SEZIONE II
- PARTE SPERIMENTALE
II.1 MATERIALI:
1. Tamarind seed polysaccharide (sigla TSP), donato da Farmaigea (lotto: 07-1701)
2. Acido ialuronico (sigla HA), donato da Farmigea (lotto: 07-2090) 3. Ketotifene fumarato (sigla KF), donato da Farmigea (lotto: 07-1804) 4. Diclofenac sodico (sigla DS), donato da Farmigea (lotto: 06-2028) 5. Fluoresceina isotiocianato (sigla FITC), Fluka
6. Mucina gastrica di maiale di tipo III, Sigma 7. Solventi, Carlo Erba
II.2
PREPARAZIONE
E
PURIFICAZIONE
DEI
POLIMERI
MARCATI CON SONDA FLUORESCENTE
Un ml di una soluzione di FITC in dimetilsolfossido (2 mg/ml) è stato addizionato a 20 ml di una soluzione acquosa di TSP, oppure HA (2 mg/ml). Le soluzioni ottenute sono state incubate a 4°C per 8 ore. Dopo questo tempo le soluzioni sono state fatte passare in colonna di Sephadex G15 per separare il polimero marcato da FITC non reagita, e successivamente liofilizzate. La colonna di Sephadex G15 non trattiene fluorescenza indicando l’assenza di FITC non reagita e la completa marcatura dei polimeri. Si può così stimare la percentuale di fluoroforo per unità di massa di polimero (5%, 0.13 mmoli/g).
II.3 PREPARAZIONE DI GOCCE OFTALMICHE
Per confrontare l'adesività dei vari polisaccaridi alla superficie oculare sono state preparate gocce oftamiche in tampone fosfato pH 7.4, 0.0375 M reso isotonico con NaCl (sigla TF) contenenti TSP e HA, marcati con FITC, alla concentrazione totale di 0.5% p/v nelle seguenti proporzioni:
b. TSP 0.2%+HA 0.3% in TF (sigla, TSP-HA(2:3)), c. TSP 0.3%+HA 0.2% in TF (sigla, TSP-HA(3:2)), d. TSP 0.4%+HA 0.1% in TF (sigla, TSP-HA(4:1)).
Sono state preparate gocce oftalmiche medicate, contenenti 0.7mg/ml di KF o 1mg/ml di DS e le soluzioni a-d. Ogni farmaco è stato disciolto nel veicolo prima di addizionare il polimero. L'isotonicità delle gocce oftalmiche è stata verificata con un microosmometro (Hermann Roebling, Berlin).
II.4 MISURE DI VISCOSITA'
Reogrammi delle soluzioni HA(4:1), HA(3:2), HA(2:3), TSP-HA(1:4) in TF sono stati ottenuti a 35 °C con un reometro Haake RS1 equipaggiato con i cilindri coassiali Z40 (rotore) e Z41 (statore). I dati venivano acquisiti e analizzati con il software Rheo Win Pro (Haake). Nella Tab.1 sono riportati i valori medi di viscosità relativi ad almeno 3 misure. Il coefficiente di variazione delle misure non ha mai ecceduto 0.4%.
Tutte le soluzioni hanno mostrato un comportamento pseudoplastico. Per questi sistemi i valori di viscosità sono stati misurati alla velocità di taglio di 200 s-1, alla quale la dipendenza della viscosità dalla velocità di taglio è minima. Le misure di viscosità non hanno mostrato differenze significative tra le miscele dei polimeri non marcati e quelle dei polimeri marcati con FITC.
II.5
VALUTAZIONE
COMPARATIVA
IN
VITRO
DELLA
MUCOADESIVITA’ DELLE MISCELE POLIMERICHE
Per tali misure è stato preso in considerazione il metodo di Hassan e Gallo (E.E. Hassan, J.M. Gallo, 1990). Secondo questi autori il coefficiente di viscosità, η, di una dispersione di mucina e di polimeri idrofili mucoadesivi risulta dalla somma dei contributi dei coefficienti di viscosità della dispersione di mucina, ηm, e di quella dei polimeri, ηp, e di una componente della viscosità dovuta alla mucoadesione, cioè, all’interazione mucina-polimero, ηmp.
la componente dovuta all’interazione mucina-polimero è stata calcolata dalla seguente equazione. p m mp η η η η = − −
I valori di ηmp ottenuti sono stati usati per una valutazione comparativa della mucoadesività in vitro delle miscele polimeriche.
Sono state testate dispersioni contenenti 15% p/p di mucina gastrica di maiale e le miscele polimeriche HA(4:1), HA(3:2), HA(2:3), TSP-HA(1:4). Il solvente era tampone fosfato pH 7.4, 0.0375 M reso isotonico con NaCl. Le dispersioni sono state preparate aggiungendo 2 ml di soluzione polimerica, avente una concentrazione 4 volte maggiore della concentrazione finale, a 6 ml di una dispersione di mucina al 20% p/p nello stesso solvente. La viscosità di ciascuna miscela polimerica in assenza di mucina (ηp) è stata misurata a una concentrazione corrispondente a quella nel sistema mucina-miscela polimerica. La viscosità dei sistemi pseudoplastici è stata misurata a 35 °C con il reometro Haake RS1 alla velocità di taglio di 200 s-1, alla quale la dipendenza della viscosità dalla velocità è minima.
