Materiali e metodi

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2.1 Colture cellulari

Le cellule staminali embrionali murine della linea E14Tg2A (a passaggio 25-34) sono state coltivate su piastre petri rivestite di gelatina (mediante incubazione a 37◦ per 5’ con una soluzione di gelatina allo 0.1%) ad una densit`a di 40’000 cells/cm2 _{in ambiente termostatato a 37}◦_{, con pressione di anidride carbonica}

pCO2 di 5.5%. Il mezzo di coltura privo di siero `e stato cambiato ogni giorno per

evitarne la rapida acidificazione ed era composto a partire dal Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) come indicato in Tabella 2.1.

Le cellule sono state splittate utilizzando la dissociazione con tripsina e ripiastrate ad una diluizione di 1:3/1:4, per evitare la confluenza e mantenerne la pluripoten-za. Questo procedimento si compie lavando il monostrato cellulare con Versene e lasciando agire la tripsina per 5-6 minuti a 37◦C; quindi dopo l’inattivazione dell’enzima con siero fetale bovino (FCS) le cellule ES vengono trasferite in una falcon e dissociate gentilmente per spipettamento. Vengono infine centrifuga-te ad una velocit`a di 1’000 RPM (6’-7’) per produrre un pellet che pu`o essere risospeso in ES medium fresco per la semina in piastra.

Nel mezzo “2i+LIF ” le cellule ES vengono mantenute in uno stato pluripotente ed indifferenziato mediante aggiunta dell’inibitore della via MAPK PD0325901 (1μM, Santa Cruz Biotecnology), dell’inibitore della GSK3β CHIR99021 (3μM,

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Santa Cruz Biotecnology) e del LIF ricombinante (1000 U/mL, GIBCO R_{), come}

descritto in Ying e collaboratori (2008).

Sostanza Conc. Fin.

Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) q.b.

Glutammina 2 mM

Sodio Piruvato 1 mM

Amminoacidi Non Essenziali (NEAA) 1 mM

β-mercaptoetanolo 0.05 mM

Penicillina/Streptomicina 100 U/mL

LIF ricombinante 1000 U/mL

PD0325901 1μM

CHIR99021 3μM

Tabella 2.1: Composizione del mezzo di coltura 2i + LIF (ES medium)

2.2 Induzione neurale in vitro

La neurogenesi `e stata ottenuta mediante la cultura delle ESC in un mezzo minimo chimicamente definito (N2B27) composto da DMEM/F12 contenente i

supplementi N2 e B27 (InvitrogenTM_{) come surrogati del siero (Tabella 2.2).}

Sostanza Conc. Fin.

DMEM/F12 q.b.

Glutammina 2 mM

Sodio Piruvato 1 mM

Amminoacidi Non Essenziali (NEAA) 0.1 mM

N2 1X

B27∗ 1X

∗_{privo di vitamina A}

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I due supplementi non contengono ne fattori di crescita n´e sostanze che interfe-riscono direttamente con vie di attivazione di fattori di crescita, con l’eccezione dell’insulina, che viene utilizzata come inibitore di apoptosi.

Il protocollo di differenziamento prevede una procedura di cultura in tre passaggi cos`ı strutturata:

1o Step : Le ESC dissociate sono lavate con DMEM/F12 per rimuovere eventuali tracce di siero e vengono seminate in piastre di coltura rivestite di gela-tina (55’000 cells/cm2); le ES in questo modo formano degli agglomerati cellulari che vengono fatti crescere in 2i+LIF medium per 24h, il secondo giorno viene cambiato il mezzo e le cellule sono tenute in N2B27 per le

successive 72h.

2o _{Step : Gli aggregati sono dissociati con la tripsina e le cellule vengono}

semina-te ad una densit`a di 75’000 per cm2 sulla superficie di una piastra petri precedentemente trattata con poliornitina (Sigma-Aldrich R _{; 20 μg/mL in}

acqua sterile, 37◦C o/n) e laminina di topo (InvitrogenTM; 5 μg/mL in PBS, 37◦C o/n). Le cellule sono coltivate in queste condizioni per 96h, cambiando quotidianamente il mezzo.

3o Step : Dopo un secondo passaggio di dissociazione le cellule sono seminate in piastre trattate con poliornitina e laminina ad una densit`a di 75’000 per cm2 e sono mantenute altre 96h in N2B27; durante questo passaggio

iniziano a comparire cellule con una morfologia neuronale.

