CAPITOLO 4
4. Protocolli
4.1 Gel Elettroforetico di Agarosio per analisi di acidi nucleici preparato alla
concentrazione di 1% 100 ml TAE
1,00 g di Agarose Electrophoresis Grade (Invitrogen) 3 µl Bromuro di Etidio x mM
Si fa sciogliere l’agarosio nel TAE in microonde poi si lascia raffreddare leggermente prima di aggiungere il bromuro di etidio.
4.2 GENECLEAN II Kit (Q?BIOgene)
Purificazione di una banda di DNA da gel di agarosio con TAE. 1. Ritagliare la banda di DNA dal gel.
Ritagliare la banda di DNA dal un gel colorato con bromuro di etidio con un la lama di un rasoio. Visualizzare la banda da ritagliare usando luce UV onde lunghe per il tempo più breve possibile, usando una maschera di protezione per il viso e gli occhi.
2. Pesare il pezzo di gel ritagliato.
3. Usando la scala di equivalenza di 100mg ˜ 100 µl, ricavare il volume approssimativa del pezzo di gel
4. Inserire il pezzo di gel in un eppendorf (non usare contenitori di vetro perché il si lega al vetro).
5. Aggiungere una quantità di NaI equivalente a 3 volte il volume del pezzo di gel come è stato calcolato nel punto 3. La concentrazione di NaI rimane sopra ai
6. Incubare in un bagno a 45°C – 55°C circa un minuto o finché non si scioglie il pezzo di gel.
7. Mischiare il contenuto dell’eppendorf tappotando con un dito. 8. Incubare altri 5 minuti a 45°C – 55°C.
9. Calcolare la quantità di µl da aggiungere :
Volume finale Quantità max. di DNA Quantità di GLASSMILK ® < 500 µl < 5 µg 5 µl
500 – 1000 µl < 7.5 µg 10 µl 1 ml < 12.5 µg 20 µl 3 ml < 50 µg 100 µl 10. Risospendere GLASSMILK R 1 minuto su vortex
11. Aggiungere la quantità di GLASSMILK R calcolata nel punto 9 e agitare. 12. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente per permettere al DNA di legare la
matrice di silice. Miscelare per inversione ogni 1 – 2 minuti per manterene GLASSMILK R in sospensione.
13. Centrifugare 5 secondi a 14000 x g. Togliere il sovranatante.
14. Aggiungere 500 µl del reagente NEW Wash e risospendere il pellet con una pipetta.
15. Centrifugare di nuovo 5 secondi a 14000 x g e togliere il sovranatante. 16. Ripetere il lavaggio dei punti 14 e 15.
17. Centrifugare il pellet di nuovo dopo rimozione del sovranatante alcuni secondi a 14000 x g per separare bene le ultime gocce di sovranatante.
18. Aggiungere un volume di acqua o TE pari alla quantità di GLASSMILK R calcolato nel punto 9. Risospendere il pellet.
19. Centrifugare 30 secondi a 14000 x g. Recuperare il sovranatante in un tubo eppendorf pulito. Circa 80 % del DNA viene eluito. Si può aggiungere dell’altra acqua al pellet per recuperare un’ulteriore quantità di DNA.
4.3 Mini Prep – estrazione del plasmide da Escherichia coli.
1. Stemperare una colonia selezionata in 5 ml di LB + Antibiotico ( ad esempio Ampicillina, far crescere una notte a 37°C in agitazione.
2. Congelo del plasmide : prelevare 1 ml di terrendo in cui è cresciuto il plasmide e trasferirlo in condizioni di sterilità in un tubo nunc, addizionare 200 µl di glicerolo 100% sterile (concentrazione finale 20%) e conservare a –80°C. 3. Centrifugare la restante aliquota di terreno “cresciuto” per 5 minuti a 13000
rpm a temperatura ambiente
4. Eliminare il sovranatante per bene.
5. Risospendere il pellet batterico in 200 µl di soluzione 1 pipettando su e giù e incubare 5’ a temperatura ambiente.
6. Addizionare 300 µl di soluzione 2 preparata di fresco miscelare invertendo i tubi e incubare in ghiaccio per 5 minuti (non usare il vortex)
7. Addizionare 300 µl di soluzione 3 miscelare invertendo i tubi e incubare in ghiaccio per 5 minuti (non usare il vortex).
