ln A = ln A0 – kt Eq. 1
dove A0 ed A sono la concentrazione del farmaco nella fase donatrice al tempo
t=0 ed al tempo t, rispettivamente, e k è la costante di velocità di dialisi. Il fitting dell’Eq. 1 ai dati di dialisi era sempre significativo (r² ≥ 0.99, con almeno 8 gradi di libertà per ciascuna regressione lineare). Questo ha reso possibile il calcolo di k. In tutti i casi i dati di dialisi erano indipendenti dalla velocità di agitazione della fase donatrice, il che dimostra che la membrana era la sola barriera diffusiva efficace al trasporto del farmaco dalla fase donatrice a quella ricevente.
Nelle condizioni sperimentali sopra descritte, una eventuale riduzione della costante di velocità di dialisi causata da un polimero si può considerare un segno e una misura delle interazioni farmaco-polimero. La frazione di farmaco libero dall’interazione con il polimero, fF, è espressa dalla seguente equazione
(Di Colo e Zambito, 2002):
fF=kp/ka Eq. 2
dove kp e ka rappresentano le costanti di dialisi in presenza e in assenza del
polimero, rispettivamente. La frazione di farmaco legato fB si ricava direttamente
dall’Eq. 2:
fB=1-fF Eq. 3
Le differenze tra i valori di kp e kasono state considerate significative sulla
SEZIONE III - RISULTATI E DISCUSSIONE
III.1 MISURE DI VISCOSITA’
I dati di viscosità relativi alle soluzioni polimeriche (ηp) riportati in Tab. 1
mostrano che l’ordine della viscosità dei veicoli è TSP-HA(4:1)<TSP-HA(3:2)<TSP-HA(1:4)≈TSP-HA(2:3). Tale ordine indica un aumento della viscosità del veicolo all’aumentare della concentrazione di HA. Ciò è in accordo con i dati ottenuti in un precedente lavoro in cui avevamo riscontrato che a parità di concentrazione TSP è meno viscoso di HA.
I reogrammi riportati in Fig. 1 per le soluzioni polimeriche allo studio indicano che all’aumentare della concentrazione di HA, e quindi della viscosità, il comportamento reologico tende a passare da newtoniano a pseudoplastico.
Si può pensare che se il tempo di residenza dei polimeri nell’area precorneale dipendesse solo dalla viscosità, esso dovrebbe essere maggiore per le soluzioni TSP-HA(1:4), TSP-HA(2:3). Se questo non dovesse verificarsi in vivo ciò potrà essere attribuito alla maggiore mucoadesività di quella particolare miscela polimerica.
Da notare infine che il comportamento reologico delle soluzioni preparate con i polimeri marcati con FITC è risultato praticamente uguale a quello dei polimeri non marcati (grafici non riportati).
III.2 VALUTAZIONE COMPARATIVA DELLA MUCOADESIVITA’
DELLE SOLUZIONI POLIMERICHE
Un tentativo per determinare l’ordine di adesività dei polisaccaridi alla superficie oculare è stato fatto confrontando l’interattività mucina-polimero, determinata in vitro con misure di viscosità, come descritto nella sezione II.5, con il tempo medio di residenza dei polimeri nel fluido lacrimale del coniglio (MRT), determinato come descritto nelle sezioni II.6 e II.7. Tutte le gocce oftalmiche, instillate nell’occhio del coniglio, si sono dimostrate biocompatibili e non hanno causato segni evidenti di irritazione, come edema
congiuntivo/corneale e/o iperemia. La Tab. 1 mostra, per ciascuna dispersione mucina-polisaccaride, la componente della viscosità dovuta alla interazione mucina-polisaccaride (ηmp) ed il contributo percentuale di questa componente
interattiva alla viscosità del sistema mucina-polisaccaride (ηmp/η). Come si può
osservare, per tutti i veicoli testati la componente interattiva dà un contributo importante alla viscosità totale della dispersione. Questi risultati sono in accordo con la riconosciuta mucoadesività dei polisaccaridi allo studio. In particolare si osserva che sia ηmp/η, cioè, il contributo della componente interattiva alla