4o _{Step : Al termine del terzo passaggio, le cellule vengono dissociate e seminate}

ad una densit`a di 125’000 per cm2 in piastre rivestite di poliornitina/-laminina, vengono coltivate in Neurobasal R _{Medium (Invitrogen}TM_{), un}

mezzo dall’osmolarit`a adatta a neuroni in maturazione, a basso tenore di glutammato per evitarne gli effetti di eccitotossicit`a sui neuroni e privo di

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supplemento N2, per rallentare il metabolismo e guidare le cellule verso il differenziamento terminale a neuroni (Tabella 2.3).

Sostanza Conc. Fin.

Neurobasal q.b.

Glutammina 2 mM

Sodio Piruvato 1 mM

Amminoacidi Non Essenziali (NEAA) 0.1 mM

B27∗ 1X

∗_{privo di vitamina A}

Tabella 2.3: Composizione del mezzo di coltura Neurobasal B27

Ad ogni dissociazione del protocollo il siero utilizzato per inattivare la tripsi-na viene accuratamente rimosso dalle cellule mediante lavaggio in DMEM/F12. Durante i vari esperimenti sono stati testati gli effetti dei seguenti fattori ag-giungendoli al mezzo di coltura durante il secondo, il terzo od il quarto step del protocollo: PD0173074 (Merck Millipore R _{, 1μM), IWR-1-ENDO (Merck}

Millipore R _{, 10μM), FGF8 ricombinante (R& D Systems} R _{, 25 ng/μL). Quando}

i fattori erano stati risospesi in dimetilsulfossido (DMSO), una quantit`a identica del diluente `e stata aggiunta nel CDMM per il controllo negativo dell’esperimento. In ogni caso la concentrazione di DMSO non ha mai superato lo 0.1%.

2.3 Estrazione dell’RNA

Per ottenere dati rappresentativi che tenessero conto dell’inevitabile variabilità presente nelle condizioni di coltura (densità di semina, mortalità, adesione al substrato), ogni esperimento ha incluso 2-4 repliche per ciascuna tesi (pozzetti diversi delle piastre di coltura), che sono state raggruppate prima dell’estrazione dell’RNA. Le cellule sono state raccolte mediante dissociazione con tripsina e

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lavate in PBS (Phosphate Buffered Saline). L’RNA totale `e stato isolato utiliz-zando il kit commerciale NucleoSpin R _{RNA II (Macherey-Nagel) che si avvale di}

colonnine in resina centrifugabili per legare specificamente gli acidi ribonucleici. Il protocollo standard prevede uno step iniziale di lisi delle cellule mediante un buffer a base di detergenti anionici e di denaturanti quali il cloruro di guanidinio ed il β-mercaptoetanolo.

L’RNA presente nel lisato viene precipitato in etanolo al 70%, rimane legato alla resina funzionalizzata della colonnina e subisce pi`u lavaggi in tamponi de-salinizzanti, che terminano nell’eluizione di RNA puro in H2 milliQ. La

proce-dura comprende una fase intermedia di trattamento con DNasi per evitare la contaminazione da parte di DNA genomico.

L’RNA isolato `e stato controllato mediante spettrofotometro NanoVue R _(GE

Healthcare) per determinarne il livello di purezza e la concentrazione. Gene-ralmente, partendo da 106 cellule, si ottengono 20-50 μg di RNA, di qualit`a mediamente alta (rapporto di assorbanza A260

A280 ≥ 1.9).

2.4 Retrotrascrizione

Per ogni campione, sono stati retrotrascritti 500 ng di RNA totale utilizzando il kit di trascrizione inversa Reverse Transcriptase Core Kit (Eurogentec). La mix di retrotrascrizione era composta come indicato in Tabella 2.4. In essa `e presente tutto quello che occorre per la sintesi del DNA stampo, ovvero la trascrittasi inversa, i dNTPs e il magnesio cloruro. L’enzima si serve di olignucleotidi di 9 basi a sequenza casuale, che utilizza come inneschi. E’ inoltre presente un inibitore delle RNAsi, dal momento che la presenza indesiderata di questi contaminanti ambientali potrebbe danneggiare il template nel corso della reazione.

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Sostanza Stock Conc. Fin.

Reaction Buffer 10X 1X

MgCl2 25 mM 0.5 µL

dNTPs 2.5 mM 500 µM per dNTP

Nonamero random 50 µM 2.5 µM

RNAse Inhibitor 20 U/µL 0.4 U/µL

Euroscript RT 50 U/µL 1.25 U/µL

H2O milliQ -

-RNA stampo - 500ng

Tabella 2.4: Composizione della mix di retrotrascrizione

I parametri termici operativi del kit richiedono uno step iniziale a 25◦C per 10’, la retrotrascrizione vera e propria avviene a 48◦C per 30’ e la reazione si conclude con uno step di inattivazione a 95◦C per 5’.

