ethyl]phenylacetamide). This novel agent exhibits a ~25-fold higher affinity for the human (h) dopamine D 3 than for the hD 2L (long isoform) and hD 2S

ABSTRACT

G-protein-coupled-receptors (GPCRs) constitute the most common signal transduction system in the animal kingdom, representing the major target for many pharmaceutical compounds. The existence of GPC receptors undergoing homo- and/or hetero-dimerization has been widely demonstrated in recent years. This finding raises the fascinating possibility that the signal transduction system might have evolved by exploring different receptor combination. This in turn has stimulated the search for new therapeutic drugs.

Dopaminergic receptors are members of the GPCRs family, classified as D 1 -like and D 2 -like families, that can interact with each other to combine the pharmacological and functional properties of wild-type receptors. The importance of the dopaminergic system is testified by the Parkinson’s disease which is caused by degeneration of dopaminergic neurons in area A9 of the mesencephalon. Alterations of the dopaminergic system can also lead to such neuropsychiatric illness as psychosis and drug addition. Both of these pathologies can in fact, be cured pharmacological agents interacting with the D 2 -like receptor subfamily such as D 2 and D 3 receptors.

In this work I have studied several pharmacological characteristics of the novel, potentially antipsychotic, drug S33138 (N-[4-[2-[(3aS,9bR)-8- cyano-1,3a,4,9b-tetrahydro[1]benzopyrano[3,4-c]pyrrol-2(3H)-yl)-

ethyl]phenylacetamide). This novel agent exhibits a ~25-fold higher affinity for the human (h) dopamine D 3 than for the hD 2L (long isoform) and hD 2S

(short isoform) receptors: pK i values, 8.7, 7.1 and 7.3, respectively. Other

clinically-available anti-psychotics such as haloperidol, clozapine,

olanzapine, risperidone displayed similar affinities for both, the hD 3 and

hD 2 receptor subtypes. Binding experiments with S33138 were carried out

on a CHO cell line trasfected with each of the these dopaminergic

receptors. In guanosine-5’-O-(3-[ ³⁵ S]thio)-triphosphate ([ ³⁵ S]GTP S)

filtration assay with hD 3 receptors, S33138 exhibits powerful and

(Schild) values of 8.9 and 8.7, respectively. Higher concentrations were required to block hD 2L and hD 2S receptors. The preferential antagonist properties of S33138 with hD 3 versus hD 2L receptors were further demonstrated in studies of extracellular-regulated-kinase phosphorylation.

In cells co-transfected with hD 3 and hD 2L receptors under conditions that assemble as heterodimers, S33138 blocks (pK B , 8.5) the inhibitory influence of quinpirole upon forskolin-stimulated cAMP formation. S33138 had low affinity for hD 4 receptors (<5.0).

In conclusion, the drug S33138 possesses a distinctive receptor- binding profile and, unlike the clinically-available anti-psychotics at the present, behaves as a preferential antagonist for hD 3 as respect to hD 2

receptors.

RIASSUNTO

I recettori accoppiati alle proteine G (G-protein-coupled receptors o GPCRs) rappresentano il sistema di trasduzione del segnale più diffuso nel regno animale e costituiscono uno dei maggiori bersagli in campo farmacologico. Numerosi studi hanno dimostrato l’esistenza di recettori in forma omodimerica e eterodimerica, proponendo affascinanti possibilità combinatoriali nel sistema di trasduzione del segnale e fornendo un nuovo punto di partenza per la ricerca di sostanze terapeutiche. I recettori dopaminergici appartengono alla famiglia dei GPCRs, sono classificati in due famiglie, D 1 -like e D 2 -like e sono in grado di interagire tra loro formando recettori eterodimerici che combinano le caratteristiche farmacologiche e funzionali dei recettori di origine.

Alterazione a carico del sistema dopaminergico sono evidenti nel morbo di Parkinson dove la degenerazione dei neuroni dopaminergici presenti nell’area A9 del mesencefalo (nigra pars compacta) rappresenta la causa principale della malattia. Un mal funzionamento di questo stesso sistema è inoltre osservabile nelle psicosi e nei disordini mentali legati all’abuso di sostanze ed è per questo che i recettori dopaminergici rappresentano un bersaglio importante per la terapia farmacologia di queste patologie. Molti agenti farmacologici, usati nel trattamento della schizofrenia interagiscono in particolare con i recettori dopaminergici D 2 e D 3 appartenti alla famiglia D 2 -like.

Nella mia tesi ho studiato le caratteristiche farmacologiche del nuovo potenziale agente antipsicotico S33138 (N-[4-[2-[(3aS,9bR)-8-ciano-1, 3a, 4, 9b-tetraidro [1] benzopirano [3,4-c] pirrol-2 (3H) -yl) -etil]

fenilacetamide). Questo composto di nuova sintesi presenta un’affinità di

circa 25 volte maggiore per i recettori dopaminergici umani (h) D 3 rispetto

ai recettori D 2L h (isoforma lunga) e D 2S h (isoforma corta) con valori di pKi

di 8,7, 7,1 e 7,3 rispettivamente.

risperidone mostrano invece affinità simili verso questi stessi recettori. La prova di binding con [ ³⁵ S]GTP S ha rivelato come l’S33138 si comporti come antagonista potente e competitivo verso i recettori dopaminergici D 3 h transfettati in cellule CHO (Chinese Hamster Ovary), mostrando valori di pK B e pA 2 (calcolati con il plot di Schild) rispettivamente di 8.9 e 8.7.

L’attività antagonista sui recettori D 2L h e D 2S h è osservabile invece solo attraverso l’uso di concentrazioni più alte del composto. Queste proprietà antagoniste preferenziali di S33138 sui recettori D 3 h rispetto ai D 2L h sono state messe in evidenza anche tramite lo studio della fosforilazione di diversi substrati. Studi funzionali sono stati in seguito eseguiti su cellule CHO co-transfettate con recettori D 3 h e D 2L h i quali, come ormai noto da tempo, sono in grado di formare eterodimeri. In queste cellule, l’S33138 blocca (pK B 8.5) l’azione inibitoria dell’agonista quinpirolo sulla formazione di cAMP stimolato da forskolina. Il composto S33138 è caratterizzato invece da una bassa affinità per i sottotipi recettoriali dopaminergici D 4 h (<5).

Concludendo, S33138 presenta un distinto profilo di binding sui

diversi recettori dopaminergici testati e si comporta, contrariamente agli

antipsicotici clinicamente disponibili, come un antagonista preferenziale

dei recettori D 3 h rispetto ai D 2 h.

SCOPO DELLA TESI

Nella mia tesi ho valutato l’attività di un nuovo potenziale agente antipsicotico, l’antagonista recettoriale dopaminergico S33138 sintetizzato dall’Istituto di ricerca Servier (Parigi, Francia).

Utilizzando diverse tecniche quali il binding recettoriale, saggi funzionali e grado di fosforilazione delle MAP-chinasi, ho studiato il profilo farmacologico del composto S33138 in cellule CHO stabilmente transfettate e in cellule COS-7 transfettate soltanto transientemente con diversi recettori dopaminergici.