viscosità totale della dispersione di mucina e polimeri, sia il valor medio di MRT ottenuto in vivo sono maggiori per tutte le miscele TSP-HA rispetto a TSP o HA da soli. Ciò non può essere attribuito a una eventuale maggiore viscosità delle miscele perché, come risulta dai dati in Tab. 1, HA 0.5% ha un maggior valore di viscosità rispetto alle miscele, mentre la viscosità di TSP 0.5% è uguale a quella della miscela TSP-HA(4:1) pur avendo valori di ηmp/η e MRT marcatamente
minori. Si deduce dunque una maggiore mucoadesività delle miscele rispetto ai polimeri componenti da soli. Fare una graduatoria fine della mucoadesività delle miscele non è possibile a causa della variabilità dei dati di MRT in vivo. Si può comunque osservare che la massima interattività mucina polimero si riscontra in Tab. 1 per la miscela TSP-HA(3:2), per la quale l’MRT è nettamente il più lungo. Poiché la viscosità di questa miscela è maggiore solo di quella della miscela TSP-HA(4:1), che tuttavia ha valori minori di ηmp/η e MRT, si può
affermare che la miscela TSP-HA(3:2) è la più mucoadesiva forse per un effetto sinergico dei due polimeri sulla mucoadesività
In Fig. 2 sono riportate le curve di eliminazione dei polisaccaridi dal fluido lacrimale. Esse mostrano un decadimento esponenziale, in linea con il profilo di eliminazione di xenobiotici dall’area precorneale. La soluzione TSP-HA(3:2), che mostra il più alto valore di MRT rispetto a tutti gli altri polimeri, come si può vedere in Tab. 1, mostra una concentrazione nel fluido lacrimale (CFL)
significativamente più elevata delle altre ai tempi iniziali (2-4 min). Questo comportamento si pensa sia dovuto ad una relativamente forte adesione di questa soluzione alla superficie oculare.
III.3 EFFETTO DEI VEICOLI SULLA RESIDENZA DEI FARMACI
NEL FLUIDO LACRIMALE DEI CONIGLI
III.3.1 CASO DI KF
La concentrazione di KF di 0.7 mg/ml nelle gocce oftalmiche è uguale a quella contenuta nel prodotto commerciale Ketoftil® (Farmigea, Italia).
I veicoli testati erano HA(4:1), HA(3:2), HA(2:3), TSP-HA(1:4) alle concentrazione polimerica totale di 0.5% p/v. I relativi profili di eliminazione del farmaco sono mostrati in Fig. 3, mentre i tempi di residenza nel fluido lacrimale sono riportati in Tab. 2, dove è riportata anche la frazione di farmaco legata al polimero (fB), determinata con il metodo della dialisi dinamica.
Dai dati in tabella appare che la soluzione TSP-HA(3:2) è più capace delle altre di trattenere KF nel fluido lacrimale. Infatti il tempo di residenza massimo di KF nel fluido lacrimale a concentrazioni misurabili (1.1 µg/ml) dopo instillazione della soluzione medicata TSP-HA(3:2) è 20 minuti, rispetto a 12 minuti del controllo, di TSP-HA(4:1) e TSP-HA(2:3) ed a 15 minuti di TSP-HA(1:4). Anche l’MRT di KF risulta significativamente più alto quando si somministra la soluzione TSP-HA(3:2) (8.12±0.71 min) rispetto a tutte le altre soluzioni polimeriche, che non hanno aumentato significativamente l’MRT rispetto al controllo (5.07±0.46 min). Tale risultato potrebbe dipendere dal binding tra i polimeri ed il farmaco che potrebbe essere responsabile dell’aumento del tempo di residenza di KF nell’area precorneale, tuttavia i dati di binding mostrano che la frazione di KF legata ai polimeri è in tutti i casi piuttosto bassa (<11.5%) e che la frazione di farmaco legato nel caso della soluzione TSP-HA(3:2) è la più bassa (6.5%). Dunque l’aumento di MRT è da imputare ad una maggiore mucoadesività della soluzione TSP-HA(3:2) già ipotizzata sulla base dei risultati riportati in Tab. 1. L’effetto della soluzione TSP-HA(3:2) di rallentare l’eliminazione di KF dal fluido lacrimale è evidente anche in Fig. 3, dove il profilo del grafico CFL vs. tempo, abbastanza diverso da tutti gli altri casi, mostra un
plateau a 6-20 minuti. Da un confronto dei valori di MRT nelle Tabb. 1 e 2 risulta che a parità di concentrazione polimerica il tempo di residenza di ciascun polimero nel fluido lacrimale del coniglio è maggiore di quello del farmaco.