2.5 Progettazione dei primers di PCR

Per la quantificazione dei livelli di mRNA sono stati progettati diversi primers per l’innesco della reazione di Polymerase Chain Reaction (PCR). Il software Primer-BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi) `e risultato un valido strumento per lo scopo. L’interfaccia Web consente di disegnare gli oligonucleotidi mediante Primer3 (Rozen et al., 2000) ed al contempo `e in grado di predire tramite BLAST (Altschul et al., 1990) tutti i possibili siti d’appaia-mento su targets indesiderati. Come parametri per la progettazione sono stati utilizzati i seguenti valori:

• Lunghezza ottimale dei primers: 20 bp (range 18 - 27 bp) • La coppia di primer doveva se possibile attraversare un introne • Temperatura di melt (Tm) ottimale: 60◦C (range 57◦ - 63◦C)

• Lunghezza dell’amplicone: tra 70 e 200 bp

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• Libreria degli elementi ripetitivi per il mispriming : Roditore

• Massima complementarit`a degli omodimeri e della regione 3’: 2 (da 3 a 5 se il parametro risultava troppo stringente)

Gli altri parametri sono stati lasciati come da default.

La lista completa dei primers utilizzati per la caratterizzazione molecolare `e pre-sentata in Tabella 2.5, in cui sono mostrate le sequenze senso ed antisenso.

Nome Primer Forward Primer Reverse

β-Actina AATCGTGCGTGACATCAAAG AAGGAAGGCTGGAAAAGAGC

β-Tub III TTCTGGTGGACTTGGAACCT ACTCTTTCCGCACGACATCT

C-fos ACAGCCATCTCCACCAGCCCA TGCTCTACTTTGCCCCTTCTGCC

COUP-TF1 TGCTTGTGGCCTTGCGGATG AGTTGCTCGATGACAGAGGAG

Ctip2 GCCGACCCTGATCTACTCAC CTCCTGCTTGGGACAGATGC

Egr1z AAAGGGAGAGGCAGGAAAGAC AGGCAGGGATGGTAAGTGAAA

Emx2 GGCTAGAGCACGCTTTTGAG CACCGGTTAATGTGGTGTGT

En1 AGTGGCGGTGGTAGTGGA CCTTCTCGTTCTTTTTCTTCTTT

FoxG1 CGACCCTGCCCTGTGAGT GGAAGAAGACCCCTGATTTTG

Nestin TGTCCCTTAGTCTGGAAGTGG GGGGAAGAGAAGGATGTTGG

Nkx2.1 CAATGAGGCTGACGCCCCCG GAAGTGGGTTTCCTGTCTGAGCG

Oct3/4 TCAGCTTGGGCTAGAGAAGG GGCAGAGGAAAGGATACAGC

Otx2 CCACTTCGGGTATGGACTTG GGTCTTGGCAAACAGAGCTT

Pax6 CCTCCTTCACATCAGGTTCC CATAACTCCGCCCATTCACT

Tbr1 CGCCCTCCTCCATCAAATCCATCG GCAGTTCTTCTCGCAGTCCCGC

SatB2 CATGAGCCCTGGTCTTCTCT AACTGCTCTGGGAATGGGTG

Spry2 TCCAATGACGATGAGGACAA CACCCCTGGCACAATTTAAG

Tbr1 CGCCCTCCTCCATCAAATCCATCG GCAGTTCTTCTCGCAGTCCCGC

Tabella 2.5: Sequenze dei primers d’amplificazione

2.6 RT-PCR semiquantitativa

Il cDNA retrotrascritto `e stato quantificato per Real-time PCR su Rotor-Gene R

6000 (Corbett). La PCR `e stata effettuata utilizzando protocolli standard, che prevedono l’utilizzo della miscela di reazione e del profilo termico indicati in Tabella 2.6 e 2.7.

