PARTE SPERIMENTALE
1. SCOPO DEL LAVORO
Il lavoro di tesi ha avuto lo scopo di individuare parametri di facile misurazione, utili per predire il comportamento di nuovi materiali in campo farmaceutico di tre sostanze di origine vegetale, come farina dei semi di psillio e due tipi di gomma konjac.
Il primo stadio è stato quello di idratare le tre sostanze polimeriche, provvedendo per la polvere di psillio e una qualità di gomma konjac ad eliminare la parte insolubile; in seguito le tre soluzioni, dopo essere state liofilizzate, sono state macinate ottenendo così polveri purificate.
Lo studio ha riguardato misurazioni in vitro di: viscosità, mucoadesione e angolo di contatto per una serie di concentrazioni delle sostanze sopra elencate. Una delle concentrazioni caratterizzate è stata poi sottoposta a prove di rilascio, in modo da evidenziare eventuali relazioni tra i diversi parametri presi in considerazione.
32 2. MATERIALI
Blu di metilene (Carlo Erba, Milano);
Gomma Konjac non purificata (KJ, Vidogum KJ-P, General Trading e Consulting S.r.l., Milano);
Gomma Konjac purificata (KJ-II, Vidogum KJ-II, General Trading e Consulting S.r.l., Milano);
Idrossipropilmetilcellulosa (HPMC, Methocel K4M premium USP/EP, Colorcon, Kent);
Membrana semipermeabile (Spectra/Por Membrane MWCO: 3,500, Spectrum Laboratories, Inc., US & Canada);
Mucina gastrica suina (TCI Europe NV);
Psillio polvere cuticola (PS, Polichimica S.r.l., Bologna). Tutti i solventi utilizzati erano di qualità analitica.
3. METODICHE ANALITICHE
3.1 Processi di purificazione
I prodotti commerciali psillio cuticola (PS) e Vidogum KJ-P (KJ) sono stati purificati per renderli idonei al lavoro di tesi.
I prodotti sono stati dispersi in acqua a una concentrazione dell’1.0% p/p;
le dispersioni ottenute sono state centrifugate (ALC 4236) a 4000 rpm per 15 e 30 minuti rispettivamente per PS e KJ. Il precipitato viene scartato e la frazione liquida sottoposta a liofilizzazione (VirTis AdVantage 2.0, munito di software di comando Wizard 2.0); il materiale essiccato è stato quindi macinato ottenendo polveri purificate, denominate PS-P e KJ-P.
Le condizioni del processo di liofilizzazione erano le seguenti:
Il congelamento era effettuato a una temperatura di -35° C mantenuti per 180 min, ad una pressione di 400 torr.
L’essiccamento primario avveniva in diversi step:
STEP 1: Temperatura = -35°C per 240 min., Pressione = 200 mtorr STEP 2: Temperatura = -25°C per 360 min., Pressione = 150 mtorr STEP 3: Temperatura = 10°C per 300 min., Pressione = 100 mtorr STEP 4: Temperatura = 25°C per 120 min, Pressione = 100 mtorr L’essiccamento secondario avveniva alla temperatura di 27°C per 180 min,
34 3.2 Formulazioni
Per ogni polimero sono state preparate dispersioni acquose, mediante agitazione magnetica, alle diverse concentrazioni riportate in tabella 1.
3.3 Misure di viscosità
Le misure reologiche sono state effettuate mediante viscosimetro rotativo (Rheostress RS 150 Haake), con corpi di misura a cilindri coassiali ( Z41 e Z40) ad una temperatura costante di 25°C.
I reogrammi sono stati eseguiti per valori di gradienti di velocità compresi tra 0 e 200 sec-1 valutando la correlazione tra gli sforzi di taglio (τ) e gradienti di velocità (D) mediante elaborazione matematica operata con il software Rheowin.
Le curve sono state linearizzate riportando in grafico logD verso log τ; dall’equazione della retta logaritmica:
log η= log K + (N-1) log D
è stato possibile calcolare il valore di viscosità apparente (’) a D = 1 di ogni dispersione polimerica.
3.4 Misure di mucoadesione
Le proprietà mucoadesive delle dispersioni polimeriche sono state valutate misurando la forza richiesta per separare due superfici rivestite di mucina fra le quali era interposto il campione in esame. Le superfici mucose sono costituite da una dispersione al 25% p/p di mucina gastrica suina adsorbita su carta da filtro. L’apparecchiatura impiegata (Fig. 7) è costituita da una microbilancia alla quale, mediante un filo inestendibile, è attaccato un corpo cilindrico e da una piattaforma mobile sulla quale viene posto un secondo corpo cilindrico. Sulla carta da filtro, che ricopre i due corpi, vengono applicati 125 μl della dispersione di mucina; su uno dei supporti vengono applicati 300 μl della formulazione in esame.