Questo può essere spiegato considerando che le soluzioni polimeriche hanno mostrato una adesività alla superficie oculare che fa diminuire la loro eliminazione dal fluido lacrimale. In effetti, sebbene ci si aspetti che questi polimeri stabilizzino il film lacrimale, prolungando quindi il tempo di residenza del farmaco nell’area precorneale, non ci si aspetta che quest'ultimo sia così lungo quanto quello del polimero mucoadesivo, anche considerando che i valori di fB in Tab. 2 in nessun caso mostrano un forte binding farmaco-veicolo.
III.3.2 CASO DI DS
Il diclofenac è chimicamente differente dal ketotifene, infatti il primo è un acido, mentre il secondo è una base. Ciò nonostante, i dati di permanenza di DS nell’area precorneale, riportati in Tab. 3, e le cinetiche di eliminazione di DS da questa area, presentate in Fig. 4, mostrano somiglianze rispetto ai corrispondenti dati ottenuti con KF, e discussi nella sezione precedente. Infatti, come già osservato con KF, anche con DS il suo tempo di residenza massimo nel fluido lacrimale a concentrazioni misurabili (1.5 µg/ml) dopo instillazione della soluzione medicata TSP-HA(3:2) è maggiore rispetto al controllo e a tutte le altre soluzioni. Inoltre la soluzione TSP-HA(3:2) esercita l’effetto più forte di tutte le altre soluzioni sul valore di MRT del farmaco. Come appare in Tabb. 2 e 3 per TSP-HA(3:2), i valori di MRT sono simili per KF e DS. Tutti questi dati suggeriscono che il veicolo, se mucoadesivo, esercita un’influenza importante sul tempo di residenza del farmaco nell’area precorneale, a prescindere dalla natura chimica del farmaco. Una considerazione dei valori di fB in Tab. 3 e dei
corrispondenti valori di MRT nelle Tabb. 1 e 3 suggerisce inoltre che in nessun caso studiato il binding farmaco-veicolo era così forte da far avvicinare l’MRT del farmaco a quello del polimero.
III.4 CONCLUSIONI
La valutazione comparativa della capacità delle differenti soluzioni polimeriche studiate di resistere alla eliminazione dal fluido lacrimale ha suggerito che il veicolo oftalmico costituito dalla miscela TSP-HA(3:2) è ottimale
da usare come additivo in gocce oftalmiche in quanto è mucoadesivo senza far aumentare troppo la viscosità della soluzione. Infatti TSP-HA(3:2) ha mostrato il più alto valore di MRT anche rispetto alle soluzioni di TSP e di HA da soli che indica un effetto sinergico dei due polimeri sulla mucoadesività. In virtù della sua mucoadesività, TSP-HA(3:2) p/v si suppone stabilizzi il film lacrimale. Forse è questa la ragione del fatto che MRT e RTmax dei due differenti farmaci testati
in questo lavoro, sono stati aumentati significativamente da TSP-HA(3:2). I presenti risultati hanno mostrato che formulazioni oftalmiche di KF e DS contenenti TSP-HA(3:2) hanno la potenzialità di diminuire la frequenza delle instillazioni. Tali risultati sono in accordo con quelli ottenuti all’NMR dal gruppo della Prof. Uccello-Barretta del Dip. di Chimica e Chimica Industriale dell’Università di Pisa, che hanno mostrato una maggiore interazione tra TSP e HA nel rapporto 3:2 alla concentrazione totale di 0.5% p/v.