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Sostanza Conc. Vol

GoTaq qPCR Master Mix 2X 10.0 µL

Primer forward 5 µM 0.5 µL

Primer reverse 5 µM 0.5 µL

cDNA stampo 0.5 ng/µL 8.0 µL

H2O milliQ - 1.0 µL

TOTALE - 20.0 µL

Tabella 2.6: Composizione della mix di PCR

Step T Tempo

Denaturazione 95◦C 15”

Annealing 58◦C 25”

Estensione 72◦C 20”

Per un totale di 40 cicli

Tabella 2.7: Ciclo termico della PCR

La GoTaq R _{qPCR Master Mix (Promega) `}_{e una miscela pronta all’uso}

conte-nente al suo interno tutto ci`o di cui la reazione di PCR Real time necessita (ad eccezione dei primer e del DNA stampo): sono presenti cio`e un buffer di reazione, i dNTPs, la DNA-polimerasi, il MgCl2 e l’intercalante fluorescente Sybr Green,

che consente di monitorare in tempo reale la polimerizzazione misurando i livelli di fluorescenza registrati. La reazione prevede un’attivazione hot start per una maggiore accuratezza (3’ a 95◦C).

I valori di takoff dell’amplificazione sono stati ricavati utilizzando la funzione di Rotor-Gene relative quantitation analysis, e abbiamo calcolato l’espressione relativa secondo la relazione

Rel.Exp = 2−∆∆CT

dove il ∆∆CT = (C_Ttg− CThk) `e calcolato normalizzando i livelli del gene di

inte-resse (C_Ttg) con quelli del gene housekeeping β-Actina (Chk

T ). Gli errori standard

dell’espressione relativa indicati nelle figure della sezione Risultati sono stati ot-tenuti dalla seguente formula di propagazione degli errori (Nordg ˙ard et al. 2006):

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Err.Std = ln2 q V ar(C_Ttg) + V ar(Chk T ) − Cov(C tg T ; CThk)

La significativit`a statistica delle differenze di espressione genica `e stata saggiata, laddove necessario, con un test di randomizzazione, sfruttando il software REST (Pfaffl et al., 2002).

2.7 Immunocitochimica

Le cellule per gli esperimenti d’immunocitochimica sono state coltivate su vetrini coprioggetto rotondi (Thermo Scientific) pretrattati con un lavaggio in etanolo e HCl (1:1) e incubati in poliornitina/laminina come descritto precedentemente. Le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 2% per 15 minuti, lavate due volte in PBS, permeabilizzate utilizzando Triton X100 allo 0.1% in PBS e incubate in una blocking solution di BSA 0.5% in PBS per 1h.

Le cellule sono state incubate negli anticorpi primari per 2h a temperatura ambiente, quindi sono state sottoposte a 3 lavaggi in PBS (10’ ciascuno). Come anticorpi secondari abbiamo utilizzato dei monoclonali anti-IgG di topo o di coniglio coniugati all’Alexa Fluor 488 o l’Alexa Fluor 568 (Molecular Probes).

Anticorpo Titolo Produzione

Coup-TF1 1:1500 Gentile dono di Mich`ele Studer

Ctip2 1:100 Abcam

Anti-GFP 1:1000 Invitrogen

Neurnonal class III β-tubulin 1:1000 Covance

Nestin 1:200 Millipore

N-tubulina acetilata 1:1000 Sigma

SatB2 1:400 Abcam

Tbr1 1:400 Millipore

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Le cellule sono state incubate 1 ora a temperatura ambiente nella soluzione di PBS contenente gli anticorpi secondari e l’Hoechst 33258 per la colorazione nucleare (1:500), Triton X100 allo 0.1% e BSA 0.5%. Il protocollo `e leggermente diverso per Tbr1 e FoxG1, i cui anticorpi sono stati incubati overnight a 4◦C con 0.3% di Triton X100. In ogni caso la procedura termina con tre lavaggi in PBS da 10’ ciascuno e con il montaggio dei vetrini tondi con le cellule in adesione su vetrini portaoggetto grazie ad una goccia di Aqua-Poly/Mount (Polysciences) che solidifica dopo asciugatura overnight a temperatura ambiente. In Tabella 2.8, sono elencati gli anticorpi primari utilizzati.

2.8 Microscopia ed analisi delle immagini

Le immagini sono state acquisite con un microscopio confocale a scansione laser (DM IRE2, Leica), che ha permesso di ottenere stack di sezioni ottiche ad in-tervalli di 0.5 - 1µm di profondit`a. I vari piani bidimensionali sono stati proiettati lungo l’asse z in un unico livello secondo la massima intensit`a dei pixel utilizzan-do il software ImageJ (Abramoff et al., 2004): in questo moutilizzan-do si produce una singola immagine che ricrea grossomodo l’aspetto tridimensionale dell’oggetto visto da un punto esterno alla sua superficie.

