2.3 Digestione di plasmidi con enzimi di restrizione (Sambrook et al., 1989)

Materiali e Metodi

N 5

Tris/H3PO4 100 mM

EtOH 15%

KC1+H3PO4 1000 mM pH 8.5

2.3 Digestione di plasmidi con enzimi di restrizione

(Sambrook et al., 1989)

Le digestioni dei vettori plasmidici sono state generalmente effettuate in un volume finale di 20 µl; la miscela di reazione è costituita dal DNA plasmidico, dall’enzima di restrizione (in concentrazione di 1-2 Unità Internazionali (UI) per µg di plasmide) e dal tampone specifico per il tipo di enzima utilizzato. Occorre che il volume di enzima aggiunto non superi 1/10 del volume della miscela di reazione, poiché un’eccessiva concentrazione di glicerolo, in cui gli enzimi sono conservati, può interferire con l'efficienza di reazione. La reazione di digestione viene fatta procedere, a 37°C, per 1-12 ore, in base alla quantità di DNA che deve essere digerito. Al fine di verificare se la digestione è completa, si carica e si sottopone ad elettroforesi su gel di agarosio all’1%, colorato con bromuro di etidio, 1/20 della reazione, confrontandone la mobilità con un’aliquota di plasmide non digerito. Se la digestione è completa, nella corsia del digesto si ottiene una banda unica (che teoricamente dovrebbe migrare più lentamente rispetto al DNA non digerito) piuttosto che due bande, corrispondenti a due diverse forme di superavvolgimento del plasmide circolare. In questo caso si può procedere con

Materiali e Metodi

la purificazione del DNA digerito, eseguita o per eluizione da gel (come descritto in un paragrafo successivo) o tramite estrazione fenolica.

2.3.a Estrazione fenolica

Per purificare il DNA dalle proteine, si porta la miscela di digestione ad un volume di 200 µl con H2O mq e si aggiunge un ugual volume di

fenolo:cloroformio:alcol isoamilico, in rapporto 25:24:1, a pH 8. Dopo aver mescolato energicamente con l’aiuto di un vortex, si centrifuga per 5 minuti a 13000 RPM.

Si ottiene, così, la separazione di due fasi, una organica (più densa) contenente le proteine ed una acquosa (meno densa) contenente il DNA. La fase acquosa sopranatante viene trasferita in una nuova microprovetta eppendorf.

Questa tecnica si basa sulla maggiore solubilità delle proteine in fase alcolica che in fase acquosa: fenolo e cloroformio denaturano le proteine, il cloroformio facilita la separazione delle fasi, mentre l’alcol isoamilico riduce la formazione di schiuma durante l’estrazione.

Si procede quindi con la precipitazione alcolica.