Una piattaforma mobile permette di mettere in contatto i sistemi; il periodo di tempo di contatto prestabilito è 1 minuto, dopo il quale la piattaforma viene fatta scendere ad una velocità costante (1,25 mm/min) fino alla separazione della superficie polimerica da quella mucosa. Il motore elettrico e la bilancia sono collegati ad un sistema computerizzato per l’acquisizione dei dati (software HandyScope2, TiePie Engineering, Leeuwarden,Olanda), l’elaborazione di questi è effettuata mediante il software GraphPadPrism (GraphPad™, San Diego, USA). La forza F necessaria per distaccare le due superfici è registrata in funzione dell’allungamento (l) delle stesse; dai dati ottenuti viene calcolata l’area sotto la curva forza/allungamento (AUC) che rappresenta il lavoro di adesione W (Fхl).
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Fig.7 Rappresentazione schematica dell’apparecchiatura utilizzata per le prove di
mucoadesione.
3.5 Misure di angolo di contatto
Le misure di angolo di contatto statico sono state eseguite utilizzando il sistema OCA15 (DataPhysics Instrument GmbH) ed i risultati sono stati analizzati tramite software SCA20.
Lo strumento è costituito da una telecamera mobile che inquadra il piano su cui viene fatta cadere la goccia della sostanza in esame ed è dotato di un sistema di dosaggio a controllo elettronico della quantità di sostanza erogata.
Il software calcola il valore di angolo di contatto prendendo come riferimento la misura del diametro esterno dell’ago della siringa attraverso cui viene erogato il liquido. Il software gestisce anche altri parametri come: volume di riempimento della siringa, quantità e velocità di erogazione del liquido.
Le misure sono state effettuate per tutta la serie di formulazioni utilizzando come superficie solida una lastra di vetro da microscopia, accuratamente pulita e sgrassata con alcol etilico.
38 3.6 Prove di rilascio
Per le prove di rilascio sono state utilizzate celle di diffusione verticale del tipo Gummer con area diffusionale di 2,68 cm2 termostatate ad una temperatura di 37± 0.5 °C.
La fase ricevente (11.6 ml) era costituita da tampone fosfato isotonico a pH 7.4; la fase donatrice era costituita da 1 g di formulazione addizionata dello 0.5 % di blu di metilene come tracciante modello; le due fasi erano separate da una membrana semipermeabile. Una volta montata la cella questa era chiusa ermeticamente in modo da evitare fenomeni di evaporazione della soluzione polimerica. Ad intervalli stabiliti veniva prelevato un volume di circa 7 ml dalla fase ricevente e determinato il contenuto in blu di metilene mediante spettrofotometria UV (Shimadzu UV-2101 PC) ad una lunghezza d’onda di 290 nm. L’analisi quantitativa veniva eseguita per confronto con una retta di taratura esterna.
4. RISULTATI
Il comportamento reologico delle dispersioni studiate passava da Newtoniano a pseudoplastico con l’aumentare della concentrazione del polimero, comportamento tipico di macromolecole idrofile. Il passaggio da Newtoniano a pseudoplastico avveniva a concentrazioni diverse, in rapporto al peso molecolare e alla struttura del polimero considerato.