Per la microscopia ottica abbiamo acquisito immagini digitali utilizzando un mi-croscopio ad epifluorescenza (Nikon Eclipse E600) dotato di una camera CCD raffreddata da 1.3 megapixel (Photometrics CoolSNAPTM_cf).

Per il conteggio delle cellule sono state acquisite immagini casuali da 2-3 esperi-menti indipendenti per eseguire una conta in doppio cieco. Per ogni trattamento o marcatore abbiamo contato dalle 1000 alle 5000 cellule e la significativit`a sta-tistica delle differenze rilevate `e stata saggiata mediante test di Student (t) a due code.

(11)

2.9 Estrazione e quantificazione proteica

Gli estratti proteici grezzi sono stati ottenuti da pellet di 106 _{cellule. Al pellet}

di cellule vengono aggiunti 45μL di RIPA buffer (Tabella 2.9) addizionato con 5μL PMSF (1mM, Thermo Scientific), 25μL cocktail di inibitori delle proteasi (Roche) e 5μL NP40 (Sigma-Aldrich R _{); successivamente il pellet viene lasciato}

30 minuti in incubazione in ghiaccio prima di essere sonicato. Al termine della sonicazione (10” on/30” off per 3 volte), l’estratto grezzo viene centrifugato a 13’000 rpm per 10 minuti in una centrifuga refrigerata ed il surnatante viene trasferito in una nuova eppendorf.

La quantificazione della proteina totale `e stata successivamente effettuata me-diante Micro BCATM_{Protein Assay Kit (Thermo Scientific) secondo le istruzioni}

del kit. Le misure di assorbanza a 562nm sono state confrontate con rette di ta-ratura fatte a concentrazioni note di BSA (Figura 2.1), ottenendo da 106 cellule concentrazioni di circa 2-4 μg/μl di proteina.

Figura 2.1: Retta di regressione del kit MicroBCATM

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Sostanza Concentrazione Volume Tris-HCl (pH 7.4/8) 1M 0,5 mL DOC 5 % w/v 1050 μL NaCl 0,5 M 3 mL EDTA (pH 8) 0,5 M 20 μL SDS 10 % 1 mL dH2O - 3,7 mL

Tabella 2.9: Composizione RIPA Buffer

2.10 Western Blot

Per la quantificazione dei livelli di COUP-TF1, gli estratti proteici totali sono stati denaturati in sample buffer (LDS Sample Buffer, Thermo Scientific) ed incubati a 99◦C per 10 minuti. Successivamente 10 μg di proteina totale sono stati sottoposti ad SDS-page su gel al 10% e le proteine separate sono state trasferite su membrane di nitrocellulosa (HybondTM_{-c Extra, GE Healthcare)}

mediante trasferimento overnight a 150 mA. Le membrane, bloccate con latte in polvere ricostituito in TBST (50 mM Tris; 150 mM NaCl; 0.05% Tween 20 a pH7,6) al 5% per 1h, sono state incubate con l’anticorpo primario per 1,5h e con l’anticorpo secondario per 1h. Tre lavaggi di 15 minuti con TBST sono stati effettuati al termine di ogni incubazione.

Un elenco degli anticorpi utilizzati è presente in Tabella 2.10. L’anticorpo secon-dario utilizzato è coniugato alla Perossidasi di Rafano (HRP) ed è stato rivelato utilizzando il kit di chemiluminescenza (ImmobilonTM _{Western, Millipore).}

L’ac-quisizione dell’immagine del Western Blot `e stata effettuata mediante esposizione di lastra fotografica BioMax XAR Film (Kodak Film).

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Anticorpo Titolo Produzione

COUP-TF1 1:10000 Gentile dono di Mich`ele Studer

αTubolina 1:10000 Sigma

GAM-HRP 1:2000 Santa Cruz Biotecnology GAR-HRP 1:2000 Santa Cruz Biotecnology

Tabella 2.10: Anticorpi Western Blot

2.11 Citometria di flusso

Le cellule in adesione sono state dissociate mediante tripsinizzazione, lavate e risospese in PBS ed acquisite mediante un citoflorimetro FACSCalibur (BD). Per ciascun campione sono stati analizzati almeno 15000 eventi contati dopo aver escluso i detriti cellulari con gating virtuale dei parametri fisici (FSC/SSC). I dati sono stati analizzati mediante il software CellQuest (BD).