8. Centrifugare 10 minuti a 13000 rpm a temperatura ambiente. 9. Recuperare il surnatante in tubi (eppendorf) puliti
10. Addizionare RNAsi ad una concentrazione finale di 20ug/ml e incubare a 37°C per 20-30 minuti.
11. Addizionare 400 µl di cloroformio miscelare su vortex per 30 secondi. 12. Centrifugare per 5 minuti a 13000 rpm a temperatura ambiente
13. Recuperare il surnatante in tubi eppendorf puliti. 14. Ripetere i passi 11, 12 e 13.
15. Addizionare un volume di isopropanolo 100%, centrifugare 10 minuti a 13000 rpm a 4°C.
16. Eliminare il surnatante e addizionare 500 µl di etanolo 70%. 17. Centrifugare 5 minuti a 13000 rpm a 4°C.
18. Eliminare il surnatante e asciugare il pellet sotto vuoto nella speed vacuum per 3 minuti.
19. Se il DNA plasmidico serve solo per analisi con enzimi di restrizione,
risospendere il pellet in 30 µl di H2O demonizzata e conservare a -20°C Se il
DNA dovrà essere sequenziato, è necessario precedere ad un’ulteriore purificazione descritta nei passi successivi:
20. Addizionare 30 µl di H2O e 30 µl di PEG 8000 al 13% + NaCl 1,6 M e
miscelare pipettando su e giu.
21. Incubare in ghiaccio per 30 minuti e centrifugare 15 minuti a 13000 rpm a 4° in una centrifuga ad angolo fisso.
22. Eliminare il surnatante e addizionare 500 µl di Etanolo 70%. 23. Centrifugare 5 minuti a 13000 rpm a 4°C.
24. Eliminare il surnatante e asciugare il pellet sotto vuoto nella speed vacuum per 5 minuti.
25. Addizionare 20 µl di H2O demonizzata e conservare a –20°C.
Soluzione 1 (risospenzione) Soluzione 2 (lisi) Soluzione 3 . (precipitazione DNA) Glucosio 50 mM NaOH 0,2 N Potassio acetato 3 M Tris pH 8 25mM SDS 1% pH 4,8
EDTA pH8 10mM va preparata di fresco. Lisozima (facoltativo)
4.4. Preparazione delle cellule competenti di R. tumefaciens e trasformazione via elettroporazione. (Mozo e Hooykaas, 1992; Mersereau et.al, 1990)
Crescita :
1. Inoculare l’agrobatterio in 100 ml di YEB o AB con Streptomicina 500 mg/l e Rifamicina 150 mg/l.
2. Ottenere una densità di crescita di OD660 = 0,4 – 0,6. 3. Centrifugare rpm.
4. Lavare il pellet in 2 volte con HEPES 1mM, pH = 7.0 e glicerolo al 10% (vv) centrifugando a 4°C
5. Lavare il pellet 1 volta con glicerolo al 10% nelle stesse condizioni che nel punto 4.
6. Risospendere il pellet in 500 µl di glicerolo al 10% a 4°C (densità cellulare di 1-6 x 1011 batteri/ml)
7. Divedere in aliquote di 45 µl e conservare a –80°C Trasformazione :
1. Utilizzare una aliquota a cui aggiungere 200 ng di plasmide contenente l’inserto
2. Trasferire la sospensione ben miscelata in cuvette da 0,2 cm pre-raffreddate in ghiaccio.
3. Elettroporare alla seguenti condizioni : a. 400 ?
b. 2,5 KV c. 25 µF
4. Aggiungere immediatamente 1 ml di SOC senza selettivo. (mezzo fornito con il kit)
5. Mettere a crescere in tubi per circa 2 ore.
8. Piastrare su terreno solido contente Streptomicina 500 mg/l e Rifampicina 150 mg/l e Kanamicina (o altro selettivo in funzione del vettore).
6. Mettere a crescere a 28°C. Le colonie saranno visibili dopo 2 – 3 giorni.
4.5. MiniPrep da R. tumefaciens
Questo protocollo si basa sulla lisi alcalina delle cellule. Verrà co-purificato una quantità del plasmide Ti “Helper”, sufficentamente bassa da non interferire con la maggior parte degli analisi del vettore binario.