II.6 DETERMINAZIONE DELLA CINETICA DI ELIMINAZIONE DEI
POLIMERI DAL FLUIDO LACRIMALE DEI CONIGLI
Sono stati utilizzati conigli albini maschi New Zealand del peso di 3.0-3.5 Kg, mantenuti in condizioni di stabulazione standard. Essi sono stati trattati come previsto nelle linee guida per la cura e l'utilizzo di animali da laboratorio. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati sotto la supervisione di un veterinario e i protocolli sono stati approvati dal Comitato di Ateneo per la Sperimentazione Animale. Sono state testate le soluzioni non medicate HA(4:1), TSP-HA(3:2), TSP-HA(2:3), TSP-HA(1:4), preparate con i polimeri marcati con FITC. Veniva instillata una goccia di soluzione (50 µl) nel sacco congiuntivale inferiore dell’occhio del coniglio cercando di evitare la sua immediata fuoriuscita. Per la determinazione della cinetica di scomparsa dei polimeri dal fluido lacrimale, a intervalli di tempo prestabiliti venivano prelevati con pipetta capillare
(Drummond ‘Microcaps’, Fisher Scientific, St. Louis MO, USA) campioni di 1 µl di fluido lacrimale. Tali campioni venivano diluiti 1:1 con acqua in seguito al lavaggio del capillare, e poi ulteriormente diluiti con 100 µl di acqua per l’analisi fluorimetrica (spettrofotofluorimetro Perkin Elmer LS 45). Le lunghezze d’onda a cui veniva effettuata l’analisi erano: eccitazione λ=494 nm, emissione λ=510 nm. Per ciascuna miscela polimerica è stata costruita una curva di calibrazione utilizzando standards a concentrazioni da 0.05 a 0.5 µg/ml. In tutti i casi nell’intervallo di concentrazioni degli standards è stata osservata una linearità del grafico fluorescenza vs. concentrazione (r2 > 0.99). Si è costruito per ciascuna soluzione polimerica il grafico della concentrazione nel fluido lacrimale rispetto al tempo.
II.7 DETERMINAZIONE DELLA CINETICA DI ELIMINAZIONE DEI
FARMACI DAL FLUIDO LACRIMALE DEI CONIGLI
Sono stati eseguiti studi per determinare la cinetica di eliminazione dal fluido lacrimale del coniglio di KF e DS da soli o in presenza delle soluzioni TSP-HA(4:1), TSP-HA(3:2), TSP-HA(2:3), TSP-HA(1:4).
Per la determinazione della cinetica di eliminazione dei farmaci dal fluido lacrimale si è usata la stessa metodologia descritta per i polimeri, con la sola differenza che il fluido prelevato veniva diluito a 50 µl invece che a 100 µl in quanto il metodo HPLC di analisi dei farmaci è meno sensibile del metodo fluorimetrico usato per i polimeri.
II.8 TRATTAMENTO DEI DATI DI ELIMINAZIONE
I dati di concentrazione nel fluido lacrimale (CFL ) vs. tempo, ottenuti con le
gocce oftalmiche non medicate e con quelle medicate come descritto nelle sezioni II.6 e II.7, sono stati utilizzati per calcolare il tempo medio di residenza di ogni soluzione polimerica, o farmaco, nel fluido lacrimale dei conigli. Tale valore è stato da noi espresso mediante il parametro MRT (Mean Residence Time). Esso risulta dal rapporto tra l’AUMC (Area Under Momentum Curve), che
è l’area sotto la curva CFLt vs. t e l’AUC, che è l’area sotto la curva CFL vs. t.
AUMC e AUC sono state calcolate con il metodo dei trapezi, tra il tempo 0 e tempo a cui CFL scende sotto il minimo quantificabile. Per ogni curva di
eliminazione determinata in ogni singolo occhio è stato calcolato il rispettivo valore di MRT. Si sono così ottenuti da animali diversi 8 valori di cui si sono calcolati media e ES. La significatività della differenza tra le medie è stata valutata sulla base del test del t di Student (P<0.05).
Con le gocce oftalmiche medicate inoltre è stato riportato il tempo di residenza massimo del farmaco nel fluido lacrimale (Rtmax) a concentrazioni
quantificabili. Questo tempo corrisponde all'ultimo punto del grafico CFL vs.
tempo per il farmaco. In questo grafico per ciascun intervallo di tempo è stata riportata la media degli 8 valori di CFL ottenuti con i diversi animali. Il valore
minimo quantificabile di CFL era 1.1 µg/ml per KF, 1.5 µg/ml per DS,
considerando la necessità di diluire gli ultimi campioni prelevati almeno 1:50 v/v.