2.12 Analisi funzionale nei neuroni in coltura

Abbiamo utilizzato il colorante Ca2+-sensibile Fluo4-AM (Molecular ProbesTM) per analizzare i livelli intracellulari di calcio in neuroni in coltura e valutare cos`ı la loro attivit`a spontanea ed indotta dal trattamento con glutammato e KCl. Il Fluo4 possiede un picco di emissione a 516nm, e quando legato al Ca2+ _{ha un}

incremento di intensit`a di fluorescenza di circa 100 volte senza apprezzabili shift spettrali. Inoltre, questo colorante presenta un gruppo neutro acetossimetilico (AM) che impedisce alla molecola di fluorescere e ne incrementa l’internaliz-zazione. Nel citoplasma, il gruppo AM viene rimosso dalle esterasi cellulari , rendendo il Fluo4 prono ad emettere e impedendogli di retro-diffondere attra-verso la membrana cellulare. 50μg di Fluo4-AM sono stato risospesi in 44μL di DMSO; successivamente a 22μL del colorante ricostituito sono stati addizionati

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4,5 μL del surfattante Pluronic R _{F-127 (Sigma-Aldrich) per migliorare}

l’assorbi-mento da parte delle cellule. Infine, 25μL della working solution cos`ı ottenuta sono stati addizionati a 7,15mL di Neurobasal. Neuroni a diciotto giorni di ma-turazione coltivati in piastre WillCo (WillCo Wells B.V.) con il fondo di vetro sono stati lavati con il Neurobasal ed incubati con la soluzione di Fluo-4AM per 60’ a 37◦C e 5% CO2. Al termine dell’incubazione, il colorante in eccesso `e stato

eliminato con un ulteriore lavaggio in Neurobasal.

L’acquisizione del segnale del Fluo4 `e stata effettuata in camera termostatata mediante microscopia confocale in time-lapse ad una frequenza d’acquisizione di 5Hz.

La stimolazione dei neuroni KCl o Glutammato `e stata effettuata con buffer di eccitazione realizzati aggiungendo 22,3μL KCl (2M) e 50μL Glutammato (2M) ad 1mL Neurobasal, cos`ı da ottenere una concentrazione totale di 50mM per il KCl e di 100mM per il glutammato.

L’andamento della fluorescenza nel tempo `e stato analizzato a partire da stack temporali di immagini con la funzione “Plot Z-axis Profile” di ImageJ, applicata a sezioni trasversali di processi assonali di neuroni, ed `e stata mediata tra rilevazioni provenienti da neuroni diversi.

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2.13 Costruzione vettore lentivirale contenente

la sequenza 3’UTR di COUP-TF1

Per verificare l’esistenza d’una possibile regolazione post-trascrizionale a carico di COUP-TF1, abbiamo inserito la sequenze 3’UTR di COUP-TF1 all’interno del vettore lentivirale d’espressione pWPXLd (Addgene, 12258; Figura 2.3). Il plasmide pWPXLd presenta le sequenze lentivirali LTR e psi, che ne consentono l’impacchettamento nel vettore lentivirale, il gene per la resistenza alla ampi-cillina (AmpR) ed una EGFP, come gene reporter, posta sotto il controllo del promotore costitutivo EF1α. A valle della sequenza della EGFP `e presente una sequenza WPRE, stabilizzante il trascritto. Innanzitutto, utilizzando il Genome Browser (genome-euro.ucsc.edu), abbiamo identificato la sequenza al 3’UTR di COUP-TF1. In particolare, il clone X74134 (Jonk et al., 1994) presente in Gen-Bank mostra una 3’UTR di COUP-TF1 di 748bp, comprendente una regione

Figura 2.2: Genome Browser: 3’UTR di COUP-TF1

L’immagine mostra la regione 3’UTR di COUP-TF1 osservata al Genome Browser (rosso) e la sequenza conservata di circa 480bp inclusa in alcuni cloni di mRNA di

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Figura 2.3: Vettore lentivirale d’espressione pWPXLd

Il promotore EF1α controlla l’espressione della EGFP. A valle della CDS del gene reporter, nella 3’UTR del trascritto, `e presente la sequenza WPRE, un elemento di

regolazione post-trascrizionale derivato dal virus dell’Epatite B della Marmotta (Woodchuck Hepatitis Virus) che stabilizza l’mRNA aumentandone la traduzione.

particolarmente conservata nei mammiferi di circa 480bp a valle della CDS di COUP-TF1, non presente in altri cloni (Figura 2.2).

Abbiamo pertanto estratto mediante PCR l’intera regione di 748bp del 3’UTR di COUP-TF1 da un clone di libreria genomica di topo (Source Bioscience, Genome Cube R _{; libreria: Mouse BAC (RPCI-23); vettore: pBACe3.6) utilizzando un}

primer forward con il sito di restrizione per l’enzima XmaI ed un primer reverse con il sito di restrizione per Kpnl (schema PCR in Figura 2.4).