1. Mettere a crescere le cellule di Agrobatterio una notte in agitazione a 28°C in 1ml YEB contenente antibiotici.
2. Trasferire la coltura in eppendorf da 1,5 ml. Centrifugare 30 secondi.
3. Togliere il supernatante e risospenedere le cellule in 0,1 ml della soluzione 1 fredda.
4. Incubare 10 minute a temperatura ambiente. 5. Aggiungere 0,2 ml della soluzione 2.
6. Incubare 10 minute a temperatura ambiente.
7. Aggiungere 30 µl di fenolo equilibrato con 2 volumi della soluzione II. Agitare qualche secondo su vortex. La soluzione dovrebbe diventare molto viscosa. 8. Aggiungere 150 µl di sodio acetato 3 M, pH 4,8. Agitare a mano.
9. Incubare a 15 minuti a –20°C.
10. Centrifugare 3 minuti e versare velocemente il supernatante in un eppendorf pulito.
11. Riempire il tubo con etanolo 95% freddo e agitare bene per inversione. Incubare 15 minuti a –80°C.
12. Centrifugare 3 minuti. Togliere il supernatante per bene.
13. Aggiungere 1 ml di etanolo 70%. Agitare pochi secondi su vortex e centrifugare 1 minuto. Togliere il supernatante per bene.
14. Asciugare il pellet nel Speed Vacuum.
15. Risospendere il pelle in 50 µl di TE e conservarea a –20°C.
16. Per visualizzare il DNA, prelevare un’aliquota di 5 µl, aggiungere 5 µl di Buffer 2 x, 1 µl di RNasi (1 µg / ml) e 2 – 10 unità di un’enzima di restrizione a scelta. Incubare 1 ora e fare correre il campione su un gel di Agarosio. Soluzioni 1 : Soluzione 2 : TE :
4 mg /ml lisozima 1% SDS 1 mM EDTA
50 mM glucosio 0,2 N NaOH 10 mM Tris-HCl pH 8 10 mM EDTA
4.6. Estrazione del DNA genomica da piante (P. Peterson):
1. Triturare circa 300 mg di tessuto in un eppendorf pulito. 2. Aggiungere 600 µl di buffer d’estrazione.
3. Miscelare 1 – 2 minuti su vortex.
4. Centrifugare 5 minuti a 13000 rpm a 4°C. 5. Eliminare il surnatante.
6. Risospendere il pellet in 300 µl di Buffer d’estrazione + 300 µl di buffer di lisi dei nuclei + 120 µl sarcosil 5%.
7. Miscelare bene ed incubare 30 minuti a 65°C rimescolando di tanto in tanto. 8. Aggiungere 600 µl di cloroformio e miscelare.
9. Centrifugare 5 minuti a 13000 rpm a 4°C.
10. Prelevare la fase superione e trasferire in un eppendorf pulito. 11. Aggiungere 1 volume di isopropanolo.
12. Miscelare per inversione.
13. Centrifugare 5 minute a 13000 rpm a 4°C. 14. Lavare il pellet con 500 µl di etanolo al 70%.
15. Scartare il surnatante e asciugare il pellet in SpeedVac. 16. Risospendere in 30 µl di TE + Rnasi (100 ng / ml). Buffer d’estrazione, preparazione per un litro :
0,35 M sorbitolo (63,7 g) 0,1 M Tris (12,1 g)
0,005 M EDTA bisodico (1,86 g)
pH 7,5 (se si utilizza Tris HCl già portato a pH 7,5 non sarà necessario effetturare la successiva correzione del pH. Aggiungi a questo buffer immediatamente prima dell’uso Na bisolfito 0,02 M.
Buffer di lisi dei nuclei : 0,2 M Tris pH 7,5
0,05 M EDTA 2,0 M NaCl
2% peso/volume CTAB
4.7 Protocollo per la quantificazione delle proteine in un estratto vegetale usando il Kit DC Protein Assay, Bio-Rad.
1. Aggiungere 20 µl della soluzione S dal Kit ad ogni ml della soluzione A che servirà.
2. Preparare 3 – 5 diluizioni di una proteina standard.
3. Pipettare 100 µl dei standard in tubi puliti. Lo stesso per ogni campione. 4. Aggiungere 500 µl del reagente A ad ogni tubo.
5. Aggiungere 4 ml del reagente B ad ogni tubo e miscellare su vortex.
6. Attendere 15 minuti che si sviluppi il colore a leggere l’assorbimento con uno spettrofotometro ad una lunghezza d’onda di 750 nm.