In figura 8 sono riportati i profili di viscosità apparente (η’) in funzione della concentrazione (% p/p) per le dispersioni polimeriche allo studio. Dai grafici è possibile notare una relazione diretta tra i due parametri: i coefficienti di correlazione, r2, delle curve esponenziali ottenute sono compresi tra 0,983 e 0,902. Le dispersioni contenenti KJ-II presentano un significativo aumento dei valori di viscosità anche per piccoli incrementi nella concentrazione, raggiungendo valori di viscosità di 27.77 Pa.s con la dispersione all’1.5%. Al contrario, PS-P, HPMC e KJ-P mostrano più deboli aumenti di viscosità per gli stessi incrementi in concentrazione. Soprattutto le dispersioni di KJ-P raggiungevano valori di viscosità rilevanti, intorno a 6.0 Pa.s, solo a concentrazioni del 3.0%. La differenza di comportamento fra i due glucomannani impiegati nello studio potrebbe essere collegata al peso molecolare medio del prodotto impiegato. KJ-P è infatti il polimero purificato in laboratorio, dal quale è stata rimossa la frazione insolubile, fra cui, certamente, quella a più alto PM. La riduzione della grandezza media delle molecole può portare ad una dispersione con meno interazioni intramolecolari e
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La figura 9 riporta il lavoro di adesione (L) in funzione della concentrazione (%p/p) delle dispersioni polimeriche impiegate; i valori riportati rappresentano la media di almeno otto determinazioni con il relativo errore standard. I risultati evidenziano che il valore di L aumenta all’aumentare della concentrazione del polimero, fino a raggiungere un valore massimo (Lmax), diverso e specifico per
ogni sostanza, raggiunto il quale si ha una riduzione graduale di tale parametro. Confrontando le proprietà mucoadesive delle dispersioni polimeriche con il loro comportamento reologico, è interessante notare che il valore di Lmax, per tutti i
polimeri saggiati, si raggiunge con dispersioni aventi un valore di ’ superiore a 5.00 Pa.s: da 5.19 per KJ-II a 10.55 per PS-P, uno stretto range di valori rispetto a quelli valutati (da 0.013 a 27.77 Pa.s). Le concentrazioni che producono Lmax sono
invece più disperse, da 0.75% per KJ-II a 3.2% per KJ-P in un range di concentrazioni saggiate tra 0.75 e 4.0%. Questo dato, illustrato in figura 10, dimostrerebbe che le proprietà mucoadesive di una dispersione polimerica sono
influenzate più dalla sua viscosità che dalla sua concentrazione. In figura 11 sono riportati i valori di angolo di contatto in funzione della
concentrazione delle varie dispersioni polimeriche: il valore dell’angolo di contatto tende ad aumentare, anche se in minima misura, all’aumentare della concentrazione di polimero presente nella dispersione. Il fenomeno è più evidente per le dispersioni di KJ-II, pendenza della retta di regressione 13.06 gradi/%. I polimeri impiegati, anche a basse concentrazioni, non hanno spiccate proprietà bagnanti, gli angoli di contatto hanno infatti valori intorno a 40.0°. Le proprietà bagnanti diminuiscono con l’aumentare della concentrazione, probabilmente per
minori quantità di acqua disponibili. In figura 12 sono riportate, a titolo di esempio, immagini delle gocce di differenti dispersioni polimeriche sottoposte alla misurazione.
Le dispersioni di PS-P, KJ-II e HPMC sono state impiegate per valutare l’influenza dei parametri chimico-fisici misurati sulla capacità di rilascio della formulazione. A questo scopo sono state impiegate dispersioni dei polimeri isoviscose (circa 6.0 Pa.s), e le formulazioni sono state addizionate dello 0.5% di blu di metilene, come tracciante modello.
Nella figura 13 sono riportati i risultati, come percentuale di blu di metilene rilasciato nel tempo dalle dispersioni polimeriche; i valori ottenuti sono rappresentati dalla media di 5 determinazioni con il relativo errore standard.
Dal grafico si osserva che le percentuali di blu di metilene rilasciate dalle diverse formulazioni durante i primi 60 minuti di esperimento sono molto simili, tra 4,22% e 5,04% passando da PS-P a KJ-II. Dopo 60 minuti si inizia a notare una differenziazione del profilo di rilascio da KJ-II rispetto alle altre due formulazioni analizzate. Al termine della prova, 360 minuti, la percentuale di blu di metilene rilasciata dalla dispersione polimerica KJ-II è pari a 19,98 ± 2.00%, contro 14,45 ± 2.18% rilasciata da HPMC.
Le capacità di rilascio della dispersione a base di PS-P si sono mostrate più simili a quelle di HPMC piuttosto che KJ-II, anche se fra i valori di rilascio non vi erano differenze statisticamente significative.
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formulazione (figura 14), infatti KJ-II aveva una concentrazione dello 0.8%, mentre PS-P e HPMC di 1.7% e 2.0%, rispettivamente. Questo comportamento potrebbe essere imputato ad una più alta presenza di catene polimeriche nella dispersione tale da rallentare la velocità di diffusione del colorante all’interno della formulazione.
Visto le buone correlazioni ottenute per le diverse serie di dati, riassunti in tabella 2, potrebbe essere possibile, valutando semplici parametri chimico-fisici di una dispersione polimerica (quali la bagnabilità o la viscosità), ricavarne altri, spesso più complessi da misurare, al fine di orientare il formulatore nella scelta di un veicolo.