Abbiamo poi purificato l’amplificato mediante colonnina Wizard R _{SV Gel and}

PCR Clean-Up System (Promega). Successivamente abbiamo effettuato una digestione con KpnI (New England Biolabs) per 5h a 37◦C dell’amplificato del 3’UTR di COUP-TF1 e del plasmide pWPXLd. Quindi, previa purificazione su

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Figura 2.4: Profilo termico PCR clonaggio 3’UTR COUP-TF1

Schema della PCR d’amplificazione del frammento 3’UTR di COUP-TF1 dal plasmide BAC RPCI-23.

colonnina, i digeriti sono stati processati con l’enzima di restrizione XmaI (New England Biolabs) per 5h a 37◦C. Successivamente, il digerito di pWPXLd `e stato incubato per 90 minuti con la Fosfatasi Alcalina di Vitello (CIP, New England Biolabs) per defosforilarne l’estremit`a 5’ ed impedirne cos`ı la chiusura durante la seguente fase di ligation. Quindi, 50ng di digerito di pWPXLd e 11,6ng di digerito contenente il 3’UTR di COUP-TF1 (ratio molare inserto : vettore, 3:1) sono stati incubati in presenza della ligasi del fago T4 (Promega) overnight. In questo modo abbiamo clonato la sequenza 3’UTR di COUP-TF1 fra i siti di restrizione unici di XmaI e Kpnl all’interno del plasmide pWPXLd (Figura 2.5). Ottenuto il plasmide pWPXLd con la sequenza 3’UTR di COUP-TF1 abbiamo trasformato le cellule ultracompetenti XL10-Gold R _{(Stratagene) mediante shock}

termico (42◦C per 30” ed incubazione in ghiaccio per 2’) , le quali sono state piastrate overnight su piastre rivestite di LB agar a 30◦C in presenza di ampicillina (Tabella 2.11). Successivamente abbiamo effettuato uno screening mediante Colony PCR delle colonie ottenute, per assicurarci in quali cloni l’inserzione fosse

Sostanza Quantit`a

Triptone 10g

Estratto Lievito 5g

NaCl 10g

dH2O 1L

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Figura 2.5: Vettore lentivirale d’espressione virCOUP.

Tagliando il plasmide pWPXLd con gli enzimi di restrizione XmaI e Kpnl, la sequenza WPRE a valle della EGFP `e stata sostituita con la sequenza al 3’UTR di COUP-TF1.

avvenuta correttamente, utilizzando un primer forward (Screen fw, Figura 2.5) che riconosce sequenze del vettore di destinazione ed un primer reverse (Screen -rev, Figura 2.5) che si lega al 3’UTR di COUP-TF1. Quindi, gli amplificati ottenuti durante lo screening sono stati analizzati mediante elettroforesi `e stata scelta una colonia positiva (Figura 2.6).

Il DNA plasmidico `e stato in seguito estratto dalle crescite e purificato mediante Wizard R _{SV Gel and PCR Clean-Up System. Inoltre sono state eseguite due}

di-gestioni di controllo con XhoI, EcoRV e SpeI sul plasmide purificato per verificare che l’inserzione fosse andata a buon fine (Figura 2.7)

In seguito cellule HEK 293T in coltura sono state lipofettate con il plasmide pWPXLd recante la 3’UTR di COUP-TF1, in presenza dei plasmidi di packaging psPAX2 (Addgene, 12260), contenente i geni virali Gag e Pol, e VSV-G (Addgene,

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Figura 2.6: Elettroforesi Colony PCR del vettore virCOUP

Screening mediante elettroforesi in gel d’agarosio dell’amplificato della Colony PCR di sette colonie di batteri trasformati (C1-7). La colonia C3, risultata positiva allo screening, `e stata

selezionata per l’inoculo.

8454), recante i geni Env del virus della stomatite vesciolare, e di polietilammina (PEI, 900 nM), per favorire la penetrazione dei plasmidi nelle cellule (Tabella 2.12).

I plasmidi di packaging forniscono le componenti necessarie affinché il plasmide pWPXLd, di per sé incapace di replicare perché privo di geni di virulenza ma

re-Figura 2.7: Digestioni di controllo del vettore virCOUP

Screening mediante elettroforesi in gel d’agarosio delle digestioni di controllo del costrutto plasmidico pWPXLd con la 3’UTR di COUP-TF1. La digestione con la coppia di enzimi XhoI e

EcoRV e quella con SpeI e XhoI hanno generato le bande della dimensione attesa, che sono invece assenti nel controllo incubato senza enzimi.