4.8 Protocollo per WESTERN BLOT – Immobilon™-P Blotting Sanwiches. MILLIPORE
1. Dopo SDS-PAGE il gel va equilibrato in transfer buffer (TB + Etanolo al 20%) il tempo necessario per preparare la membrana (circa 10 minuti).
2. Tagliare la membrana PVDF 6,5 x 8,5 cm e segnarla in un angolo. 3. Tagliare dei cartoncini con le stesse dimensioni della membrana.
4. La membrana va tenuta 1-2 minuti in metanolo, in acqua per 5 minuti in agitazione e infine in TB + Etanolo al 20% per 10 minuti.
5. Assemblare l’apparato per il WESTERN con 2 cartoncini sotto e 2 sopra). Riempire la vaschetta con ghiaccio e acqua.
6. Eseguire il trasferimento a 25 Volts, 350-400 mA per 2 ore. 7. Lavare la membrana in TBS per 5 minuti due volte.
8. Immergere la membrana nella Blocking Solution (3% latte scremato in polvere in TBS) per 1 ora oppure tutta la notte. Questo passo è la pre-ibridazione. 9. Effettuare un lavaggio in acqua e 3 lavaggi di 10 minuti in TTBS (TBS + 0,1%
Twin 20).
10. Incubare la membrana con il primo anticorpo in TTBS + 3% latte scremato in polvere (1 : 5000) 10-14 µl per 1 ora.
11. Lavare la membrana brevamente in TTBS, poi lavare 3 volte per 10 minuti in TTBS.
12. Incubare la membrana con il secondo anticorpo 1 : 10000 (5-8 µl in 50 ml) in TTBS + 3% latte scremato in polvere per 1 ora.
13. Ripetere il punto 9.
14. Sviluppo : aggiungere 2,5 – 3 ml di substrato sulla membrana al buio ed incubare 5 minuti.
4.9 Mezzo di coltura LB (Luria – bertani)
Preparazione 1 litro : 10 g NaCl
5 g Bacto™ Yeast Extract (B-D) 10 g Bacto™ tryptone (B-D)
15 g Difco™ Agar/Granulated (solo per terreno solido) (B-D) Autoclavare dopo preparazione
4.10 Mezzo di coltura SOC
Mezzo di coltura per E. coli principalmente usato per il recupero delle cellule competenti dopo trasformazione con un vettore di clonaggio. Questo mezzo di crescita ricco permette di migliorare la efficienza del clonaggio
2% (w/v) Tryptone (pancreatic digest of casein) 0.5% (w/v) Yeast extract
8.6 mM NaCl 2.5 mM KCl 20 mM MgSO4
20 mM Glucose
4.11. Terreno di coltura MS0 (Murashige & Skoog, modificato)
Preparazione per 1 litro :
4,3 g MS Medium Basal Salt Misture (Duchefa BIOCHEMIE) 0,4 mg Tiammina
100 mg Mio-Inositolo 30 g Saccarosio
8 g Plant Agar (Duchefa BIOCHEMIE) portare a pH : 5.8. Autoclavare dopo preparazione.
4.12. Terreno di coltura MSO ½ - identico a MSO ma con le concentrazioni degli ingredienti dimezzati:
Preparazione per 1 litro :
2,15 g MS Medium Basal Salt Misture (Duchefa BIOCHEMIE) 0,2 mg Tiammina
50 mg Mio-Inositolo 15 g Saccarosio
4 g Plant Agar (Duchefa BIOCHEMIE) portare a pH : 5.8.
Autoclavare dopo preparazione.
4.13. Terreno di coltura Regeneration Media (REG, terreno di rigenerazione -espianti fogliari di N. tabaccum)
Preparazione 1 litro :
4,4 g MS Medium Basal Salt Misture (Duchefa BIOCHEMIE) 0,4 mg Tiammina
100 mg Mio-Inositolo 0,1 mg NAA
1 mg BAP
30 g Saccarosio
8 g Plant Agar (Duchefa BIOCHEMIE) portare a pH : 5.6.
4.14. Mezzo di coltura AB (Acid Broth) Preparazione 1 litro : 100 ml Sali AB 10 x 25 ml Glucosio 20 % 1,2 ml MgSO4 1 M. 2,0 ml CaCl2 50 mM
1 ml FeSO4•7H2O 2,5 mg / ml. Preparata fresca ogni volta e sterilizzata con
filtrazione.
Preparazione Sali AB 10 x per 1 litro : 30 g K2HPO4
10 g NaH2PO4
10 g NH4Cl
1,5 g KCl