II.9 METODI HPLC
L’apparecchiatura HPLC è costituita da una pompa Perkin-Elmer Series 200, da un rivelatore UV Perkin-Elmer e l’integrazione dei dati è effettuata mediante il programma Turbochrom Navigator HPLC. La valvola di iniezione è una Rheodyne da 20 µl. La colonna è Spheri-5 RP18 250x4.6 mm 5 µm.
Per l’analisi di KF, la fase mobile è acetonitrile/acqua/trietilammina/acido acetico glaciale 50:50:0.2:0.1, il flusso è 2 ml/min, il tempo di ritenzione è 6.3 min, la rivelazione UV è a 301 nm. La retta di calibrazione ha la seguente equazione:
Area = 24560 Conc + 561 (r2=0.9998)
Per l’analisi di DS la fase mobile è acetonitrile/acqua/acido acetico glaciale 50:46:4, il flusso è 1.5 ml/min, il tempo di ritenzione è 5.8 min, la rivelazione UV è a 276 nm. La retta di calibrazione ha la seguente equazione:
II.10 DETERMINAZIONE DELLE INTERAZIONI TRA FARMACI E
POLIMERI
Si sono effettuati studi di binding tra KF o DS e ciascuna delle quattro diverse miscele polimeriche allo studio: HA(4:1), HA(3:2), TSP-HA(2:3), TSP-HA(1:4), per determinare in vitro le interazioni dei farmaci con i polimeri. Tali interazioni sono state determinate mediante il metodo della dialisi dinamica (Di Colo e Zambito, 2002; Di Colo et al., 2004). Quanto maggiore è il grado di binding tanto maggiore dovrebbe essere la tendenza del polimero a trattenere il farmaco nell’area precorneale.
Il flusso del farmaco attraverso una membrana porosa di cellulosa (Spettra/Por®, cut-off 3500 Da, Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominguez, CA, USA) in condizioni di stato quasi-stazionario è stato misurato a 35°C in presenza o assenza dei polimeri allo studio nella fase donatrice (tampone fosfato pH 7.4, 0.0375 M reso isotonico con NaCl, sigla TF). La concentrazione totale della miscela polimerica allo studio era di 0.5% p/v.
La membrana è stata montata su una cella cilindrica di Teflon (diametro interno 3 cm, altezza interna 4.5 cm) contenente un agitatore a paletta in Teflon, avente diametro uguale al diametro interno della cella, posizionato a distanza di 1 mm dalla membrana e azionato da un motore sincrono a 150 gpm. Il mezzo interno, costituito da 20 ml di una soluzione del farmaco, veniva inserito nella cella immediatamente prima di immergere la stessa nella fase ricevente (volume, 400 ml). La concentrazione iniziale del farmaco nella fase donatrice corrispondeva a quella della formulazione commerciale ed era 0.07% p/v, nel caso di KF, e 0.1% p/v, nel caso di DS. A t=0 la cella veniva immersa nella fase ricevente contenuta in un becher a camicia termostatato a 35 °C per mezzo di un bagno termostatico a circolazione esterna. Ad intervalli misurati di tempo veniva prelevato un volume di fase ricevente, che veniva rimesso nella stessa dopo essere stato analizzato allo spetrofotometro UV. KF veniva determinato a 301 nm, DS a 276 nm. Le condizioni di “sink” nella fase ricevente (concentrazione di farmaco inferiore a 1/10 di quella nella fase donatrice) venivano sempre rispettate. I dati ottenuti venivano analizzati secondo la seguente equazione:
ln A = ln A0 – kt Eq. 1
dove A0 ed A sono la concentrazione del farmaco nella fase donatrice al tempo
t=0 ed al tempo t, rispettivamente, e k è la costante di velocità di dialisi. Il fitting dell’Eq. 1 ai dati di dialisi era sempre significativo (r² ≥ 0.99, con almeno 8 gradi di libertà per ciascuna regressione lineare). Questo ha reso possibile il calcolo di k. In tutti i casi i dati di dialisi erano indipendenti dalla velocità di agitazione della fase donatrice, il che dimostra che la membrana era la sola barriera diffusiva efficace al trasporto del farmaco dalla fase donatrice a quella ricevente.
Nelle condizioni sperimentali sopra descritte, una eventuale riduzione della costante di velocità di dialisi causata da un polimero si può considerare un segno e una misura delle interazioni farmaco-polimero. La frazione di farmaco libero dall’interazione con il polimero, fF, è espressa dalla seguente equazione (Di Colo e Zambito, 2002):
fF=kp/ka Eq. 2
dove kp e ka rappresentano le costanti di dialisi in presenza e in assenza del polimero, rispettivamente. La frazione di farmaco legato fB si ricava direttamente dall’Eq. 2:
fB=1-fF Eq. 3
Le differenze tra i valori di kp e ka sono state considerate significative sulla base del test del t di Student (P < 0.05).