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Sostanza Quantit`a psPAX2 15μg pVSV-G 5μg pWPXLd:3’UTR COUP-TF1 20μg PEI (20μM) 45μL DMEM 1mL

Tabella 2.12: Componenti mix di lipofezione delle cellule HEK 293T. cante la sequenza psi d’incapsidamento, venga incorporato all’interno del capside lentivirale, portando alla nascita di un vettore lentivirale pseudotipato virCOUP. Il giorno successivo viene cambiato il mezzo alle HEK trasformate, mentre la raccolta del surnatante contente il vettore virCOUP incomincia dopo 48h dalla trasformazione e continua il giorno seguente.

Abbiamo quindi testato il vettore virCOUP su cellule staminali e neuroni maturi per valutarne l’efficienza di trasduzione. Dopo 6h di trasduzione e 48h d’incu-bazione abbiamo osservato, mediante citometria di flusso, una percentuale di cellule esprimenti la EGFP del 43,97% nelle cellule staminali (Figura 2.8) e del 95,93% nei neuroni a fine step 3 (vedi “Risultati”, Figura 3.8B). Mentre con una trasduzione a basso titolo di virus in neuroni a fine step 3 abbiamo osservato circa il 20% di cellule EGFP+ _{(Figura 2.9)}

Figura 2.8: Analisi citofluorimetrica di cellule ES trasdotte con virCOUP.

Cellule staminali trasdotte con virCOUP per 6h, lasciate 48h in incubazione ed analizzate mediante citometria di flusso.

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Figura 2.9: Neuroni trasdotti con virCOUP

Immunocitorivelazione con anticorpi contro la EGFP in neuroni di fine step 3 trasdotti con virCOUP a basso titolo.

2.14 Sequenziamento massivo parallelo dei

mi-croRNA (miRNA-seq) ed analisi dei dati

Da campioni di controllo e trattati con Fgf8 abbiamo estratto e purificato l’RNA totale arricchito di piccoli RNA mediante purificazione su colonnina (miRNeasy Mini Kit, Qiagen). L’RNA estratto `e stato successivamente utilizzato dal Dr. Baumgart presso il Leibniz-Institute for Age Research di Jena (Germania) per la costruzione di una library mediante il Kit TruSeq Small RNA Sample Prepa-ration (Illumina) e sottoposto sequenziamento massivo parallelo utilizzando la piattaforma Illumina HiSeq 2000.

Con il software miRExpress abbiamo effettuato il parsing del file di output grezzo, contenente le letture in formato FASTQ, ed il trimming delle sequenze adattatrici,

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utilizzate nel multiplexing, ottenendo quindi un elenco delle sequenze uniche associato al numero di rilevamenti per ciascuna sequenza. Successivamente, sempre utilizzando miRExpress, abbiamo effettuato l’allineamento delle sequenze cos`ı ottenute con le sequenze dei microRNA maturi presenti nella libreria di mirBASE (mirbase.org, release 2.2), al fine di ottenere il numero di rilevamenti di ciascun microRNA nella libreria in ciascun campione.

I dati cos`ı ottenuti sono stati successivamente analizzati utilizzando il software R (pacchetto EdgeR 2.12, Bioconductor). In particolare, il numero di letture di ciascun microRNA è stato normalizzato sul numero di letture totali nel campio-ne (Counts Per Million, CPM) e la significatività statistica della differenza fra trattato e controllo (Fold Change, FC) è stata valutata mediante test esatto di Fisher. Come soglie per le successive analisi abbiamo imposto un log2(CPM)>6

e un log2(FC)>2, con P-value<10-2.

La ricerca dei potenziali siti di legame di microRNA nel 3’UTR di COUP-TF1 è stata effettuata con il software miRanda (versione 3.3a, microrna.org). L’algo-ritmo identifica i potenziali siti riconosciuti da microRNA nella 3’UTR di un tra-scritto tenendo in considerazione due parametri differenti, uno di sequenza (com-plementarietà del microRNA, posizione e struttura del seed), l’altro di stabilità termodinamica del complesso miRNA/mRNA (ΔGmin =

Kcal mol ).

Abbiamo utilizzato come parametri di ricerca un valore minimo di 100 nel pun-teggio d’allineamento attribuito dal software ed di −15Kcal