’uso)
Soluzione C: 1% Ammonio molibdato
Soluzione E: 2% Sodio citrato, 2% sodio metaarsenito, 2% acido acetico
L’enzima viene incubato a 37 °C in una miscela di reazione contenente 5mM ATP, 20 mM MgCl2, 2 mM IMP, 1mM DTT, 100 mM Tris-HCl pH 7.4 e in presenza e in assenza di 1.4
mM inosina in un volume totale di 330 µl. Ai tempi 0’, 10’, 20’ e 30’ si prelevano aliquote di 50 µl della miscela e la reazione viene bloccata con la rapida aggiunta di 50 µl di soluzione A. I campioni vengono agitati con il vortex e alla fine dei tempi di reazione vengono aggiunti 100 µl della miscela delle soluzioni B e C (1:1), in modo che il Pi possa
complessarsi con l’ammonio molibdato. Trascorsi 6 minuti si aggiungono anche 150 µl della soluzione E per rimuovere l’eccesso di ammonio molibdato e, dopo una incubazione di 10 minuti a 37 °C e di 5 minuti a temperatura ambiente, si legge l’assorbanza alla lunghezza d’onda di 850 nm.
Grazie ad una curva di taratura, precedentemente costruita adoperando miscele con concentrazioni crescenti e conosciute di fosfato inorganico (il bianco è rappresentato da una miscela senza Pi), è possibile calcolare per interpolazione la quantità di fosfato liberato
dall’enzima.
2.2.9 ANALISI SPETTROFLUORIMETRICHE
Lo spettrofluorimetro Jasco FP-6500 è stato utilizzato per valutare l’effetto stabilizzante del catione bivalente Mg2+ sull’enzima ricombinante wild-type e sugli enzimi mutati. I campioni delle proteine utilizzati per questo saggio devono essere precedentemente dializzati per ridurre la concentrazione di imidazolo presente in soluzione. A questo scopo sono state utilizzati gli Amicon Ultra Centrifugal Filter Devices e la soluzione tampone Tris 50 mM + 0.1 M NaCl pH 7.4.
0.02 mg/ml di proteina ricombinante dializzata è stata incubata con una soluzione tampone, precedentemente filtrata, di Tris 50 mM + 0.1 M NaCl pH 7.4 in assenza e in presenza di 20 mM MgCl2. A diversi intervalli di tempo (tra 0 e 270 minuti) il triptofano,
una sonda naturale interna della proteina, viene eccitato a 295 nm per registrare il suo spettro di emissione, che presenta un massimo intorno a 335-340 nm; questo segnale è stato considerato un importante strumento per lo studio della struttura delle proteine e dei loro comportamenti dinamici. La fluorescenza del triptofano è però influenzata dall’acqua, che è in grado di schermare il suo segnale; di conseguenza una riduzione dell’emissione del segnale indicherà la denaturazione della proteina, perché in questo caso il triptofano si troverà esposto ad un ambiente acquoso [Ladokhin, 2000].
Un incremento del segnale di fluorescenza o uno spostamento del picco di massima intensità verso gli UV può essere considerato un segnale di aggregazione e stabilizzazione proteica, mentre una riduzione dell’intensità del picco e un suo spostamento verso il rosso possono indicare una denaturazione proteica.
